BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Rancangan Penelitian

Rancangan penelitian ini adalah eksperimental murni dengan pola Post Test
Only Control Group Design pada kultur sel monosit secara in vitro.
Rancangan penelitian dapat digambarkan sebagai berikut :

P0 P1 P2 P3
01 02 03 04

Keterangan :
P : Populasi
S : Sampel
R : Randomisasi
P0 : Perlakuan pada kelompok kontrol negatif yang diberi ekstrak daun
cengkeh.
P1 : Perlakuan pada kelompok yang diberi paparan ekstrak daun cengkeh
2,5% selama 24 jam.
P2 : Perlakuan pada kelompok yang diberi paparan ekstrak daun cengkeh 4%
selama 24 jam.
 P3 : Perlakuan pada kelompok yang diberi ekstrak daun cengkeh 10% selama
24 jam.
01, 02, 03,04 : pengukuran sitoksisitas dengan Trypan blue exclusion test.

3.2 Subyek Penelitian

1. Populasi Subyek
Subyek penelitian adalah daun cengkeh yang dibuat menjadi ekstrak dari
hasil maserasi dengan konsntrasi 2,5%, 4% dan 10% sebagai kelompok
perlakuan.
2. Kriteria Sampel
a. Kriteria Inklusi
Sel PBMC orang dewasa sehat yang didapat dari sukarelawan
b. Kriteria Eksklusi
Sel PBMC dari orang dewasa yang tidak sehat.
3. Besar Sampel
Teknik pengambilan sampel menggunakan teknik acak/probabiliti. Sampel
dibagi menjadi 3 kelompok perlakuan (ekstrak daun cengkeh 2,5%, 4%, dan
10%) dan 1 kelompok kontrol yaitu kelompok yang tidak diberi perlakuan.
Jumlah sampel ditentukan berdasarkan rumus Frederer(1999), yaitu :
Keterangan :
n : banyaknya ulangan
t : banyaknya perlakuan
(n-1)(t-1) ≥ 15
(n-1)(4-1) ≥ 15
(n-1)(3) ≥ 15
3n-3 ≥ 15
3n ≥ 15 + 3
n ≥ 18 : 3
≥6
Jumlah sampel (n) yang dipakai adalah 6, artinya pada kelompok I-IV
dilakukan masing-masing 6 kali pengulangan.
3.3 Definisi Operasional
1. Ekstrak daun cengkeh adalah sediaan pekat yang didapat dengan
mengekstraksi zat aktif dari daun cengkeh dengan menggunakan pelarut
metanol dan diencerkan dengan akuades steril hingga mendapatkan
konsentrasi 2,5%, 4%, dan 10%.
2. Monosit adalah sel monosit yang terdiferensiasi dari sel PBMC selama 5 hari
kultur dimana sel PBMC diisolasi menggunakan Histopaque berasal dari
darah vena cubiti orang dewasa sehat sebanyak 2x105 sel untuk masing-
masing sumur.
3. Lingkungan adalah inkubator CO2 dengan suhu 37C. Tiap-tiap kelompok
diletakkan pada inkubator yang sama.
3. Sitoksisitas sel monosit adalah prosentasi kematian sel monosit dengan
Trypan Blue Exclusion Test.

3.4 Instrumen Penelitian

1. Bahan Penelitian
a. Ekstrak daun cengkeh 2,5%, 4% dan 10%
b. Darah vena cubiti dewasa sehat
c. MEDIUM rpmi 1641 + FBS + Penstrep + L-Glutamine
d. Histopaque
e. Trypan Blue
f. Tisu makan
2. Alat Penelitian
a. Sumuran 96 well plate
b. inkubator CO2
c. Haemocytometer
d. Mikroskop Olympus CX-41 + kamera DP12 Olympus
e. Microcentrifuge
f. Sentrifuge

3.5 Variabel Penelitian

 Variabel penelitian adalah semua faktor yang mempengaruhi presentase
kematian sel monosit saat berkontak dengan ekstrak daun cengkeh, antara lain:
1. Variabel pegaruh
Konsentrasi ekstrak daun cengkeh 2,5%, 4% dan 10%
2. Variabel teerpengaruh
Presntasi kematian sel monosit
3. Variabel terkendali
a. Kondisi lingkungan kultur sel monosit (pencahayaan, kelembaban, dan
suhu ruangan).
b. Jenis sel monosit
c. Lama inkubasi (24 jam).
3.6 Hubungan Antar Variabel

Varaiabel Terkendali

Kondisi lingkungan kultur sel

monosit (pencahayaan,
kelembaban, dan suhu ruangan),
jenis sel monosit dan lama
inkubasi (24 jam)

