Modul Praktikum Mikrobiologi

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 1
PERSONAL INFORMATION
NAMA :_________________________________________________
NIM :_________________________________________________
KELAS :_________________________________________________
KELOMPOK :_________________________________________________
NO. HP :_________________________________________________
ALAMAT :_________________________________________________
__________________________________________

TATA TERTIB PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI
Untuk menjaga keamanan
1. Praktikan harus telah mengenakan jas lab saat memasuki laboratorium dan bekerja
dengan peralatan di laboratorium untuk menghindari kontaminasi dan terkena
khemikalia.
2. Dilarang keras makan, merokok dan minum di laboratorium
3. Sebelum dan sesudah bekerja, meja praktikum dibersihkan dengan desinfektan
4. Praktikan berambut panjang harus mengikat rambutnya sedemikian rupa sehingga
tidak mengganggu kerja dan menghindari dari hal-hal yang tidak diinginkan.
5. Pengambilan kultur cair atau suspensi dan khemikal harus menggunakan pipet
dengan bantuan filler atau menggunakan mikropipet.
6. Dilarang membuang biakan sisa atau habis pakai dan pewarna sisa disembarang
tempat. Bahan tersebut harus dibuang di tempat yang telah disediakan oleh asisten.
7. Laporkan segera jika terjadi kecelakaan seperti kebakaran, biakan tumpah ada yang
menelan bahan kimia, atau biakan kepada asisten
8. Jika menggunakan jarum inokulum, ujung jarum dibakar sampai memijar
sesudah dan sebelum bekerja menggunakan alat ini
9. Sebelum meninggalkan laboratorium disarankan untuk mencuci tangan dengan
seksama.
Untuk kelancaran praktikum

1. Praktikan diwajibkan memakai jas laboratorium sebelum memasuki laboratorium
dan dilepas di luar laboratorium.
2. Praktikan wajib memakai sepatu pada saat praktikum.
3. Praktikan dilarang berbicara yang tidak perlu dan membuat gaduh
4. Memakai pakaian yang sopan pada saat praktikum (baju berkrah untuk laki-laki)
5. Praktikan yang datang terlambat lebih dari 10 menit mengganti di akhir acara.
6. Praktikan yang datang terlambat lebih dari 20 menit maka wajib inhal.
7. Kuis akan dilaksanakan pada awal acara sebelum memulai praktikum untuk
mengetahui sejauh mana kompetensi yang dicapai.
8. Inhal kuis akan diadakan satu kali dan nilai yang diambil adalah nilai terbaik.

9. Bagi praktikan yang akan berpindah jadwal praktikum harus seizin coordinator
praktikum mikrodas dengan menyerahkan surat pengantar paling lambat dua hari
berikutnya.
10. Praktikan yang tidak hadir praktikum (absen), maka disarankan ikut inhal
praktikum, di mana harus membayar untuk mengganti biaya praktikum dan tenaga
asisten
11. Praktikan akan dinilai keterampilannya selama praktikum oleh asisten
12. Praktikan yang tidak mengikuti asistensi tanpa keterangan tidak mendapatkan nilai
pretest, tapi jika ada izin tertulis maka dapat mengikuti pretest susulan.
13. Praktikan yang tidak mengikuti pengamatan harus mengikuti pengamatan susulan.
14. Laporan harus dibawa saat masuk pada praktikum sebagai syarat masuk.
15. Praktikan yang tidak membawa laporan karena tertinggal, tetap diizinkan mengikuti
praktikum tetapi harus mengambil laporan yang tertinggal pada hari itu juga dan
menyerahkkannya ke asisten.
16. Aturan-aturan / tata tertib yang belum tercantum akan diputuskan kemudian.

