KROMATOGRAFI KERTAS

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

A.RAHMAT SALEH NUR

MISRA NANI

PROGRAM STUDI DIPLOMA IV

JURUSAN TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS
POLITEKNIK KESEHATAN KEMENKES MAKASSAR
2019
A. PENGERTIAN KROMATOGRAFI

Kromatografi berasal dari bahasa Yunani yaitu chromos yang berarti warna dan graphos
yang berarti menulis, Kromatografi adalah suatu teknik atau metode pemisahan kimia yang
didasarkan pada adanya perbedaan partisi zat pada fasa diam (stationary) dan fasa gerak
(mobile) atau dengan kata lain pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan
antara fase diam dan fase gerak untuk memisahkan komponen (molekul) pada larutan.
Kromatografi dikembangkan pertama kali oleh Michael Tsweet yang merupaka seorang ahli
botani Rusia pada tahun 1903. Michael Tsweet memisahkan pigmen berwarna dalam tanaman(
klorofil) dari pigmen-pigmen lain dalam tanaman dengan cara perkolasi ekstrak petroleum eter
dalam gelas yang berisi kalsium karbonat (CaCo3).
Saat ini teknik kromatografi sudah banyak dikembangkan dan merupakan teknik yang
paling umum dan sering digunakan dalam proses analisa baik secara kualitatif maupun
kuantitatif.

Dalam Kromatografi , dikenal beberapa istilah, antara lain:

1. Analit.
Analit adalah sat yang akan dipisahkan
2. Kromatogram
Kromatogram adalah hasil/output visual yang diperoleh dari hasil pemisahan.adanya puncak
karakteristik yang berbeda menunjukkan adanya senyawa yang berbeda
3. Eluen
Eluen adalah pelarut yang digunakan untuk memisahkan analit
4. Fasa gerak
Fasa gerak merupakan fasa zat yang bergerak pada arah tertentu
5. Fasa diam
Fasa diam adalah fasa yang tetap pada tempatnya
6. Waktu retensi
Waktu retensi adalah waktu yang diperlukan analit untuk melewatisistem
7. Volume retensi
Volume retensi adalah volume fasa gerak yang dibutuhkan untukmmengelusimkomponen
analit.
8. Adsorbsi
Menyerapan pada permukaan
9. Partisi
Penyebaran atau kemampuan suatu zat dalam larutan untuk berpisah kedalam pelarut yang
digunakan.
Dalam kromatografi , ada 3 penggolongan kromatografi yaitu:
1. Kromatografi berdasarkan prinsip atau mekanisme pemisahannya:
a. Kromatografi adsorpsi
Absorpsi yang penyerapannya pada permukaannya saja(berbeda dengan proses absorbpsi
yang berarti penyerapan secara keseluruhan ). Kromatografi jenis ini menggunakan fase
diam beripa zat padat dan fase gerak berupa zat cair atau gas.
b. Kromatografi partisi
Kromatografi ini didasarkan pada partisi pelarut yaitu dua pelarut yang tidak bercampur
antara fase dian dan fase gerak
c. Kromatografi penukar ion
Cara ini didasarkan pada pertukaran (penyerapan) ion antara fase diam dan fase gerak dan
titik-titik ion pada kemasan.
 d. Kromatografi eksklusi
Pemisahan pada teknik ini didasarkan pada ukuran molekul dari sat padat(fase diam)
yang merupakan suatu gel dengan permukaan berlubang-lubang sangat kecil yang inert
dan fase geraknya yaitu berupa cairan.
e. Kromarografi afinitas
Biasa juga disebut HPLC (Hight Performance Liquit Chromatography) merupan teknik
pemisahan dan pemurnian senyawa tertentu seperti as,amino,as.nukleat dan protein serta
cairan fisiologis untuk menentukan senyawa aktif obat dan produk hasil samping prose
sintesis.