Variabel Pengaruh Variabel Terpengaruh

Konsentrasi ekstrak daun Prosentase kematian sel

cengkeh 2,5%, 4%, dan 10% monosit

3.7 Prosedur Penelitian

1. Pembuatan ekstrak daun cengkeh yang digunakan dalam penelitian ini
didapatkan dari perkebunan daun cengkeh di Ende, Nusa Tenggara Timur.
Daun yang digunakan adalah daun cengkeh berwarna hijau tua. Kemudian
daun cengkeh dijemur dengan diangin-anginkan hingga kering selanjutnya
daun cengkeh kering diblender untuk mendapatkan serbuk daun cengkeh
(simplisia). Serbuk dimasukkan kedalam botol tertutup berwarna gelap agar
terlindungi dari sinar matahari9 dan direndam (dimaserasi) dengan
menggunakan 1,5 liter pelarut etanol. Pemaserasian dilakukan pada suhu
kamar, selama ± 3 hari dan pengadukan dilakukan setiap hari. Setelah 3 hari
pemaserasian, maserat kemudian disaring, filtrat dipisahkan dan ampasnya
direndam kembali dengan etanol yang baru, maserasi dilakukan ± 5 kali
hingga diperoleh maserat yang terakhir berwarna jernih. Filtrat yang
diperoleh dipekatkan dengan rotary evaporator pada suhu tidak lebih 50°C
dan diuapkan in vacuo sehingga terpisah pelarut etanol dengan ekstrak daun
cengkeh. Pelarut etanol dipilih karena dapat melarutkan zat-zat aktif dalam
jumlah kecil yang terkandung dalam bahan alam.
Proses ekstraksi yang dialkukan adalah proses perendaman (maserasi)
bertujuan untuk mengurangi pengaruh pemanasan yang dapat merusak
senyawa aktif, selain itu dengan proses maserasi akan terjadi pemecahan
dinding dan membran sel sehingga metabolit se kunder yang berada dalam
sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik dan ekstraksi senyawa aktif
akan sempurna karena diatur lamanya perendaman (Rahayu, 2009).
2. Pemilihan sampel dewasa sehat dan kultur sel monosit
Individu dewasa sehat diambil darah dari vena cubiti sebanyak 6 cc
menggunakan prosedur aseptik dimasukkan ke dalam tabung EDTA.
Selanjutnya darah sebanyak 6 cc ditambahkan dengan 6 cc PBS 1x lalu
diasukkan secara perlahan ke dalam Histopaque sebanyak 6 cc. Kemudian
disentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm. Lalu pindahkan
lapisan tengah ke dalam tabung baru, tambahkan PBS 1x sebanyak 10 cc
lalu sentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm. Hitung jumlah
sel menggunakan Haemocytometer dan setelah diketahui jumlah sel PBMC
 lalu dibawa ke dalam conical tube selama 5 hari dengan setiap hari
mengganti medium sampai hari ke-5 menjadi monosit.
3. Prosedur penelitian (dalam BSL level II)1
a. Sebanyak 25 sumuran diisi medium RPMI 1640 komplit lalu diisi dengan
2x105 sel monosit .
b. Sumuran dibagi menjadi 5 kelompok perlakuan.
c. Setelah 24 jam sel monosit diambil kembali lalu disentrifuge selama 10
menit dengan kecepatan 2500 rpm.
d. Dilakukan tes sitotoksisitas dengan Trypan Blue Exclusion Test untuk
menghitung sitotoksitas sel monosit.
3.8 Analisis Data
Untuk mengetahui pengaruh konsentrasi ekstrak daun cengkeh terhadap
sitoksisitas sel monosit pada uji in vitro digunakan uji statistik dengan langkah-
langkah sebagai berikut :
1. Analisis Deskriptif
2. Uji Normalitas dan Uji Homogenitas
a. Normalitas data diuji dengan Shapiro-Wilk oleh karena sampel <30.
Sebaran data adalah normal bila nilai p>0,05
b. Homogenitas data diuji dengan Levene’s Test untuk mengetahui
prosentase kematian sel monosit sebagai data yang diuji. Data adalah
homogen dengan nilai p>0,05.
3. Uji Hipotesis
H0 : X1 = X2 = X3 =X4
Ha : X1 ≠ X2 ≠ X3 ≠ X4
Keterangan :
X1 : Kelompok pelakuan yang diberi ekdtrk daun cengkeh (kontrol
negatif)
X2 : Kelompok perlakuan yang diberi ekstrak daun cengkeh konsentrasi
2,5%
X3 : Kelompok perlakuan yang diberi ekstrak daun cengkeh konsentrasi
4%
X4 : Kelompok perlakuan yang diberi ekstrak daun cengkeh konsentrasi
10%
4. Analisis Data
a. Data yang diperoleh dianalisis dengan melakukan analisis analitik,
kemudian dilanjutkan dengan uji normalitas dan homogenitas serta uji
One Way Anova untuk mengetahui efek perlakuan.
b. Uji hipotesis dilakukan dengan uji One Way Anova karena kelompok
yang dibandingkan lebih dari dua kelompok.