Enzim restriksi

Dari Wikipedia bahasa Indonesia, ensiklopedia bebas

Enzim restriksi atau endonuklease restriksi adalah enzim yang memotong molekul DNA.[1]
Enzim ini memotong DNA pada rangka gula-fosfat tanpa merusak basa.[1] Setiap enzim
mempunyai sekuens pengenalan yang unik pada utas DNA, biasanya sepanjang 4-6 pasang
basa.[2]

Daftar isi
 1 Sejarah
 2 Sekuens pengenal enzim restriksi
 3 Perkiraan Pemotongan
o 3.1 6-cutters
o 3.2 8-cutters
o 3.3 4-cutters
 4 Penamaan Enzim Restriksi
 5 Jenis-jenis enzim restriksi
o 5.1 Enzim restriksi tipe I
o 5.2 Enzim restriksi tipe II
o 5.3 Enzim restriksi tipe III
 6 Keadaan Restriksi
 7 Hasil Pemotongan Enzim Restriksi
o 7.1 Ujung menggantung 5’
o 7.2 Ujung menggantung 3’
o 7.3 Ujung tumpul
 8 Menghentikan Proses Digesti
 9 Contoh Enzim Restriksi
 10 Referensi

Sejarah
Pada akhir 1960-an, ilmuwan Stewart Linn dan Werner Arber mengisolasi dua contoh enzim
yang berperan dalam menghambat pertumbuhan bakteriofag yang menyerang E. coli.[3] Salah
satu enzim bekerja memetilasi DNA, sedangkan enzim yang satunya bekerja memotong DNA
yang tidak termetilasi pada beberapa lokasi di sepanjang molekul DNA.[3] Enzim yang pertama
disebut metilase (methylase), sedangkan enzim yang satunya disebut nuklease restriksi
(restriction nuclease).[3] Kemudian pada tahun 1968, H.O. Smith, K.W. Wilcox, dan T.J. Kelley,
yang bekerja di Johns Hopkins University, mengisolasi dan mengkarakterisasi enzim nuklease
restriksi pertama.[3] Enzim ini berasal dari bakteri Haemophilus influenzae, dan diberi nama
HindII.[3] Enzim ini selalu memotong molekul DNA pada sekuen spesifik dengan panjang situs
pengenalan enam pasang basa.[3]
Sekuens pengenal
enzim restriksi
Tabel 1 Contoh enzim restriksi beserta sekuen pengenalannya
Sekuen pengenalan atau sering Enzim Sekuen Pengenalan
disebut juga situs pengenalan GGATCC
BamHI
merupakan sekuen DNA yang CCTAGG
menjadi tempat menempelnya GCGGCCGC
enzim restriksi dan melakukan NotI
CGCCGGCG
pemotongan pada sekuen
GATC
tersebut.[4] Panjang sekuen Sau3AI
CTAG
pengenalan enzim restriksi
berbeda-beda, seperti enzim GAGCTC
SacI
EcoRI, SacI, dan SstI mempunyai CTCGAG
sekuen pengenalan sepanjang 6 GAGCTC
Sst I
pasang basa, sedangkan NotI 8 CTCGAG
pasang basa, dan Sau3AI hanya 4 GANTC
pasang basa.[4] Kebanyakan dari HinfI CTNAG
enzim restriksi bersifat PuGATCPy
palindromik (palindromic) yang XhoII PyCTAGPu
berarti sekuen pengenalan sama

jika dibaca dari 5’ 3’ baik utas atas maupun utas bawah.[4] Contohnya adalah HindIII dengan
situs pengenalan 5’-AAGCTT-3’ (utas atas)/3’-TTCGAA-5’ (utas bawah).[4]

Enzim restriksi yang berbeda, dapat mempunyai situs pengenalan yang sama, contohnya: SacI
dan SstI.[5] Ezim yang mempunyai situs pengenalan yang sama disebut dengan istilah
isoschizomers.[5] Dalam beberapa kasus, isoschizomers juga memotong DNA pada tempat yang
sama, namun beberapa tidak demikian.[5]

Situs pengenalan pada enzim restriksi dapat pasti atau ambigu.[5] Seperti contohnya pada BamHI,
enzim ini sudah pasti memotong pada sekuen GGATCC.[5] Sementara itu, situs pengenalan HinfI
adalah GANTC.[5] N dalam situs pemotongan HinfI berarti dapat diganti oleh basa apa saja,
inilah yang dimaksud dengan situs ambigu[5]. Contoh lainnya situs ambigu adalah XhoII.[5]
Enzim ini mempunyai situs pemotongan PuGATCPy.[5] Pu merupakan singkatan dari purin (basa
A atau G), sedangkan Py merupakan singkatan dari pirimidin (pyrimidine) (basa T atau C).[5]
Jadi XhoII dapat mengenali dan memotong sekuen AGATCT, AGATCC, GGATCT dan
GGATCC.[5]

