PRAKTIKUM PROTEIN

Protein merupakan makromolekul yang terbentuk dari asam amino yang tersusun dari
atom nitrogen, karbon, hidrogen dan oksigen. Beberapa jenis asam amino yang mengandung
sulfur (metionina, sistina dan sisteina) yang dihubungkan oleh ikatan peptida. Dalam
makhluk hidup, protein berperan sebagai pembentuk struktur sel dan beberapa jenis protein
memiliki peran fisologis.

Berdasarkan bentuk molekulnya, protein digolongkan menjadi protein globular

(albumin, globulin, dan hemoglobulin) dan protein serabut (keratin pada rambut dan fibroin
pada sutra). Berdasarkan tingkat kelarutannya dalam air, protein globular sangat mudah larut
dalam air, sedangkan protein keratin tidak larut dalam air. Berdasarkan bentuknya, protein
dibentuk oleh struktur – struktur berikut ini.

1. Struktur primer, dibentuk oleh ikatan peptida antar asam amino`

2. Struktur skunder, dibentuk oleh ikatan hidrogen intramolekular yang terjadi diantara
oksigen karbonil dan nitrogen amida pada kerangka peptida.
3. Struktur tersier, merupakan rangkaian molekular yang menggambarkan bentuk
keseluruhan dari protein. Jenis ikatan yang membentuk struktur tersier terdiri dari ikatan
hidrogen, ikatan ionik, ikatan disulfida, dan ikatan hidrofobik.
4. Struktur kuaterner, dibentuk oleh beberapa polipeptida yang berikatan satu sama lain tidak
secara kovalen.

Uji kualitatif dapat dilakukan untuk mengetahui keberadaan atau jenis protein dalam suatu
bahan, sedangkan uji kuantitatif dapat dilakukan untuk mengetahui jumlah kandungan
protein dalam suatu bahan.

A. Uji Kualitatif

I. UJI NINHIDRIN

Prinsip

Semua asam amino bereaksi dengan triketohidrindina hidrat (ninhidrin) untuk membentuk
aldehida yang lebih kecil, dengan membebaskan karbon dioksida, amonia, dan menghasilkan
warna biru violet (untuk prolina dan hidroksiprolina dihasilkan warna kuning). Senyawa –
senyawa amonium kuat, senyawa amina, sebagian besar peptida, dan protein bereaksi dengan
jalur yang sama, walaupun tidak menghasilkan karbon dioksida dan amonia.

Cara membuat larutan ninhidrin

Sebanyak 0,1 g ninhidrin dilarutkan dalam 100 mL aquades.

Metode

Larutan yang akan diuji (albumin, kasein, dan pepton) 0,2% diatur pH-nya hingga mendekati
7 dengan menambahkan larutan alkali. Sebanyak 2 mL larutan albumin dimasukkan dalam
tabung reaksi, ditambahkan dengan beberapa tetes larutan ninhidrin 0,1%, kemudian
dipanaskan dalam penangas air mendidih selama 10 menit. Warna biru violet yang terbentuk
menunjukkan hasil positif adanya asam amino bebas.

II. Uji Biuret

Prinsip

Uji ini baik untuk digunakan untuk uji umum terhadap protein, karena uji ini dapat
mendeteksi kehadiran ikatan peptida. Uji Biuret didasarkan pada reaksi antara ion Cu 2+ dan
ikatan peptida dalam suasana basa. Warna kompleks ungu menunjukkan adanya protein.
Intensitas warna yang dihasilkan merupakan ukuran jumlah ikatan peptida yang ada dalam
protein. Ion Cu2+ dari pereaksi Biuret dalam suasana basa akan bereaksi dengan polipeptida
atau ikatan-ikatan peptida yang menyusun protein, dan membentuk senyawa kompleks
berwarna ungu atau violet. Reaksi ini positif terhadap duah buah ikatan peptida atau lebih,
tetapi negatif untuk asam amino bebas atau satu ikatan peptida. Protein melarutkan
hidroksida tembaga untuk membentuk kompleks warna. Reaksi pembentukan warna ini dapat
terjadi pada senyawa yang mengandung dua gugus karbonil yang berikatan dengan nitrogen
atau atom karbon (misalnya senyawa biuret).

Metode

Sebanyak 2 mL larutan yang akan diuji (albumin, kasein, dan pepton) dicampurkan dengan 2
mL natrium hidroksida 10% kemudian ditambahkan 1 tetes larutan tembaga sulfat 0,1%.
Larutan kemudian dicampurkan dengan baik, dan jika warna merah muda atau ungu belum
terbentuk, perlu ditambahkan lagi 1-10 tetes tembaga sulfat 0,1% sampai terbentuk warna
merah muda atau ungu.