Pada metode kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis perlu diperhatikan tentang factor
retrdasi.Faktot retardasi adalah parameter karakteristik pada kromatografi kertas dan
kromatografi lapis tipis.Harga Rf merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu komponen pada
kromatogram dan pada kondisi tetap merupakan besaran karakteristik dan reproduksibel.Rf
didefenisikan sebagai perbandingan jarak yang ditempuh komponen terhadap jarak yang
ditempuh pelarut(fase bergerak).
Faktor-faktor yang mempengaruhi harga RF antara lain:
1. Pelarut
Mengingat pentingnya koefisien partisi maka perubahan yang sangat kecil dalam pelarut
menyebabkan perubahan harga Rf
2. Suhu
Perubahan suhu mengubah koefisien partisi dan kecepatan aliran
3. Ukuran bejana
Mempengaruhi homogenitas dari atmosfer sehingga berpengaruh pada kecepatan penguapan
dan komponen-komponen pelarut.
4. Kertas
Mempengaruhi keseimbangan partisi.Pengaruh utama kertas pada harga Rf muncul dari
perubahan ion dan serapan.
Cara menghitung harga Rf

Rf = Jarak yang ditempuh senyawa/komponen

Jarak yan ditempuh pelarut

5. Sifat dan campuran

Berbagai senyawa mengalami partisi diantara volume yang sama dari fase diam dan fase
gerak.Sifat dari campuran mempengaruhi karakteristik dari kelarutan satu terhadap yang
lainnya sehingga mempengaruhi harga Rf.
Berikutnya akan dibahas mengenai Kromatografi adsorpsi yakni kromatografi kertas dan
kromatografi lapis tipis.
1. KROMATOGRAFI KERTAS
Pada kromatografi kertas penyerap yang digunakan merupakan sehelai kertas dengan
susunan serabut dan tebal yang sesuai ( kertas saring) sebagai fase diam dan fase gerak
adalah pelarut atau zat cair yang sesuai, seperti aquades dan alcohol.Kertas merupakan
selulosa murni yang mempunyai afinitas besar terhadap air atau pelarut polar lainnya .
Apabila air(pelarut) diabsorpsikan pada kertas maka akan membentuk lapisa tipis yang dapat
dianggap analog dengan kolom.
Kromatogram dilakukan dengan merambatkan fase gerak melalui kertas,dapat
dilakukan kromatografi naik yaitu pelarut merambat naik pada kertas karna ditarik oleh gaya
 kapiler atau kromatogafi menurun yaitu pelarut merambat turun karena ditarik oleh gaya
gravitasi.
Kromatografi kertas bisa dipakai dalam menganalisa senyawa-senyawa kimia yang
terkandung dalam bahan lainnya. Keuntungan utama dari metode ini adalah prosesnya yang
mudah dan sederhana karena dalam pelaksanaan pemisahannya hanya pada lembaran kertas
saring yang berlaku sebagai media pemisahan dan juga penyangga, selain itu keterulangan
bilangan Rf(Faktor Retardasi) yang besar pada kertas memungkinkan bilangan Rf dapat
menjadi parameter yang berharga.
Pada Kromatografi kertas jika setetes cuplikan diteteskan pada sepotong kertas saring
maka akan meluas dan membentuk noda bulat.Kertas saring dimasukkan kedalam bejana
tertutup yang berisi pelarut, maka pelarut akan bergerak melalui serat-seratkertas saring.Bila
daerah dari noda yang terpisah telah dideteksi,maka perlu mengidentifikasi zat dari senyawa.
Hasil analisis Pemisahan dianalisis berdasarkan harga atau nilai Rf pada masing-masing
noda,bercak atau spot yang dihasilkan pada pelarut yang sama.Apabila terdapat jarak noda
yang sama dengan sampel standar maka sampel yang dianalisis sama dengan sampel
standar.Penghitungan nilai Rf dilakukan dengan cara membagi jarak yang ditempuh zar
terlarut dengan jarak yang ditempuh pelarut.
Prinsip kerja kromatografi kertas :
Absorbsi dan kepolaran , dimana absorbs didasarkan pada panjang komponen dalam
campuran yang diabsorbsi pada permukaan fase diam dan kepolaran komponen berpengaruh
karena komponen akan larut dan terbawah oleh pelarut jika memiliki kepolaran yang sama serta
kecepatan migrasi pada fase diam dan fase bergerak.