Situs pengenalan satu enzim, dapat mengandung situs pengenalan enzim lainnya[5] Situs
pengenalan BamHI mengandung situs pengenalan Sau3AI.[5] Oleh karena itu, semua sekuen
pemotongan BamHI akan dipotong oleh Sau3AI, tetapi tidak sebaliknya.[5]

Perkiraan Pemotongan
Panjang dari sekuen pengenalan memengaruhi seringnya enzim restriksi memotong DNA dalam
ukuran tertentu.[6] Misalnya pada enzim yang memiliki panjang 4 basa, enzim ini diperkirakan
akan memotong setiap 256 nukleotida.[6] Perhitungan tersebut diperoleh dengan mengasumsikan
setiap basa mempunyai kemungkinan yang sama untuk muncul, yaitu sebesar 1/4 (kemungkinan
muncul 1 dari 4 basa).[6] Jadi jika sekuen pengenalan mempunyai panjang 6 basa, maka
perhitungannya menjadi: (1/4)6 = 1/4096.[6] Perhitungan ini hanya sebagai perkiraan, pada
kenyataannya belum tentu demikian.[6] Beberapa sekuen bisa jadi lebih sering atau lebih jarang
ditemui dalam suatu organisme.[6] Seperti pada mamalia, sekuen CG sangat jarang ditemui
sehingga enzim HpaII yang mempunyai sekuen pengenalan CCGG akan lebih jarang memotong
pada DNA mamalia.[6]

Enzim restriksi yang mempunyai sekuen pengenalan yang pendek akan menghasilkan banyak
potongan DNA; sedangkan jika mempunyai sekuen pengenalan yang panjang, akan dihasilkan
potongan DNA yang lebih sedikit.[6] Baik enzim yang mempunyai sekuen pemotongan pendek
maupun panjang, mempunyai fungsi masing-masing dalam rekayasa genetika.[6]

Beberapa enzim sering yang digunakan dalam laboratorium dibagi menjadi tiga berdasarkan
perkiraan pemotongan:[6]

6-cutters

Ezim restriksi yang tergolong dalam 6-cutters memiliki situs pemotongan yang spesifik pada 6
nukleotida.[6] Ezim ini cocok digunakan untuk pekerjaan kloning sehari-hari karena enzim ini
lumayan sering memotong satu atau dua situs pada plasmid, namun jarang memotong bagian
penting seperti titik asal replikasi (origin of replication) atau gen resisten ampisilin.[6] Contoh

enzim 6-cutters adalah HindIII (A AGCTT) yang memotong genome bakteriofage lambda
(48 kbp) pada 7 situs.[6]

8-cutters

Enzim restriksi ini mempunyai situs pengenalan sepanjang 8 nukleotida; cocok digunakan untuk
membentuk kromosom menjadi potongan-potongan yang spesifik dalam ukuran yang besar.[6]
Sebagai contoh: PacI (enzim 8-cutters) memotong-motong kromosom E. coli menjadi 20 bagian,
sedangkan BamHI (enzim 6-cutters) memotong sekitar 300 bagian.[6] Jika langsung
menggunakan enzim 6-cutters, maka fragmen yang dihasilkan terlalu kecil dan banyak.[6] Untuk
itu digunakan enzim 8-cutters terlebih dahulu, kemudian dilanjutkan dengan menggunakan
enzim 6-cutters.[6]

4-cutters

Enzim restriksi ini cocok untuk percobaan yang menginginkan pemotongan pada beberapa situs
yang potensial.[6] Contohnya: jika ingin mengumpulkan fragmen DNA secara acak, dan pada
potongan tersebut terdapat gen yang diinginkan; dapat dilakukan digestsi parsial (partial
digestion) menggunakan enzim 4-cutters.[6]
Penamaan Enzim Restriksi
Pada dasarnya, penamaan enzim restriksi diambil dari nama bakteri yang menghasilkan enzim
tersebut. Seperti contohnya enzim EcoRI yang memiliki pola:[1]

Kependekan Kepanjangan Deskripsi

E Escherichia genus
co coli species
R RY13 strain
I Urutan penemuan Urutan enzim yang ditemukan pada bakteri