III. Uji Millon

Prinsip

Reaksi ini bergantung pada keberadaan turunan monohidroksi benzena, seperti tirosin dan
fenol. Reaksi ini tidak memberikan hasil yang memuaskan jika terdapat Cl- dan NH4+. Oleh
karena itu, reaksi ini tidak dapat digunakan dalam analisis urine. Reaksi ini tidak spesifik
untuk protein, karena bila ada gugus fenol pada senyawa uji, akan memberikan reaksi positif.

Cara membuat pereaksi Millon

Sebanyak 100 g Hg (merkuri) dilarutkan dalam 140 mL asam nitrat pekat (BJ = 1,42) dalam
cawan penguapan dilemari asam. Setelah itu, diencerkan dengan 2 kali volume aquades`

Metode

Sebanyak 2 mL larutan yang akan diuji (albumin, gelatin, dan kasein) masing-masing
dimasukkan dalam tabung rekasi, lalu ditambahkan 5-10 tetes pereaksi Millon, dan dicampur
dengan baik. Endapan putih kemudian akan terbentuk. Campuran lalu dipanaskan dengan
hati-hati sampai terlihat warna merah yang menunjukkan hasil positif terhadap uji Millon.

IV. Uji Xantoprotein

Prinsip

Reaksi ini menyebabkan nitrasi inti benzena dalam molekul protein. Tirosina, fenilalanina,
dan triptofan memberikan hasil positif terhadap reaksi ini, karena memiliki cincin aromatik
yang bereaksi dengan asam nitrat pekat bila dipanaskan membentuk warna kuning sampai
jingga.

Metode

Sebanyak 2 ml larutan yang akan diuji (albumin, kasein, dan gelatin 2% secara terpisah)
dicampur dengan 1 mL asam nitrat pekat secara hati-hati, kemudian endapan putih yang
terbentuk catat. Kemudian dipanaskan dengan hati-hati hingga terjadi perubahan warna
larutan menjadi kuning. Campuran didinginkan pada air kran, dan larutan natrium hidroksida
atau amonium hidroksida ditambhkan secara hati-hati. Warna kuning hingga jingga
menunjukkan hasil positif terhadap reaksi ini.

V. Uji Hopkins-Cole

Prinsip

Reaksi ini bergantung pada adanya triptofan dalam molekul protein. Triptofan akan
berkondensasi dengan macam-macan aldehida dengan adanya asam kuat, sehingga terbentuk
komplek warna.

Cara membuat peraksi Hopkin-Cole

Sebanyak 10 g bubuk magnesium dimasukkan kedalam erlenmeyer dan aquades di masukkan

sampai Mg terendam, lalu diaduk. Sebanyak 250 mL larutan asam oksalat jenuh dingin (25 g
asam oksalat dalam 250 mL aquades) ditambahkan. Reaksi terjadi sangat cepat dengan
dibebaskannya panas yang besar, sehingga labu harus didinginkan didalam air mengalir
selama penambahan asam. Kemudian, isi labu diaduk setelah penambahan asam dan disaring
untuk memisahkan magnesium oksalat yang tidak larut. Setelaah itu dicuci dengan sedikit
aquades yang dituangkan melalui filter, dan filtrat diasamkan dengan asam asetat
(ditambahkan 25 mL asam asetat glasial dan diencerkan dengan aquades menjadi 1 Liter).

Metode

Sebanyak 2 mL larutan uji (albumin, kasein, dan gelatin 2% secara terpisah) dicampur
dengan 2 mL pereaksi Hopkins-Cole dalam tabung rekasi. Kemudian, 2 mL asam sulfat pekat
dituangkan secara hati-hati melaui dinding tabung sehingga terbentuk suatu lapisan dibawah
larutan protein. Jangan dikocok, setelah beberapa menit akan terbentuk cincin violet pada
perbatasan kedua cairan yang menunjukkan reaksi positif adanya asam amino triptofan.
B.Uji Kuantitatif

1. Uji Bradford

Prinsip

Uji Bradford sangat cepat dan menggunakan jumlah yang sama dengan uji protein pada uji
Lowry. Uji ini cukup akurat dan sampel yang berada diluar jangkauan dapat diuji ulang
dalam beberapa menit. Karena itu uji ini direkomendasikan untuk penggunaan umum
terutama untuk penentuan kadar protein dari fraksi sel dan menentukan konsentrasi protein
untuk elektroforesis gel.

Uji Bradford berdasrkan pada pengamatan absorban maksimum untuk larutan

Commassie Brilliant Blue G-250 yang berkisar dari 465 nm ke 595 nm, ketika terjadi
pengikatan protein. Kedua interaksi bersifat hidrofobikdan menstabilkan ion bentuk anionik
pewarna yang menyebabkan perubahan warna terlihat. Uji ini konstan pada rentang
konsentrasi 10 kalilipat. Metode yang akan dijelaskan dibawah ini adalah untuk volume 100
µL sampai menggunakan 5 mL pereaksi warna. Uji Bradford sensitif terhadap sekitar 5 – 200
µg protein, bergantung pada kualitas pewarna. Dalam uji yang menggunakan 5 mL peraksi
warna, kisaran sensitif mendekati konsentrasi 5 – 100 µg protein. Untuk menentukan
absorban pada proses microassay, digunakan kuvet bervolume 1 mL.

