Hibrida-Potong: Metode Sectioning yang Ditingkatkan untuk Sampel

Jaringan Tumbuhan yang Timpang

Tien-Kuan Chen, Hui-Ting Yang, Su-Chiung Fang, Yi-Chen Lien, Ting-Ting Yang, Swee Suak
Ko1 1Academia Sinica Biotechnology Center in Southern Taiwan; Agricultural Biotechnology
Research Center, Academia Sinica *These authors contributed equally
Journal of Visualized Experiments

1. Fiksasi dan Penanaman (Fixation and Embedding)

1. Persiapan reagen
1. 10x Phosphate-buffered saline (PBS)
 Tambahkan 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, dan 2,4 g KH2PO4 dalam 800 ml air
suling ganda (ddH2O) dan sesuaikan pH ke 7,4 dengan HCl . Tambahkan ddH2O ke
volume total 1 L, lalu tambahkan 1.000 μl dietil pirokarbonat (DEPC) dan kocok kuat-kuat.
Simpan PBS semalam pada suhu kamar dan autoklaf pada 121 ° C selama 20 menit pada
hari berikutnya.
2. 1x PBS
 Encerkan stok 10x PBS pada rasio 1:10 dalam ddH2O untuk mendapatkan konsentrasi
akhir 0,01 M Na2HPO4, 0,002 M KH2PO4, 0,003 M KCl, dan 0,13 M NaCl.
3. Fiksatif Paraformaldehyde (PFA)
Perhatian: Paraformaldehyde beracun. Siapkan di bawah tudung asap. Memakai sarung tangan.
 Untuk menyiapkan 250 ml fiksatif PFA, panaskan 100 ml 1x PBS hingga 70 - 80 ° C dan
tambahkan 1.750 μl NaOH. Kemudian tambahkan 10 g paraformaldehyde dan aduk hingga
larut. Tempatkan larutan di atas es dan kemudian sesuaikan pH menjadi 7,2 dengan H2SO4
(260 270 μl untuk 100 ml) setelah pendinginan.
 Sesuaikan volume hingga 250 ml dengan 1x PBS, tambahkan 625 μl glutaraldehyde ke
konsentrasi akhir 0,25%. Tambahkan 250 μl Triton X-100 dan 250 μl Tween 20 untuk
memfasilitasi infiltrasi fiksatif.
 CATATAN: Fiksatif PFA dapat disimpan pada suhu 4 ° C selama satu bulan tanpa
kehilangan kemampuan fiksasinya.
 Siapkan berbagai konsentrasi etanol (30%, 50%, 70%, 85%, dan 95%) dengan air yang
diolah DEPC.
2. Pengumpulan sampel tanaman
1. Tunas aksila
 Gunakan tanaman anggrek Phalaenopsis dewasa pada tahap empat daun. Angkat daun
dengan hati-hati dengan merobek daun mengikuti pelepah menggunakan tangan.
  Gunakan pisau bedah yang tajam untuk membuang tunas aksila dengan hati-hati dari
pangkal daun ketiga atau keempat pada batang monopodial.
2. Sampel benih
 Panen polong benih anggrek dewasa pada 4 bulan setelah penyerbukan. Potong polong biji
secara longitudinal dengan pisau bedah. potong biji pembuka dengan lembut dan lepaskan
biji kering di atas kertas saring.
3. Protocorm
 Taburkan benih anggrek dewasa di piring agar 1 / 2x Murashige dan Skoog, dan tumbuh
di ruang kultur jaringan dalam periode cahaya 12 jam dan suhu konstan 25 ° C. Sampel
protocorm hijau pada 7 minggu setelah tanam.
4. Sampel daun
 Kumpulkan jaringan daun dari tanaman anggrek Phalaenopsis dewasa .
 Gunakan pisau bedah yang tajam untuk memotong sepotong kecil jaringan daun (panjang
7 mm x lebar 5 mm) dari daun kedua yang baru dikembangkan.
5. Sampel akar
 Dengan menggunakan tanaman yang sama seperti yang dijelaskan pada langkah diatas ,
potong 1 cm jaringan ujung akar menggunakan pisau bedah yang tajam.
6. Spike muda
 Gunakan pisau bedah tajam untuk memotong jaringan spike muda dari bagian ujung
tangkai bunga dengan panjang 10 cm.
7. Kuncup bunga
 Potong kuncup bunga kecil berdiameter 5 mm dari tangkai bunga anggrek. Potong bagian
dari jaringan kuncup bunga secara longitudinal (dengan ketebalan 3 mm).
8. Jaringan daun dan jaringan spikelet dari tanaman sereal
 Potong 1 cm jaringan daun dari daun pertama yang baru dikembangkan dari tanaman padi,
gandum dan jagung.
 Kumpulkan 10 biji dari tanaman (beras, gandum, dan jagung) sehari sebelum bunga mekar.
3. Fiksasi
1. Sampel tanaman dipindahkan ke dalam botol kilau kaca yang mengandung 15 ml fiksatif PFA
dingin.
2. Gunakan vacum (~ 720 mm Hg) untuk menanam sampel di ruangan dingin 4 ° C. Pegang vacum
selama 15 - 20 menit (gelembung kecil harus dilepaskan dari sampel). Ulangi langkah ini
sampai sebagian besar jaringan tenggelam setelah pelepasan vacum . Tahan vacum dan
lepaskan vacum perlahan di hari berikutnya.