JUDUL PRAKTIKUM
1. MEDIA DAN STERILISASI

PJ : Rahmania
2. ISOLASI MIKROORGANISME
PJ : Amining, Chaerul, Vero
3. ENUMERASI
PJ : Rahmania, Rizky, Tia
4. PENGARUH LINGKUNGAN
PJ : Amining
5. KOLOM WINOGRADSKY
PJ : Chaerul
6. PEMBUATAN YOGURT
PJ : Vero
7. PEMBUATAN NATA
PJ : Vero
8. HIDROLISIS PATI DAN SKIM
PJ : Rizky
9. PEWARNAAN GRAM
PJ : Tia

JUDUL 1
MEDIA DAN STERILISASI
I. Tujuan :
1. Dapat membuat media pertumbuhan Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB) dan
Potato Dextrose Agar (PDA).
2. Dapat melakukan sterilisasi alat dan bahan menggunakan autoklaf.
3. Melakukan pengamatan terhadap media yang sudah dibuat.
II. DASAR TEORI

A. MEDIA
Pengertian dan Fungsi
Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-
zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya.
Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekulmolekul kecil yang dirakit
untuk menyusun komponen sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolat
mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media
pertumbuhannya.
Bahan-bahan media pertumbuhan
1. Bahan dasar
air (H2O) sebagai pelarut
agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media. Agar sulit didegradasi
oleh mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada suhu 45oC.
gelatin juga memiliki fungsi yang sama seperti agar. Gelatin adalah polimer asam
amino yang diproduksi dari kolagen. Kekurangannnya adalah lebih banyak jenis
mikroba yang mampu menguraikannya dibanding agar.
Silica gel, yaitu bahan yang mengandung natrium silikat. Fungsinya juga sebagai
pemadat media. Silica gel khusus digunakan untuk memadatkan media bagi
mikroorganisme autotrof obligat.

2. Nutrisi atau zat makanan
Media harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan untuk metabolisme sel yaitu
berupa unsur makro seperti C, H, O, N, P, unsur mikro seperti Fe, Mg dan unsur
pelikan/trace element.
Sumber karbon dan energi yang dapat diperoleh berupa senyawa organic atau
anorganik esuai dengan sifat mikrobanya. Jasad heterotrof memerlukan sumber

karbon organik antara lain dari karbohidrat, lemak, protein dan asam organik.
Sumber nitrogen mencakup asam amino, protein atau senyawa bernitrogen lain.
Sejumlah mikroba dapat menggunakan sumber N anorganik seperti urea.
Vitamin-vitamin.
3. Bahan tambahan
Bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke medium dengan tujuan
tertentu, misalnya phenol red (indikator asam basa) ditambahkan untuk indikator
perubahan pH akibat produksi asam organik hasil metabolisme. Antibiotik
ditambahkan untuk menghambat pertumbuhan mikroba nontarget/ kontaminan.
4. Bahan yang sering digunakan dalam pembuatan media
 Agar, agar dapat diperoleh dalam bentuk batangan, granula atau bubuk dan terbuat
dari beberapa jenis rumput laut. Kegunaannya adalah sebagai pemadat (gelling)
yang pertama kali digunakan oleh Fraw & Walther Hesse untuk membuat media.
Jika dicampur dengan air dingin, agar tidak akan larut. Untuk melarutkannya harus
diasuk dan dipanasi, pencairan dan pemadatan berkali-kali atau sterilisasi yang
terlalu lama dapat menurunkan kekuatan agar, terutama pada pH yang asam
 Peptone, peptone adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti otot,
liver, darah, susu, casein, lactalbumin, gelatin dan kedelai. Komposisinya tergantung
pada bahan asalnya dan bagaimana cara memperolehnya.
 Meat extract. Meat extract mengandung basa organik terbuat dari otak, limpa,
plasenta dan daging sapi.
 Yeast extract. Yeast extract terbuat dari ragi pengembang roti atau pembuat alcohol.
Yeast extract mengandung asam amino yang lengkap & vitamin (B complex).
 Karbohidrat. Karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya pembentukan asam
amino dan gas dari karbohidrat. Jenis karbohidrat yang umumnya digunkan dalam

amilum, glukosa, fruktosa, galaktosa, sukrosa, manitol, dll. Konsentrasi yang
ditambahkan untuk analisis fermentasi adalah 0,5-1%.
Macam-Macam Media Pertumbuhan
1. Medium berdasarkan sifat fisik
Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah dingin
media menjadi padat.
Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga
menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media semi solid dibuat
dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media tetapi
tidak mengalami percampuran sempurna jika tergoyang. Misalnya bakteri yang
tumbuh pada media NfB (Nitrogen free Bromthymol Blue) semisolid akan
membentuk cincin hijau kebiruan di bawah permukaan media, jika media ini cair
maka cincin ini dapat dengan mudah hancur. Semisolid juga bertujuan untuk
mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya pada media Nitrate Broth, kondisi
anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga
diharuskan tumbuh merata diseluruh media.
Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB
(Nutrient Broth), LB (Lactose Broth).