Kelemahan uji Bradford adalah memiliki kurva linier pada rentang pendek biasanya
antara 2 - 120 µg/mL, sehingga perlu pengenceran sampel sebelum dianalisis. Selain itu,
reaksi juga terhambat jika didalam sampel ada detergen.

Cara membuat pereaksi Bradford

Sebanyak 100 mg Comassie Brilliant Blue G-250 dilarutkan dalam 50 mL etanol 95%, dan
ditambahkan 100mL 85% (w/v) asam fosfat. Setelah itu diencerkan sampai volumenyan
menjadi 1 L sampai warna melarut semua, dan disaring menggunakan kertas saring Whatman
No. 1. NaOH digunakan jika sampel susah larut dalam pereaksi warna. Pereaksi Bradford
harus berwarna cokelat muda jernih. Penyaringan mungkin harus diulang untuk memisahkan
komponen pereaksi yang berwarna biru.

Pereaksi Bradford bereaksi terutama dengan residu arginina, dan sedikit bereaksi dengan
histidina, lisina, tirosina, triptofan, dan residu fenilalanina. Uji ini kurang akurat terhadap
protein basa dan asam. Uji Bradford agak sensitif terhadap albumin, serum sapi, dua kali
lebih rata-rata protein umum. Imunoglobulin G merupakan protein standar pilihan.
Penambahan NaOH 1 M dilakukan untuk memungkinkan kelarutan protein membran dan
mengurangi valeasi protein dalam menghasilkan warna.

Metode
Spektrofotometer sebelum digunakan dipanaskan terlebih dahulu. Sampel diencerkan untuk
memperoleh konsentrasi antara 5-100 µg protein dalam volume 100 µL. Jika sampel sulit
dilarutkan, tambahkan NaOH 1 M volume yang sama untuk setiap sampel protein standar.
Protein standar (albumin atau gamma globulin) disiapkan dengan konsentrasi antara 5-100 µg
protein dalam volume 100 µL, kemudian kedalam masing-masing tabung sampel dan tabung
standar ditambahkan 5 mL pereaksi Bradford. Ditunggu 5 menit, lalu diukur absorban pada
panjang gelombang 595 nm.

Analisis

Bila standar yang digunakan hanya memiliki satu konsentrasi (misalnya 10 µg/mL), maka
perhitungan kadar protein sampel dilakukan dengan rumus

Ru

̶̶̶――― X Kadar protein standar

Rs

Ru : nilai absorban sampel

Rs : nilai absorban standar

Bila digunakan protein standar dengan beberapa konsentrasi, maka perhitungan kadar
protein dalam sampel dilakukan dengan membuat kurva standar nilai absorban terhadap
kadar protein. Kemudian kadar protein sampel diperoleh dengan menarik garis dari nilai
absorban sampel terhadap absorban standar.

2. Metode Kjeldahl
Metode Mikkro-Kjeldahl
Sebanyak 0,3 gram sampel kering dimasukkan dalam labu Kjehdahl. Selanjutnya
ditambahkan 3 gram campuran CuSO4 : Na2SO4 (1:8) dan tambahkan secara hati-hati dengan
5 mL asam sulfat pekat menggunakan pipet yang dilengkapi karet penghisap. Penambahan
asam sulfat pekat harus dilakukan di di lemari asam. Selanjutnya dilakukan destruksi dalam
lemari asam hingga cairan berwarna biru atau hijau jernih. Dinginkan labu kjeldahl dengan
air (suhu <250C), larutan yang telah jernih diencerkan dengan sedikit akuades. Selanjutnya
ditambahkan NaOH 40% sampai terbentuk larutan coklat. Kemudian sampel didestilasi
dengan rangkaian ke alat destilasi kjeldahl. Destilat ditangkap dengan asam borat 4% 5 mL
dalam erlenmeyer 100 mL yang telah ditambahkan 2 tetes indikator campuran metil merah
dan metil biru. Destilasi dihentikan hingga volume destilat ± 40 mL berubah warna. Distilat
yang diperoleh dititrasi dengan HCl 0,1 N yang telah distandarisasi. Dibuat blangko dengan
cara yang sama tanpa menggunakan sampel.