2
4. Dehidrasi
CATATAN: Gunakan botol yang sama dari fiksasi sampai tahap infiltrasi. Tuang atau gunakan pipet
untuk mengalirkan larutan pada langkah sebelumnya dan ganti dengan 15 ml larutan baru ke dalam
botol.
1. Setelah fiksasi, rendam sampel dalam 15 ml 1x PBS selama 10 menit
 Dehidrasi sampel dalam 15 ml etanol seri pada suhu kamar sebagai berikut: 30% etanol
selama 30 menit, 50% etanol selama 30 menit, 70% etanol selama 1 jam, 85% etanol
selama 54 menit untuk jaringan yang lebih keras dan 30 menit untuk yang lebih lembut
jaringan, 95% etanol selama 54 menit untuk jaringan yang lebih keras dan 30 menit untuk
jaringan yang lebih lunak, dan 100% etanol dua kali selama 54 menit untuk jaringan yang
lebih keras dan 30 menit untuk jaringan yang lebih lunak. Catatan : Sampel tanaman dapat
disimpan dalam 70% etanol pada suhu 4 ° C selama beberapa bulan.
5. Infiltrasi parafin
1. Sampel infiltrasi dengan 15 ml etanol dan campuran pengganti xylene masing-masing selama
54 menit untuk jaringan yang lebih keras dan 30 menit untuk jaringan yang lebih lunak, pada
suhu kamar sebagai berikut: pengganti etanol / xilena (2: 1, v / v), pengganti etanol / xilena (1:
1, v / v), pengganti etanol / xilena (1: 2, v / v), dan pengganti xilen murni dua kali. Perhatian:
Xylene beracun. Lakukan langkah ini di lemari asam.
2. Sampel dimasukan dalam botol dengan 15 ml pengganti xylene dan campuran parafin dalam
oven pada suhu 60 ° C, semalaman untuk jaringan yang lebih keras, dan selama 60 menit untuk
jaringan yang lebih lunak sebagai berikut: pengganti / parafin xylene (2: 1, v / v ), pengganti
xylene / parafin (1: 1, v / v), dan pengganti xylene / parafin (1: 2, v / v).
3. Infiltrasi sampel dengan 15 ml parafin murni dua kali sehari dan inkubasi pada suhu 60 ° C
dalam oven.
4. Ulangi langkah 3 pada hari berikutnya.
6. Penempelan jaringan (Tissue Embedding)
1. Nyalakan pusat penempelan jaringan 1 jam sebelumnya untuk melelehkan lilin di reservoir
parafin sebelum menanamkan jaringan dalam blok parafin.
2. Panaskan cetakan logam (ukuran alas 3,3 cm panjang x lebar 2 cm) pada baki pemanas pada
suhu 62 ° C, dan tuangkan sekitar 13 ml lilin cair ke dalam dasar cetakan.