2. Medium berdasarkan komposisi
Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan
takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar.
Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara
pasti, misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar, dekstrosa dan
ekstrak kentang. Untuk bahan ekstrak kentang, kita tidak dapat mengetahui secara
detail tentang komposisi senyawa penyusunnya.
Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat
diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya,
misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic Extract.

3. Medium berdasarkan tujuan
Media untuk isolasi. Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk
pertumbuhan mikroba, misalnya Nutrient Broth, Blood Agar.
Media selektif/penghambat. Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah
suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain
dan merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Contohnya adalah Luria
Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk merangsang E.coli resisten
antibotik dan menghambat kontaminan yang peka, Ampiciline. Salt broth yang
ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang toleran
terhadap garam.
Media diperkaya (enrichment). Media diperkaya adalah media yang mengandung
komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks

seperti darah, serum, kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk
mikroba tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya
membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak, tetapi membutuhkan
komponen kompleks, misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar, Serum Agar, dll.
Media untuk peremajaan kultur. Media umum atau spesifik yang digunakan untuk
peremajaan kultur
Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik. Media ini digunakan unutk
mendiagnosis atau menganalisis metabolism suatu mikroba. Contohnya adalah

Koser’s Citrate medium, yang digunakan untuk menguji kemampuan menggunakan
asam sitrat sebagai sumber karbon.
Media untuk karakterisasi bakteri. Media yang digunakan untuk mengetahui
kemempuan spesifik suatu mikroba. Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk

menunjukkan adanya perubahan kimia. Contohnya adalah Nitrate Broth, Lactose
Broth, Arginine Agar.
Media diferensial. Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari
campurannya berdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial,

misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria

berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna media di sekeliling
koloni.
B. STERILISASI
Sterilisasi dalam mikrobiologi berarti membebaskan tiap benda atau substansi
dari semua kehidupan dalam bentuk apapun. Untuk tujuan mikrobiologi dalam usaha
mendapatkan keadaan steril, mikroorganisme dapat dimatikan setempat (in situ) oleh
panas, gas-gas sperti formaldehyde, etilenoksida, atau betapriolakton oleh bermacam-
macam larutan kimia, dan oleh sinar gamma. Mikrooganisme juga dapat disingkirkan
secara mekanik melalui sentrifugasi kecepatan tinggi atau dengan filtrasi.
1. Sterilisasi secara fisik.
Selama senyawa kimia yang akan disterilkan tidak akan berubah atau terurai
akibat temperature tinggi dan tekanan tinggi, selama itu sterilisasi secara fisik dapat
dilakukan. Cara sterilisasi ini dapat dilakukan dengan menggunakan udara panas atau
uap air panas dengan tekanan tinggi.
Dengan udara panas, digunakan alat yang dinamakan “bejana ruang panas”
(oven) dengan temperature di dalamnya antara 170-180ºC. Waktu yang digunakan
selama 2 jam. Cara ini umum digunakan untuk mensterilkan peralatan gelas (tabung,
labu, botol, dsb).
Sterilisasi dengan uap-air panas dan tekanan tinggi, merupakan cara yang paling
banyak digunakan, misalnya dengan penggunaan alat yang sudah dikenal dengan nama
“autoklaf”. Bejana ini mempunyai temperature uap 121ºC dengan tekanan 15lbs.
2. Sterilisasi secara kimia
Senyawa kimia yang banyak digunakan sebagai desinfektan antara lain larutan
CuSO4, AgNO3, HgCl2, ZnO dan sebagainya serta larutan alcohol dan campurannya.
Beberapa larutan garam seperti NaCl (9%), KCl (11%), dan KNO3 (10%) dapat
dipergunakan untuk membunuh mikroba karena tekanan osmotiknya, yaitu dengan jalan
dehidrasi pada substrat. Sedangkan asam kuat atau basa kuat dapat pula digunakan
karena bersifat menghidrolisis sel mikroba.
Larutan KMnO4 (1%), dan HCl (1,1%) ternyata merupakan dseinfektan yang
kuat karena dapat mengoksidasi substrat. Sedang yang paling banyak digunakan adalah
larutan HgCl2 (0,1%). Hanya sayangnya senyawa ini sangat beracun dan sifatnya