Jenis-jenis enzim restriksi

Enzim restriksi secara tradisional dibagi menjadi 3 tipe berdasarkan komposisi subunit, posisi
pemotongan, spesifisitas sekuens dan kofaktor yang diperlukan:[7]

Enzim restriksi tipe I

Enzim restriksi ini kompleks dengan multisubunit, memotong DNA secara acak dan jauh dari
sekuens pengenalannya.[7] Pada awalnya enzim ini dikira langka; tetapi setelah analisis sekuens
genom, enzim ini ternyata umum.[7] Enzim restriksi tipe I ini memiliki pengaruh besar dalam
biokimia, namun mempunyai nilai ekonomis yang rendah karena tidak dapat menghasilkan
potongan fragmen DNA yang diinginkan sehingga tidak diproduksi.[7]

Enzim restriksi tipe II

Enzim ini memotong DNA dekat atau pada situs pengenalan.[7] Enzim ini menghasilkan
fragmen-fragmen sesuai dengan yang diinginkan sehingga biasa digunakan untuk analisis DNA
dan kloning gen.[7] Enzim tipe II yang umum digunakan adalah HhaI, HindIII, EcoRI, dan NotI;
dan enzim-enzim tersebut tersedia secara komersil.[7] Enzim ini tergolong kecil dengan subunit
yang memiliki 200-350 asam amino dan memerlukan Mg2+ sebagi kofaktor.[7] Selanjutnya enzim
jenis tipe II yang umum, biasanya digolongkan sebagai tipe IIs, adalah FokI dan AlwI.[8] Enzim
ini memotong di luar situs pengenalan, berukuran sedang, 400-650 asam amino, dan memiliki 2
domain khusus.[8] Domain pertama untuk berikatan dengan DNA, sedangkan domain yang
satunya untuk memotong DNA.[8]

Enzim restriksi tipe III

Enzim restriksi tipe II ini merupakan enzim restriksi yang tidak digunakan dalam laboratorium.[8]
Hal ini dikarenakan enzim ini memotong di luar situs pengenalan dan membutuhkan dua sekuen
dengan orientasi berlawanan pada DNA yang sama untuk menyelesaikan pemotongan sehingga
enzim ini jarang menghasilkan potongan sempurna.[8]
Keadaan Restriksi
Enzim restriksi pada umumnya bekerja pada pH 7,4; suhu 37 °C; dan memerlukan bermacam-
macam kekuatan ionik, tergantung dari jenis enzimnya.[8] Akan tetapi, beberapa enzim
memerlukan optimasi khusus agar proses restriksi berjalan dengan baik.[8] Dalam larutan stok,
enzim restriksi biasanya dikemas bersama dengan 10X larutan penyangga reaksi yang telah
dioptimasi.[8] Buffer reaksi dapat digolongkan menjadi empat jenis berdasarkan kekuatan ionik-
nya:[8]

1. 0 mM NaCl = low salt buffer (L)

2. 50 mM NaCl = medium salt buffer (M)
3. 100 mM NaCl = hi salt buffer (H)
4. 150 mM NaCl = very high salt buffer (VH)

Ketika melakukan digesti dengan 2 atau lebih enzim restriksi yang berbeda buffer reaksinya,
perlu dilihat rujukan tabel aktivitas enzim tersebut pada buffer reaksi tertentu.[8] Misalnya: reaksi
digesti dilakukan dengan menggunakan EcoRI (garam tinggi) dan HpaII (garam rendah, KCl).[8]
Setelah dilihat pada tabel, kedua enzim aktif pada keadaan garam sedang.[8] Oleh karena itu,
digunakan buffer reaksi dengan konsentrasi KCl sedang.[8] Buffer reaksi yang digunakan adalah
KCl karena HpaII memerlukan KCl, bukan NaCl; sedangkan EcoRI dapat menggunakan kedua
garam tersebut.[8] Kondisi optimal ketika melakukan proses digesti sangat penting.[8] Karena jika
kondisi optimal tidak tercapai, enzim akan memotong secara tidak normal.[8] Contohnya: EcoRI
pada buffer reaksi dengan konsentrasi garam rendah tidak hanya memotong pada situs

pengenalan normal G AAATTC, namun akan juga memotong situs pengenalan AATT.
Aktifitas seperti ini dinamakan star activity.[8]

Hasil Pemotongan Enzim Restriksi

Enzim restriksi yang biasa digunakan dalam laboratorium biologi molekuler memotong molekul
DNA pada situs pengenalan dan menghasilkan salah satu dari ketiga jenis pola hasil
pemotongan.[5] Ketiga pola hasil pemotongan enzim restriksi sebagai berikut:[5]

Ujung menggantung 5’