3. Pindahkan satu sampel jaringan dari bagian 1.5.4 ke dalam cetakan dengan forsep yang
dihangatkan dan arahkan ke posisi yang diinginkan.
4. Pindahkan cetakan ke piring dingin dengan hati-hati, dan biarkan sampai lilin mengeras.
2. Pengirisan Jaringan ( Tissue Sectioning)
1. Metode pemotongan parafin
3
 1. Buat dasar lilin dengan menempatkan kaset tempelan di bagian atas cetakan (ukuran yang
sama di bagian 1.6.2 ), isi dengan lilin cair dan lepaskan cetakan setelah lilin mengeras.
Catatan : Kaset embedding akan membentuk dasar lilin untuk memadatkan blok parafin
sampel.
2. Potong blok parafin ke dalam bentuk dan ukuran yang sesuai, dan letakkan beberapa
potongan lilin pada spatula datar. Panaskan potongan lilin menggunakan pembakar alkohol
sampai lilin meleleh dan kemudian letakkan lilin cair di dasar lilin di bagian 2.1.1 untuk
melekatkan blok. Jepit di mikrotom.
3. Tempatkan pisau baru ke atas mikrotom, dan sesuaikan sudutnya hingga 5 derajat untuk
memudahkan bagian dalam mikrotom.
4. Potong blok parafin sampel menjadi irisan tipis (10 μm), seperti yang dijelaskan sebelumnya
2. Metode pemotongan potongan hibrida
1. Potong blok parafin sampel dari langkah 1.6.4 ke kolom dengan permukaan trapesium di
bagian atas untuk. ukuran yang tepat menggunakan pisau ukur.
2. Tambahkan beberapa senyawa Suhu Pemotongan Optimal (OCT) ke tengah tahap cryostat.
Pasang blok parafin ke tahap cryostat dan kemudian dengan cepat mengarahkan blok
jaringan ke posisi yang diinginkan.
3. Pindahkan blok parafin ke ruang cryostat. biarkan OCT memadat pada bar beku cepat -42 °
C selama 10 menit. Jangan pindahkan blok saat pemadatan OCT (Gambar 2C).
4. Biarkan adaptor cryostat dan suhu ruang mendingin masing-masing hingga -20 ° C dan -16
° C sebelum memasang blok / tahap parafin ke adaptor cryostat. Bagian jaringan dengan
ketebalan 10 μm.
5. Pilih bagian jaringan dengan forsep. Apung bagian pada air yang diolah DEPC 800 μl dalam
slide yang dilapisi Poly-L-lisin dan pindahkan slide ke hot plate pada suhu 42 ° C.
6. Biarkan bagian merata di atas air yang diolah DEPC pada suhu 42 ° C. Gunakan kertas saring
untuk mengalirkan air dari tepi.
7. Pasang tisu pada slide dengan menempatkan slide pada hot plate 42 ° C semalaman.