korosif, serta dapat merusak jaringan inang, dan mengendapkan protein. Juga larutan
garam Cu (dari CuSO4) merupakan senyawa yang paling banyak digunakan sebagai
algisida (pembasmi alga). Khlor dan senyawa khlor lainnya banyak dipergunakan
sebagai desinfektan terutama pada tempat penyimpanan air. Khlor mempunyai daya
membunuh mikroba dalam dua cara, yaitu:
a). Secara oksidasi (On)
b). Khlorinasi langsung terhadap protein sel
Prinsip cara kerja autoklaf

Seperti yang telah dijelaskan sebagian pada bab pengenalan alat, autoklaf
adalah alat untuk memsterilkan berbagai macam alat & bahan yang menggunakan
tekanan 15 psi (2 atm) dan suhu 1210C. Untuk cara kerja penggunaan autoklaf telah
disampaikan di depan. Suhu dan tekanan tinggi yang diberikan kepada alat dan media
yang disterilisasi memberikan kekuatan yang lebih besar untuk membunuh sel
dibanding dengan udara panas. Biasanya untuk mesterilkan media digunakan suhu
1210C dan tekanan 15 lb/in2 (SI = 103,4 Kpa) selama 15 menit. Alasan digunakan suhu
1210C atau 249,8 0F adalah karena air mendidih pada suhu tersebut jika digunakan
tekanan 15 psi. Untuk tekanan 0 psi pada ketinggian di permukaan laut (sea level) air
mendidih pada suhu 1000C, sedangkan untuk autoklaf yang diletakkan di ketinggian
sama, menggunakan tekanan 15 psi maka air akan memdididh pada suhu 1210C. Ingat
kejadian ini hanya berlaku untuk sea level, jika dilaboratorium terletak pada ketinggian
tertentu, maka pengaturan tekanan perlu disetting ulang. Misalnya autoklaf diletakkan
pada ketinggian 2700 kaki dpl, maka tekanan dinaikkan menjadi 20 psi supaya tercapai
suhu 1210C untuk mendidihkan air. Semua bentuk kehidupan akan mati jika dididihkan
pada suhu 1210C dan tekanan 15 psi selama 15 menit.
Pada saat sumber panas dinyalakan, air dalam autoklaf lama kelamaan akan
mendidih dan uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoklaf. Setelah
semua udara dalam autoklaf diganti dengan uap air, katup uap/udara ditutup sehingga
tekanan udara dalam autoklaf naik. Pada saat tercapai tekanan dan suhu yang sesuai.,
maka proses sterilisasi dimulai dan timer mulai menghitung waktu mundur. Setelah
proses sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan dan tekanan dibiarkan turun perlahan
hingga mencapai 0 psi. Autoklaf tidak boleh dibuka sebelum tekanan mencapai 0 psi.

Untuk mendeteksi bahwa autoklaf bekerja dengan sempurna dapat digunakan
mikroba pengguji yang bersifat termofilik dan memiliki endospora yaitu Bacillus
stearothermophillus, lazimnya mikroba ini tersedia secara komersial dalam bentuk
spore strip. Kertas spore strip ini dimasukkan dalam autoklaf dan disterilkan. Setelah
proses sterilisai lalu ditumbuhkan pada media. Jika media tetap bening maka
menunjukkan autoklaf telah bekerja dengan baik.
Beberapa media atau bahan yang tidak disterilkan dengan autoklaf adalah :
Bahan tidak tahan panas seperti serum, vitamin, antibiotik, dan enzim
Paelarut organik, seperti fenol
Buffer engan kandungan detergen, seperti SDS
Untuk mencegah terjadinya presipitasi, pencoklatan (media menjadi coklat) dan

hancurnya substrat dapat dilakukan pencegahan sbb :
Glukosa disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau senyawa fosfat
Senyawa fosfat disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau senyawa
garam mineral lain.
Senyawa garam mineral disterilkan terpisah dengan agar
Media yang memiliki pH > 7,5 jangan disterilkan dengan autoklaf
Jangan mensterilisasi larutan agar dengan pH < 6,0
Erlenmeyer hanya boleh diisi media maksimum ¾ dari total volumenya, sisa ruang
dibirkan kosong. Jika mensterilkan media 1L yang ditampung pada Erlenmeyer 2L
maka sterilisasi diatur dengan waktu 30 menit.
Gambar 13. Prinsip Kerja Autoklaf

