Nama : Muhammad Iqbal Kamal

NIM : 165100607111004
Kelas :K
Mata Kuliah : Teknologi Enzim

Review Metode Purifikasi Pada Jurnal Internasional

Extraction and Purification of Collagenase Enzymes: A Critical Review
Said M Daboor, Suzanne M Budge, Abdel E Ghaly, Su-Ling Brooks and Deepika Dave
Purifikasi Kolagenase
Setelah ekstrak kolagenase mentah dipulihkan, ia harus dimurnikan menggunakan salah
satu dari beberapa metode kromatografi yang dapat diklasifikasikan sebagai: filtrasi gel,
pertukaran ion, interaksi hidrofobik atau afinitas. Gambar 9 menunjukkan prinsip dari proses
pemurnian ini. Perlu dicatat bahwa teknik kromatografi ini biasanya digabungkan bersama
sehingga sebagian besar skema pemurnian akan dimulai dengan filtrasi gel, diikuti oleh
pertukaran ion atau kromatografi afinitas atau keduanya, tergantung pada aplikasi.
Gel Filtrasi
Filtrasi gel dikenal sebagai pengecualian ukuran atau kromatografi saringan molekuler.
Ini memisahkan molekul berdasarkan ukuran. Ini adalah pemisahan fisik di mana bahan
pengemasan kolom berisi pori-pori yang hanya dapat dimasukkan dan dipertahankan oleh
molekul dalam ukuran atau rentang massa tertentu. Banyak matriks gel komersial digunakan
seperti Sephadex (10, 25, 50, 75, 100 dan G-200), Sepharose, Sephacryl, Sepharose CL dan
Bio-Gel. Bahan-bahan yang berbeda ini memiliki kisaran pengecualian-protein yang berbeda.
Protein dapat dipisahkan dengan menjalankannya melalui kolom resin gel yang sesuai.
Semua prosedur harus dilakukan pada suhu 4 ° C dan pemilihan jenis serbuk gel didasarkan
pada protein tertentu yang diminati.
Beberapa peneliti melakukan pemurnian kolagenase menggunakan kromatografi filtrasi
gel. Seperti menggunakan Sephadex G-150 untuk memurnikan kolagenase kulit manusia
atau dengan cara mengisolasi proteinase serin kolagenolitik murni dari cod Atlantik
menggunakan fenil-Sepharose CL-4B. Terlepas dari bahan pendukung, semua kelompok
tampaknya secara konsisten menggunakan ukuran pori maksimum sehingga 200 kDa adalah
batas massa molekul atas untuk retensi zat terlarut (yaitu, semua molekul dengan massa
molekul besar melewati kolom dengan pelarut). Dengan ketidakpastian dalam massa molekul
kolagenase, batas massa yang tinggi tampaknya lebih baik.
Kromatografi pertukaran ion
Kromatografi pertukaran ion memisahkan ion dan molekul polar sesuai muatan. Ini
didasarkan pada interaksi ionik dari molekul analit dengan kolom dan dapat bertukar anion
atau kation. Pada pH tertentu, sebagian besar protein memiliki muatan negatif atau positif
keseluruhan tergantung pada titik isoelektriknya (pI), karenanya protein ini berinteraksi
dengan pengemasan kolom yang berlawanan. Protein dipertahankan karena perbedaan
jumlah muatan yang mereka bawa. Ada dua jenis kolom yang umum digunakan: (a) (CM)
sephadex Diethylaminoethyl (DEAE) selulosa untuk mengikat protein bermuatan negatif neto
dan (b) karboksimetil untuk mengikat protein bersih bermuatan positif.
Pada tingkat pH optimal (dekat 7,0), collagenase akan menanggung muatan negatif
keseluruhan dan pertukaran anionik harus digunakan. Kromatografi penukar anion
berdasarkan Diethylaminoethyl (DEAE) selulosa atau agarosa sejauh ini merupakan teknik
pertukaran ion yang paling umum yang telah digunakan oleh sejumlah peneliti untuk
memurnikan sebagian kolagenase.
Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC)
HIC memanfaatkan interaksi hidrofobisitas permukaan dari bahan pengemasan protein
dan kolom dengan adanya konsentrasi garam yang tinggi. Karena asam amino memiliki
hidrofobik yang berbeda, HIC dapat digunakan untuk memisahkan protein dan enzim dengan
komposisi yang berbeda.
Teknik ini mirip dengan kromatografi Reverse Phase (RP) di mana struktur non-polar,
seperti ligan alkil, melekat pada pendukung dan membentuk interaksi reversibel dengan zat
terlarut. Namun, dengan HIC, interaksinya jauh lebih lemah sehingga protein tidak tertahan
kuat dan dapat dipulihkan dengan pelarut polar dengan berbagai konsentrasi garam.

Kromatogafi Affinitas
Kromatografi afinitas menggunakan interaksi spesifik antara substrat dan zat aktif biologis
dan merupakan metode yang paling kuat untuk pemurnian protein. Metode ini didasarkan
pada afinitas tinggi dari beberapa protein pada kelompok kimia tertentu (ligan) yang terikat
pada bahan unggun kromatografi.
Interaksi mungkin sangat spesifik, dengan substrat terikat pada fase diam yang hanya
enzim minat yang dapat berinteraksi dengan seperti collagen-collagenasepairing. Fase diam
dengan kolagen sebagai ligan tidak tersedia secara komersial tetapi sejumlah kelompok
penelitian telah menyiapkan bahan kemasan sendiri untuk memanfaatkan interaksi yang
sangat spesifik ini.
fase diam yang berinteraksi dengan sejumlah molekul yang mengandung struktur
tertentu. Seperti menggunakan protein pengikat gula, seperti lektin, dalam kolom afinitas
untuk mengisolasi kolagenase melalui interaksi dengan gugus oligosakarida spesifiknya.
Aplikasi biospecific ini memiliki potensi untuk menghasilkan enzim yang sangat murni tetapi
tampaknya menemukan aplikasi yang terbatas, kemungkinan karena langkah persiapan
tambahan yang diperlukan untuk menghasilkan fase diam yang tidak tersedia secara
komersial.

Literatur
Daboor, Said M., Suzanne M Budge, Abdel E Ghaly, Su-Ling Brooks dan Deepika Dave. 2010.
Extraction and Purification of Collagenase Enzymes: A Critical Review. American Journal
of Biochemistry and Biotechnology 6(4) : 239-263