3. Pewarnaan Jaringan (Tissue Staining)

1. Deparaffinisasi
1. Kumpulkan slide dari hot plate dan letakkan di rak pewarnaan. Tambahkan 150 ml xylene
ke dalam wadah pewarnaan di lemari asam dan rendam rak dalam xylene selama 5 menit.
2. Rehidrasi

4
 1. Siapkan konsentrasi larutan etanol yang berbeda (100%, 95%, 70%, 50%, dan 30%) dalam
air yang diolah DEPC dan masing-masing isi 150 ml larutan ke dalam wadah pewarnaan
yang berbeda.
2. Rehidrasi sampel melalui serangkaian penurunan konsentrasi etanol, setiap langkah selama
3 menit pada suhu kamar. Pindahkan slide dalam rak pewarnaan satu tabung ke tabung lain
yang mengandung konsentrasi etanol yang berbeda: 100% Etanol, 95% Etanol, 70% Etanol,
50% Etanol, dan 30% Etanol.
3. Setelah rehidrasi, rendam spesimen dalam ddH2O selama 3 menit.
3. Pewarnaan hematoxylin
1. Sampel jaringan noda dengan merendam slide jaringan dalam larutan hematoxylin selama
1,5 menit.
2. Bilas sebentar dalam ddH2O yang mengandung 1 - 2 tetes asam klorida 12 N (HCl) selama
beberapa detik, dan kemudian cuci sebentar dalam ddH2O.
4. Dehidrasi
1. Dehidrasi sampel melalui serangkaian peningkatan konsentrasi etanol selama 3 menit pada
suhu kamar: 30% Etanol, 50% Etanol, 70% Etanol, 95% Etanol, 95% Etanol, dan 100%
Etanol. Bersihkan spesimen dengan xylene di lemari asam selama 5 menit.
5. Pemasangan
1. tempatkan 600 μl media pemasangan berbasis xylene ke slide dengan tepat. Dengan hati-hati
letakkan kaca penutup pada spesimen. Hindari pembentukan gelembung udara untuk
mendapatkan gambar berkualitas baik.
2. Biarkan slide mengering semalaman. Amati spesimen di bawah mikroskop pada hari
berikutnya. Catatan: Gambar ditangkap pada pembesaran 25X hingga 400X tergantung pada
ukuran spesimen

5
Gambar 4: Aplikasi Hibrida-Potong untuk Berbagai Bagian Jaringan anggrek Phalaenopsis. Jaringan
anggrek yang berbeda dibelah menggunakan metode Hibrida-Cut, seperti bagian longitudinal benih
anggrek selama tahap dewasa (A), bagian longitudinal dari protocorm (B), bagian longitudinal dari
badan seperti protocorm (PLB) (C), melintang bagian daun daun (D), bagian longitudinal akar (E),
bagian longitudinal dari lonjakan bunga muda (F), dan bagian longitudinal dari kuncup bunga muda
(G). Bagian jaringan diwarnai oleh hematoxylin. SC, kulit biji; PB, protein tubuh; M, meristem; MP,
ibu PLB; DP, anak perempuan PLB; Iklan, permukaan daun adaxial; Ab, permukaan daun abaksial;
St, stomata; MC, sel mesofil; VB, bundel pembuluh darah; RC, root cap; fb, kuncup bunga; Se, sepal;
Pe, daun bunga; La, labellum; Po, pollinia; Ro, rostellum; Ca, kalus. Panah menunjukkan kristal.
Skala bar mewakili 20 μm (A-E) dan 200 µm (F-G).

Perbandingan jaringan daun menggunakan metode parafin tradisional (panel kiri) dan teknik Hibrida-
Cut yang dikembangkan dalam penelitian ini (panel kanan). Gambar menunjukkan bagian melintang
daun padi, gandum, dan jagung. MC, sel mesofil; Ph, floem; St, stomata; BC, sel buliform. Panah
menunjukkan robeknya irisan jaringan. Panah menunjukkan tubuh silika. Lingkaran putus-putus biru
menunjukkan anatomi Kranz dalam jagung C4. Skala bar 20 μm

6
 TUGAS TERSRUKTUR MIKROTEKNIK TUMBUHAN

Disusun untuk Memenuhi Tugas pada Mata Kuliah Mikroteknik Tumbuhan

DISUSUN OLEH :

NAMA : ADI BUDI UTOMO

NIM : 24020117120036
KELAS : A

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA
UNIVERSITAS DIPONEGORO
SEMARANG
2019