Saran-saran kerja aseptis :
1. Sebelum membuka ruangan atau bagian steril di dalam tabung/cawan/erlenmeyer
sebaiknya bagian mulut (bagian yang memungkinkan kontaminan masuk)
dibakar/dilewatkan api terlebih dahulu.
2. Pinset, batang L, dll dapat disemprot dengan alkohol terlebih dahulu lalu dibakar.
3. Ujung jarum inokulum yang sudah dipijarkan harus ditunggu dingin dahulu atau
dapat ditempelkan tutup cawan bagian dalam untuk mempercepat transfer panas
yang terjadi.
4. Usahakan bagian alat yang diharapkan dalam kondisi steril didekatkan ke bagian
api.
5. Jika kerja di Safety Cabinet tidak perlu memakai pembakar bunsen tetapi jika
di luar Safety Cabinet maka semakin banyak sumber api maka semakin terjamin
kondisi aseptisnya
III. ALAT DAN BAHAN

a. Alat
No Nama Jumlah
1 Cawan petri 4
2 Tabung reaksi 6
3 Tabung ulir 1
4 Erlenmeyer 1
5 Gelas ukur 1
6 Pengaduk 1
7 Bunsen 1
8 Autoklaf 1
9 Magnetic stirrer 1
10 Rak tabung reaksi 1
11 Gelas beker 1
12 Pipet tetes 4
b. Bahan
No Nama Jumlah
1 Serbuk NA Secukupnya
2 Serbuk NB Secukupnya
3 Serbuk PDA Secukupnya
4 Alumunium foil Secukupnya
5 Kapas Secukupnya
6 Aquades Secukupnya
7 Karet gelang Secukupnya
8 Karet label Secukupnya
9 Alcohol 70% Secukupnya

10 Korek api Secukupnya
11 Kertas pembungkus Secukupnya
12 Plastic tahan panas Secukupnya
13 Tissue Secukupnya
IV. CARA KERJA

a. Pembuatan Nutrient Agar dan Nutrient Broth
Pembuatan Nutrient Agar
1. Menimbang NA bubuk sebanyak 3,5 gr menggunakan neraca analitis
2. Melarutkan bubuk NA dengan akuades sampai hampir memenuhi gelas beker
besar
3. Menghomogenkan larutan NA dengan menggunakan magnetic stirrer
4. Memindahkan larutan NA ke dalam beberapa Erlenmeyer kemudian
menutupnya dengan kapas dan alumunium foil
5. Memasukkan Erlenmeyer tersebut ke dalam plastic tahan panas dan diikat
dengan karet gelang
6. Mensterilkan media dengan autoklaf selama ½ jam.
Pembuatan Nutrient Broth
1. Menimbang NB bubuk sebanyak 7gr menggunakan neraca analitis

2. Melarutkan bubuk NB dengan akuades sampai hampir memenuhi gelas beker
besar
3. Memindahkan larutan NB ke dalam beberapa Erlenmeyer kemudian
dengan karet gelang
5. Mensterilkan media dengan autoklaf selama ½ jam
b. Pembuatan Potato Dextrose Agar (PDA)

1. Menimbang PDA bubuk sebanyak 4 gr menggunakan neraca analitis
2. Melarutkan bubuk PDA dengan akuades sampai hampir memenuhi gelas
beker besar
3. Menghomogenkan larutan PDA dengan menggunakan magnetic stirrer
4. Memindahkan larutan PDA ke dalam beberapa Erlenmeyer kemudian
dengan karet gelang
6. Mensterilkan media dengan autoklaf selama ½ jam.