Mekanisme :
a. Cuplikan yang mengandung campuran yang akan dipisahkan diteteskan pada daerah yang
diberi tanda diatas sepotong kertas saring, dimana ia akan meluasdan membentuk noda yang
bulat.Bila kertas telah kering maka dimasukkan kedalam bejana tertutup yang sesuai dengan
satu ujung dimana tetesan cuplikan ditempatkan tercelup dalam pelarut(jangan sampai noda
tercelup karena senyawa yang akan dipisahkan akan terlarut dari kertas)
b. Pelarut bergerak memalui serat dari kertasoleh gaya kapiler dan menggerakkan komponen
dari campuran cuplikan pada perbedaan jarak dalam arah aliran pelarut.Bila permukaan
pelarut telah bergerak sampai jarak yang cukup jauh atau setelah waktu yang ditentukan,
kertas diambil dari bejana dan kedudukan dari permukaan pelarut diberi tanda dan kertas
dibiarkan kering.Jika senyawa berwarna maka akan terlihat sebagai pita atau noda yang
terpisah.Jika senyawa tidak berwarna maka akan dideteksi dengan menggunakan suatu
pereaksi untuk memberikan sebuah warna terhadap beberapa atau semua senyawa
tersebut.Bila daerah dari noda tersebut telah dideteksi maka diidentifikasi dari senyawa.
Metode identifikasi yang paling mudah adalah dengan menggunakan harga Rf.
Cara kerja kromatografi kertas:
1. Ektraksi sampel dengan pelarut yang sesuai sehingga didapat zat yang akan dianalisa
2. Siapkan chamber
3. Siapkan kertas kromarografi dengan cara diberi garis 2 cm dr atas bawah dan 10-12 cm dari
bagian bawah
4. Masukkan eluen dan sedikit air serta kertas kromatografi
5. Tutup bejana selama 2-3 jam sampai terjadi kesetimbngan
6. Tambahkan eluen sampai kira-kira kertas dapat tercelup
7. Totolkan sampel pada kertas bagian bawah menggunakan pipa kapiler untuk kromatografi
8. Gantung kertas pada chamber dengan posisi bagian bawah terendam pada eluen , elusi
sampai mencapai garis batas atas
9. Keringkan kertas dengan cara diangin-anginkan, hindari dari panas berlebih
10. Setelah timbul bercak tentukan titik tengah bercak
11. Hitung harga Rf

Gambar I. Kromatografi Kertas

Fungsi kromatografi kertas :
Sebagai metode analitik untuk memisahkan zat atau bahan kimia yang berwarna.
Hal-hal yang perlu diperhatikan :
a. Jenis kertas
- Kertas selulosa murni , kertas ini khusus untuk kromatografi, misalnya kertas whafman no
1 dan 3
- Kertas selulosa yang sudah dimodifikasi dengan zat kimia misalnya kertas diasetil untuk
pemisahan steroid dan kertas yang diimpregnase contohnya impregnase dengan minyak
untuk pemisahan amina.
b. Pemurnian fase gerak
fase gerak biasanya campuran dengan sifat netral,asam dan basa
b. Penotolan contoh
biasanya dengan pipet mikro,agar ukurannya kecil dilakukan pengeringan
d. Deteksi

2. KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

Kromatografi lapis tipis adalah metode analisia suatu campuran senyawa secara cepat
dan sederhana dengan menggunakan menggunakan lapis tipis atau penyerap yaitu absorben
yang melekat pada pelat iner , pelat iner adalah tempat melakatnya lapisan adsorben
misalnya kaca, aluminium atau pelat polyester dengan ukuran 20 x 20 cm dan 20 x 10 kedua
ukuran ini dianggap sebagai ukuran standar.cm dengan ketebalan lapisan 250 mikrometer.
Untuk 5ias5ng kualitatif maupun kuantitatif.
Pembuatan penyerap yaitu bahan penyerap dicampur dengan air sampai menjadi bubur
dengan perbandingan x gram penyerap dan 2x ml air, kemudian diaduk sampai rata dan
dituang ke atas plat.
Pada Kromatografi Lapis Tipis zat penyerap adalah Lapis tipis serbuk halus yang
dilapisi pada lempeng kaca,Plastik atau logam secara merata.Pemisahan yang tercapai
didasarkan pada adsorpsi dan partisi atau kombinasi dari kedua efek, tergantung dari jenis
penyangga, cara pembuatan dan jenis pelarut yang digunakan.Perkiraan identifikasi
diperoleh dengan pengamatan bercak yang 5ias5ng dan 5ias5n sama.Bercak dapat dikerok
 dari lempeng kemudian diekstraksi dengan pelarut yang sesuai dan diukur secara
spektrofotometri.
Cara kerjanya 6ias6n sama dengan kromatografi kertas, namun memiliki beberapa keunggulan :
1. Pemisahan berjalan relative lebih cepat
2. Sentitif. Walaupun konsentrasi zat uji kecil masih dapat di deteksi
3. Daya resolusi yang tinggi sehingga pemisahan lebih sempurna dan terlokalisir dengan baik.
Adapun adsorben yang umumnya digunakan antara lain alumina atau silica jel yang bersifat
asam digunakan untuk pemisahan komponen atau uji berdasarkan 6ias6ng atau partisi asam,
,tanah diatomeae yang bersifat netral digunakan sebagai penyangga pada kromatografi untuk
pemisahan komponen zat ujji berdasarkan partisi.
Prinsip kerja Kromatografi Lapis Tipis :
Memisahkan sampel berdasarkan perbedaan kepolaran antara sampel dengan pelarut yang
digunakan berdasarkan adsorpsi dan partisi.
Mekanisme KLT
a. Pada proses pemisahan terjadi hubungan kesetimbangan antarafase diam dan fase bergerak,
dimana ada interaksi antara permukaan fase diam dan gugus fungsi senyawa organic yang
akan diidentifikasi yang telah bereaksi dengan fase geraknya.Proses ini dipengaruhi oleh
kepolaran fase diam, kepolaran fase gerak dan kepolaran dan ukuran molekul.
b. Pada KLT eluen adalah fase gerak yang berperan penting pada proses elusi bagi larutan
umpan (feed) untuk melewati fasediam(adsorben). Interaksi eluen dan adsorben sangat
menentukan terjadinya pemisahan komponen sehingga pemisahan komponen ini
dipengaruhi olehlaju alir eluent dan jumlah umpan.Suatu pelarut yang bersifat larutan
relative polar dapat mengusir pelarut yang tidak polar dari ikatannya dengan alumina( silica
gel).Semakin dekat kepolaran antara senyawa dengan eluen maka senyawa akan semakin
terbawa oleh fase gerak tersebut. Hal ini berdasarkan prinsip “ like dissolved like”
Cara kerja KLT :
1. Sejumlah larutan yang mengandung logam diasamkan dengan asam asetat dengan pH 5
kemudian ditambahkan larutan dithizone dalam kloroform dengan volume yang sama
kemudian dikocok dalam corong pisah.lapisan kloroformnya dicuci dengan larutan asam
nitrat untuk menghilangkan kelebihan dithizonenya.
2. Totolkan sebanyak 10 ul ektrak kloroform diatas keeping KLT yang telah diaktifir.Sejauh 2
cmdari ujung bawah dan jarak antara titik totolan kira-kira 1,5 cm satu sama lainya.
3. Chamber kromatografi telah dijenuhkan dengan pelarut selama 2 jam.Penjenuhan dapat
dipercepat menggunakan kertas saring yang dimasukkan ke dalam chamber.
4. Masukkan 6ias6ng kromatografi yang telah ditotoli zat , biarkan selama beberapa menit
sehingga larutan mencapai kira-kira 20 cm dari bawah.Angkat dan keringkan
5. Hitung Rf tiap totolan dengan membagi jarak yang ditempuh oleh zat dengan jarak yang
ditempuh oleh pelarut. Kemudian bandingkan dengan Rf pembanding.
Fungsi KLT :
Sebagai metode analitik untuk memisahkan zat, bahan kimia atau senyawa yang tidak 6ias
dilakukan dengan metode kromatografi kertas, misalnya senyawa hidrofobik ( lipid dan
hidrokarbon).
 Gambar II. Kromatografi Lapis Tipis
Hal- yang mempengaruhi hasil :
1. Struktur kimia senyawa yang dipisahkan
2. Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya
Perbedaan penyerap memberikan perbedaan yang besar terhadap Rf
3. Tebal dan kerataan lapisan penyerap
Ketidak rataan penyerap menyebabkan aliran pelarut juga tidak rata
4. Pelarut/derajat kemurnian fase bergerak
Perbandingan pelarut yang dipakai harus diperhatikan
5. Jumlah cuplikan yang digunakan
Penetesan dengan jumlah yang berlebihan menyebabkan penyebaran noda terbentuk ekor
sehingga menyebabkan kesalahan pada penghitungan Rf
6. Suhu
Suhu yang berubah menyebabkan perubahan komposisi pelarut oleh penguapan atau
perubahan fase
7. Kesetimbangan
Jika tidak ada kesetimbangan permukaan pelarut cekung dan fase bergerak lebih cepat pada
bagian tepi.