2.3 Penentuan Berat Molekul protein

Massa molekul relatif protein diketahui berdasarkan estimasi dengan elektroforesis
protein SDS-PAGE, dilakukan menurut metode Bollag et al. (1996). Estimasi massa molekul
relatif hasil elektroforesis ditentukan dengan membandingkan pita migrasi protein dengan
pita migrasi marker. Adapun tahapan elektroforesis adalah sebagai berikut.
a. Preparasi Gel SDS-PAGE
Seluruh perangkat elektroforesis dicuci dengan deterjen dan dibilas dengan aquades
untuk menghindari kontaminasi dengan protein lain. Lempengan kaca sandwich untuk
pembuatan gel dibersihkan dengan etanol dan dikeringkan. Setelah bersih dan kering, seluruh
perangkat pembuatan gel dirangkai sesuai petunjuk (Bio-Rad, 2007) untuk menentukan
volume dan ketebalan gel yang akan dibuat. Lempengan kaca pencetak gel diisi aquades
untuk memastikan agar tidak terjadi kebocoran. Air yang keluar diserap dengan kertas
penyerap.
 Gel Bawah SDS-PAGE 12 %
Komponen Volume total 10 mL
H2O 3.3
30 % akrilamida mix {29% (w/v) akrilamida dan 4.0
1% (w/v) N.N metylenebisakrilamida)
1.5 M Tris (pH 8) 2.5
10 % SDS 0.1
10% Amonium persulfat 0.1(0,2)
TEMED 0.004 (0.008)

Gel atas SDS-PAGE 5%

Komponen Volume total 1 mL
H2O 0.68
30 % akrilamida mix {29% (w/v) akrilamida dan 0.17
1% (w/v) N.N metylenebisakrilamida)
1.0 M Tris (pH 6.8) 0.13
10 % SDS 0.01
10% Amonium persulfat 0.01
TEMED 0.001

Aquades ditambahkan diatas gel bawah untuk mempercepat terjadinya polimerisasi

akrilamida. Apabila gel bawah telah memadat, aquades kemudian dibuang. Formulasi gel atas
selanjutnya diinjeksikan ke dalam pencetak gel dan segera dilakukan pemasangan sisir
cetakan (comb). Sisir cetakan dilepas apabila gel telah berpolimerisasi atau memadat pula.
Sumur yang terbentuk kemudian dibilas dengan aquades untuk menyingkirkan kelebihan
akrilamida yang tidak berpolimerisasi.
b. Preparasi Sampel SDS-PAGE
Sebanyak 40 µl sampel enzim yang telah ditambahkan buffer sampel (2 ml SDS
10%, 5 ml gliserol 50%, 0,5 ml β-merkaptoetanol, 1 ml BPB1%, dan 0,9 ml aquades
dicampurkan kedalam 0,6 ml Tris-HCl 1,0 M [pH 6,8]) sebagai campuran untuk SDS-PAGE
langsung dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit untuk mendenaturasi.
c. Running SDS-PAGE
Seluruh komponen perangkat elektroforesis dirangkai sesuai petunjuk dan dilakukan
pemeriksaan terhadap kebocoran pada kompartemen Kompartemen diisi larutan buffer
elektrode (running buffer; 25 mM Tris, 250 mM glisin dan 0.1% SDS/ stok 5x 15.1 gr Tris
Base, 94 gr glisin 50 mL 10% SDS, ditambahkan aquades hingga volume 1000 ml), hingga
memenuhi kompartemen upper dan lower. Sampel protein selanjutnya diinjeksikan ke dalam
masing-masing sumur yang terbentuk pada gel atas. Setelah semua dilakukan, kompartemen
ditutup dan elektrode yang terdapat pada buffer atas dan buffer bawah masing-masing
dihubungkan dengan kutub negatif (katoda) dan positif (anoda) power supply. Voltase yang
digunakan sebesar 40–100 V (konstan) dengan arus listrik 5,0 A. Elektroforesis berakhir
apabila warna biru tracking dye (BPB) telah mencapai sekitar 0,5 cm dari bagian bawah gel
bawah.
d. Staining dan Destaining SDS-PAGE
Setelah elektroforesis usai, gel diambil dari lempeng kaca pencetak gel dengan hati-
hati dan direndam dalam wadah berisi larutan pewarna (staining solution; 1 g CBB R250,
450 ml CH3OH, 100 ml CH3OOH, aquades hingga 100 ml). Wadah digojok perlahan pada
temperatur ruang hingga warna larutan pewarna dapat diikat oleh protein.
Protein yang tidak terikat pada larutan pewarna dicuci dengan larutan pelepas warna
(destaining solution; 100 ml CH3OH, 100 ml CH3OOH, aquades hingga 100 ml) hingga pita-
pita protein akan nampak jelas atau back ground menjadi berkurang selama beberapa kali
dengan mengganti larutan pelepas warna. Penggoyangan dilakukan untuk mempercepat
pelepasan larutan pewarna.