c. Sterilisasi Alat
1. Menyiapkan alat dan bahan yang digunakan untuk membuat media
2. Membungkus cawan petri dengan kertas buram lalu memasukkan ke dalam
plastic diikat dan diikat dengan karet gelang
3. Menutup mulut tabung reaksi dengan kaps dan alumunium foil serta diikat
dengan karet gelang.
4. Semua alat-alat tersebut dimasukkan ke dalam plastic tahan panas
5. Memasukkan ke dalam autoklaf dengan penataan yang rapi
6. Mensterilkan alat dengan autoklaf selama 1 jam
7. Mengeluarkan alat dari autoklaf setelah suhu turun ditandai dengan bunyi
alarm.
d. Sterilisasi Bahan
1. Semua media NA, NB dan PDA dimasukkan dalam Erlenmeyer dan disumbat
dengan kapas, ditutup dengan alumunium foil dan diikat dengan karet gelang.
2. Erlenmeyer dimasukkan dalam plastic tahan panas
3. Erlenmeyer dimasukkan ke dalam autoklaf dan ditata rapi
4. Sterilisasi bahan di dalam autoklaf selama ½ jam dengan prosedur kerja
seperti sterilisasi alat.
e. Pengamatan media
Setelah 5 hari dilakukan pengamatan media. Pengamatan dilakukan dengan
tujuan untuk mengamati keadaan media apakah rusak atau tidak dan terjadi
kontaminasi atau tidak. Mencatat hasill pengamatan ke dalam tabel data
pengamatan.

V. ANALISIS DATA

VI. KESIMPULAN
VII. DAFTAR PUSTAKA
VIII. LAMPIRAN
SURAKARTA, ………………….
ASISTEN PRAKTIKAN
(……….……………) (……….……………)

JUDUL II
ISOLASI MIKROORGANISME
I. TUJUAN:
1. Dapat mengisolasi untuk mendapatkan biakan murni dari suatu campuran
dengan menggunakan cawan gores (penggoresan)
2. Mengamati dan membandingkan bakteri yang timbul dari hasil isolasi
3. Mengetahui cara melakukan isolasi dengan teknik cawam gores
II. DASAR TEORI
Populasi mikroorganisme yang ada di alam sekitar kita ini ssangatlah besar dan
cukup kompleks. Beratus spesies mikroba menguasai setiap bagian tubuh kita. Mereka
terdapat dalam jumlah yang cukup basar. Sebagai contoh, sekali kita bersin dapat
mnebarkan beribu- ribu mikroorganisme. Satu gram tinja dapat mengandung jutaan
bakteri. Alam di sekitar kita, baik itu tanah, air, maupunudara juga dihuni oleh
kumpulan mikroorganisme.Penelitian yang layak mengenai mikroorganisme dalam
berbagai habitat ini memerlukan teknik untuk memisahkan populasi campuran yang
rumit ini, atau yang biasanya dikenal dengan istilah biakan campuran, menjadi spsies
yang berbeda- beda yang bikenal dengan istilah biakan murni. Biakan murni in teerdiri
dari satu populasi sel yang semuanya berasal dari satu sel induk (Pelczar, 1986).
Mikroorganisme dapat diperoleh dari lingkungan air, tanah, udara, suubstrat
yang berupa bahan pangan, tanaman dan hewan. Jenis mikroorganismenya dapat berupa
bakteri, khamir, kapng dan sebagainya. Populasi dari mikroba yang ada di linkungan ini
sangatlah beraneka ragam sehinga dalam mengisolasi diperlukan beberapa tahap
penanaman sehingga berhasil diperoleh koloni yang tunggal. Koloni yang tunggal ini
kemudian yang akan diperbanyak untuk suatu tujuan penelitian misalnya untuk
menngisolasi DNA mikroba yang dapat mendeteksi mikroba yang telah resisten
terhadap suatu antibiotik. Atau untuk mengetahui mikroba yang dipakai untuk
bioremediasi holokarbon (Ferdiaz, 1992).
Pemindahan bakteri dari medium lama ke medium yang baru atau yang dikenal
dengan istilah inokulasi bakteri ini memerluakn banyak ketelitian. Terlebih dahulu kita
harus mengusahakan agar semua alat- alat yang akan digunakan untuk pengerjaan
medium dan pengerjaan inokulasi benar- benar steril. Hal ini untuk menghindari