Enzim restriksi memotong secara asimetris pada situs pemotongan, menghasilkan hasil
pemotongan memanjang pada ujung 5’.[5] Contoh enzim yang menghasilkan ujung menggantung
5’ adalah BamHI
Ujung menggantung 3’

Enzim restriksi ini juga memotong secara asimetris pada situs pengenalan, namun menghasilkan
hasil pemotongan memanjang pada ujung 3’.[5] Contoh enzim yang menghasilkan pola seperti ini
adalah KpnI

Ujung tumpul

Enzim ini memotong secara simetris antara kedua utas DNA sehingga menghasilkan ujung
tumpul.[5] Contoh enzim yang menghasilkan pola seperti ini adalah SmaI
Pola ujung menggantung, baik yang 3’ ataupun 5’, sering disebut juga dengan ujung lengket
(sticky ends) atau ujung kohesif (cohesive ends).[5] Pola seperti ini lebih mudah menempel
(annealing) dengan pasangan DNA nya karena adanya ikatan basa antara ujung-ujung yang
menggantung.[5]

Menghentikan Proses Digesti

Setelah proses inkubasi selesai, reaksi digesti enzim dapat dihentikan dengan menambahkan
EDTA.[8] Penambahan EDTA akan mengkelat ion logam; dalam reaksi ini ion logam yang
dikelat adalah Mg2+.[8] Untuk beberapa tipe enzim lainnya, inaktivasi dapat dihentikan dengan
cara pemanasan; menggunakan pendenaturasi protein, contohnya fenol atau kloroform; atau
memisahkan enzim dari DNA menggunakan kolom kromatografi.[8]

Contoh Enzim Restriksi

Enzim restriksi yang umum digunakan berasal dari tipe II, berikut contohnya:[9]

Subtype Contoh Situs Pengenalan

G AATTC
Orthodox EcoRI
CTTAA G

GAT ATC
EcoRV
CTA TAG

GCCNNNN NGGC
BglI
CGGN NNNNCCG
 GGATGN9 NNNN
Type IIS FokI
CCTACN9NNNN

GCG CGC
Type IIE NaeI
CGC GCG

G CCGGC
Type IIF NgoMIV
CGGCC G

CC TNAGC
Type IIT Bpu10I
GCANT CG

CCNNNNN NNGG
BslI
GGNN NNNNNCC

CTGAAGN14NN
Type IIG Eco57I
GACTTCN14 NN

NN N10CGATN6TGCN10NN
Type IIB BcgI
NNN10GCTN6ACGN10 NN

NN4 N8GAGN5CTCN8N4N
BplI
NN4N8CTCN5GAGN8 N4N

Gm^A TC
Type IIM DpnI
m^
CT AG

^nukleotida yang termetilasi

Referensi
1. ^ a b c http://www.bio-medicine.org/biology-
definition/Restriction_enzyme/#External_links
2. ^ Philips T. 2010. Restriction Enzymes Explained. [terhubung berkala].
http://biotech.about.com/od/proteinengineering/a/restrictenz.htm [3 Apr 2010].
3. ^ a b c d e f Peters P. 2010. Restriction Enzymes. [terhubung berkala].
http://www.accessexcellence.org/AE/AEC/CC/restriction.php [4 Apr 2010].
4. ^ a b c d Pray LA. 2008. Restriction Enzymes. [terhubung berkala].
http://www.nature.com/scitable/topicpage/Restriction-Enzymes-545 [7 Apr 2010].
5. ^ a b c d e f g h i j k l m n o p q r s t u Bowen RA, Austgen L, Rouge M. 2002. Biology and
Activity of Restriction Endonucleases. [terhubung berkala].
http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes/renzymes.html [5 Apr
2010].
6. ^ a b c d e f g h i j k l m n o p q r s Metzenberg S. 2002. Restriction Endonucleases. [terhubung
berkala]. http://escience.ws/b572/L5/L5.htm [12 Apr 2010].
7. ^ a b c d e f g h Sasnauskas G, Connolly BA, Halford SE, Siksnys V. 2007. Site-specific
DNA transesterification catalyzed by a restriction enzyme Proc Natl Acad Sci USA
104(7): 2115-20.
8. ^ a b c d e f g h i j k l m n o p q r s t Rinehart CA. 2005. Restriction enzymes and Ligases.
[terhubung berkala].
http://bioweb.wku.edu/courses/Biol350/RestrictionEnz3/Review.html [3 Apr 2010].
9. ^ Pingoud A, Jeltsch A. 2001. Structure and function of type II restriction endonucleases.
Nucleic Acids Res 29(18): 3705-27