Contoh alat yang dipergunakan dalam analisa pada laboratorum kesehatan yang
menggunakan metode kromatogafi adalah yakni imunokromatografi yaitu :
- Strip / Rapid tes HbSAg
- Strip /Rapid tes HCG
- Urine Strip
- Dll
Seiring perkembangan jaman , semakin maju pula teknologi seperti dibidang kesehatan,
salah satunya adalah alat diagnostic yang disebut strip ataupun rapid tes. Sebagaimana diketahui
tes ini digunakan untuk pemeriksaan atau screening medis awal.Dengan menggunakan alat ini
hasil akan diperoleh dalam waktu yang cepat.Metode ini telah dikembangkan oleh pabrikan
sehingga sesuai dengan penggunaan peralatan yang diproduksi oleh pabrikan dengan
memperhatikan kehandalan dan kemampuan metode tersebut untuk penggunaan dalam
pengujian sehari-hari yang bisa dilihat dari tingkat sensitivitas, akurasi dan presisi yang
dihasilkan oleh metode tersebut.
STRIP TES HCG
Prinsip :
Penambahan urine ke peralatan tes dan membiarkannya berjalan disepanjang absorban.Penanda
antibody yang menafsirkan warna melekat ke HCG pada daerah tes dan menghasilkan pita
berwarna merah ketika konsentrasi HCG sama dengan atau lebih dari 20mIU/ml, saat keadaan
tidak ada hormone HCG maka tidak akan terbentuk pita di daerah tes.Reaksi pencampuran
berlanjut disepanjang absorban melewati daerah tes dan control menghasilkan pita berwarna
merah yang menandakan bahwa reagen dan peralatan masih berfungsi dengan baik.
Mekanisme :
Urin yang diperiksa akan bergerak dari zona yang satu ke zona yang lain , dimulai dari zona
yang terdapat mobile anti HCGI , anti HCGI akan ikut terbawa oleh urin ke zona anti HCG2.
Disinilah penentuan positif atau negative suatu tes. Jika pada urin terdapat molekul terdapat
HCG maka molekul ini yang sebelumnya sudah berikatan dengan anti HCG1akan berikatan
dengan anti HCG2 sehingga akan terbentuk warna atau garis pada strip atau kaset pemeriksaan,
jika pada urin tidak terdapat molekul HCG maka anti HCG2 tidak akan terikat.Selanjutnya urin
bergerak ke zona anti-anti HCG.Pada zona ini baik urin yang mengandung molekul HCG atau
tidak akan membentuk warna karena anti-anti HCG berikatan dengan anti HCG1 yang ikut
terbawaholeh urin.Zona ini disebut control.
Cara penggunaan alat :
1. Siapkan peralatan dan bahan yang dibutuhkan
2. Keluarkan strip/rapid tes dari bungkusnya dan letakkan pada tempat dengan permukaan
yang rata
3. Celupkan strip pada sampel / teteskan sampel pada lubang sampel pada rapid tes
4. Cara mencelupkan strip tes yaitu dengan memegang strip tes secara vertical dengan panah
menghadap ke bawah,celupkan sampai batas garis yang telah ditentukan kurang lebih
selama 30 detik, angkat dan letakkan pada permukaan yang rata.
5. Baca hasi setelah kurang lebih 5 menit.
Interpretasi hasil :
- Negatif bila terlihat satu garis warna, yaitu hanya garis control
- Positif jika terlihat 2 garis warna yakni garis control dan tes
- Invalid jika:
* tidak terlihat garis warna sama sekali
* garis warna hanya terlihat pada garis tes tetapi tidak terlihat pada gari control
 Gambar III. Contoh Strip HCG Test
Pemeliharaan Alat :
1. Hal-hal yang harus dihindari
-mencelupkan urin melewati batas garis yang telah ditentukan
-menyimpan reagen/alat pada tempat lembab , basah atau temperature tinggi

2. Perawatan alat
- Menyimpan reagen/alat pada suhu yang sesuai
- Memperhatikan waktu kadaluarsa alat/reagen

DAFTAR PUSTAKA
Fessenden RJ dan J.S Fessenden., 2003, Dasar – dasar kimia organik. Jakarta, Erlangga
Gandjar, Ibnu Gholib dan Abdul Rohman., 2007, Kimia Farmasi Analisis, pustaka pelajar,
Yoyakarta
Gritter,R,J., 1991, Pengantar Kromatografi Edisi II, Institut Teknologi Bandung, Bandung
Soebagio., 2002, Kimia Analitik, Universitas Negeri Makassar Fakultas MIPA, Makassar