terjadinya kkontaminasi, yaitu masuknya mikrooba lain yang tidak diinginkan sehingga
biakan yang tumbuh di dalam medium adalah benar- benar biakan murni
(Dwidjoseputro, 1990).
Di dalam keadaaan yang sebenarnya dapat dikatakan bahwa tidak ada bakteri
yang hidup secara tersendiri terlepas dari spesies yang lainnya. Kerap kali bakteri
patogen kedapatan bersama- sama dengan bakteri saprob. Untuk menyendirikan suatu
spesies dikenal beberapa cara, yaitu (Dwidjoseputro, 1990) :
1. Degan pengenceran
Cara ini pertama kali dilakukan oleh Lister pada tahun 1865. Ia berhasil memelihara
Streptococcus lactis dalampiraan murni yang diisolasi dari sampel susu Yang sudah
masam.
Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam- macam spesies
diencerkan dalam suatu tabung yang tersendiri. Dari hasil pengenceran ini kemudian
di ambil kira- kira 1 mL untuk diencerkan lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang
ketiga ini diambil 0,1 mL untuk disebarkan pada suatu medium padat, kemungkinan
besar kita akan mendapatkan beberapa koloni yang akan tumbuh dalam mdium
tersebut, akan tetapi mungkin juga kita hanya akan memperoleh satu koloni saja.
Dalam hal yang demikian ini dapat kita jadikan piaraan murni. Jika kita belum
yakin, Bahwa koloni tunggal yang kita peroleh tersebut merupakan koloni yang
murni, maka kita dapat mengulang pengenceran dengan menggunakan koloni ini
sebagai sampel.

Gambar 14 Metode pengenceran
2. Dengan penuangan
Robert Koch (1843- 1905) mempunyai metode yang lain, yaitu dengan mengambil
sedikti sampel campuran bakteri yang mudah diencerkan, dan sampel ini kemudian
di sebar di dalam suatu medium yang terbuat dari kaldu dan gelatin encer. Dengan
demikian dia memperoleh suatu piaraan adukan. Setelah medium tersebut mengental
maka selang beberapa jam kemudian nampaklah koloni- koloni yang masing-
masing dapat dianggap murni. Dengan mengulang pekerjaan di atas, maka akhirnya
akan diperoleh piaraan murni yang lebih terjamin.
Gambar 15. Metode Tuang

Ada beberapa metode yang biasanya dilakukan untuk menanam biakan di dalam
medium diantaranya adalah (Lay, 1994) :
1. Metode cawan gores
Metode ini mempunyai dua keuntungan yaitu menghemat bahan dan waktu. Namun
untuk memperoleh hasil yang baik diperlukan keterampilan yang lumayan yang
biasanya diperoleh dari pengalaman. Metode cawan gores yang dilakukan dengan
baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya mikroorganisme yang diinginkan.
Dua macam kesalahan yang umum sekali dilakukan adalah tidak memanfaatkan
permukaan medium dengan sebaik- baiknya untuk digores sehingga pengenceran
mikroorganisme menjafi kurang lanjut dan cenderung untuk menggunakan
inokulum terlalu banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel- sel yang digores

Gambar 15. Bentuk Alur Goresan pada Cawan Petri
2. Metode cawan tuang
Cara lain untuk mempeeroleh biakan koloni murni dari populasi campuran
mikroorganisme ialah dengan mengencerkan eksperimen dalam medium agar yang
telah dicairkan dan didinginkan yang kemudian di cawankan. Karena konsentrasi
sel- sel mikroba di dalam eksperimen pada umumnya tidak diketahui sebelumnya,
maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap sehingga sekurang- kurangnyya
satu di antara cawan – cawan tersebut mengandung koloni- koloni terpisah baik di
atas permukaan maupun di dalam agar. Metode ini memboroskan waktu dan bahan
namun tidak memerlukan keterampilan yang terlalu tinggi.

Proses pemisahan/pemurnian dari mikroorganisme lain perlu dilakukan karena
semua pekerjaan mikrobiologis, misalnya telaah dan identifikasi mikroorganisme,
memerlukan suatu populasi yang hanya terdiri dari satu macam mikroorganisme saja.
Teknik tersebut dikenal dengan Isolasai Mikroba. Terdapat berbagai cara mengisolasi
mikroba, yaitu (Admin, 2008) :
1) Isolasi pada agar cawan
Prinsip pada metode isolasi pada agar cawan adalah mengencerkan mikroorganisme
sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari organisme lainnya.
Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada cawan tersebut setelah inkubasi
berasal dari satu sel tunggal. Terdapat beberapa cara dalam metode isolasi pada agar
cawan, yaitu: Metode gores kuadran, dan metode agar cawantuang.Metode gores
kuadran. Bila metode ini dilakukan dengan baik akan menghasilkan terisolasinya
mikroorganisme, dimana setiap koloni berasal dari satusel.
Metode agar tuang. Berbeda dengan metode gores kuadran, cawan tuang
menggunakan medium agar yang dicairkan dan didinginkan (50oC), yang kemudian
dicawankan. Pengenceran tetap perlu dilakukan sehingga pada cawan yang terakhir
mengandung koloni-koloni yang terpisah di atas permukaan/di dalamcawan.
2) Isolasi pada medium cair
Metode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat tumbuh
pada agar cawan (medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur cair.
Metode ini juga perlu dilakukan pengenceran dengan beberapa serial pengenceran.
Semakin tinggi pengenceran peluang untuk mendapatkan satu sel semakin besar.

3) Isolasi sel tunggal
Metode isolasi sel tunggal dilakukan untuk mengisolasi sel mikroorganisme
berukuran besar yang tidak dapat diisolasi dengan metode agar cawan/medium cair.
Sel mikroorganisme dilihat dengan menggunakan perbesaran sekitar 100 kali.
Kemudian sel tersebut dipisahkan dengan menggunakan pipet kapiler yang sangat
halus ataupun micromanipulator, yang dilakukan secara aseptis.
III. ALAT DAN BAHAN

1. Alat
- cawan petri
– Bunsen
- Enkas
- Ikubator
- Ose
- Mikropipet
- Autoklaf
- Tabung reaksi
- Erlenmeyer
2. Bahan
Biakan Escherichia coli, Biakan Bacillus subtilis, Biakan Aspergillus niger, medium
nutrient agar padat, Medium NB cair, Medium PDNA, Aquadest, Spiritus, alkohol, swab
dan korek api.
IV. CARA KERJA

A. Isolasi mikroorganisme dari substrak cair
- Cawan petri yang berisi medium NA diberi label masing- masing sesuai
perlakuan. Lalu memasukkannya kedalam enkas atau didekatkan Bunsen
bersama dengan Biakan Escherichia coli, Bacillus subtilis.
- Sebelum melakukan pengerjaan dalam enkas atau di dekat bunsen, terlebih
dahulu mensterilkan tangan dengan mengunakan alkohol 70%.
- Mengambil masing- masing biakan bakteri dengan menggunakan mikropipet
sebanyak 0,1 mL, lalu diratakan pada permukaan medium dengan
menggunakan batang L atau digoyang halus.
- Melidahapikan mulut/ pinggir cawan petri dengan maksud agar bakteri yang

melekat mati
- Kemudian membungkus cawan petri dengan menggunakan kertas lalu
menginkubasi ke dalam inkubator selama 24- 48 jam. Mengamti koloni yang
tumbuh.
B. Isolasi Bakteri dari Ekstrak Padat pada Agar miring

- 4 buah tabung reaksi yang masinng- masing berisi 2 medium NA dan 2
Medium PDA agar miring disiapkan dan dimasukkan ke dalam enkas atau
diletakkan di dekat Bunsen yang menyala, setelah diberi label.
- Sebelum melakukan pengerjaan inokulasi, terlebih dahulu mensterilkan tangan
dengan mengunakan alkohol 70%.
- Dengan menguunakan ose bulat, mengambil biakan bakteri dan masing-
masing digoreskan secara zig- zag pada medium agar miring lalu di tututp
- Membungkus tabung reaksi dengan kertas dan menginkubasinya selama 24-
72 jam dan mengamati masing- masing perbedaannya
C. Isolasi Bakteri dari Ekstrak Padat pada Agar cawan

- 4 buah cawan petri yang masinng- masing berisi 2 medium NA dan 2 Medium
PDA disiapkan dan dimasukkan ke dalam enkas atau diletakkan di dekat
Bunsen yang menyala, setelah diberi label.
- Sebelum melakukan pengerjaan inokulasi, terlebih dahulu mensterilkan tangan
dengan mengunakan alkohol 70%.
- Dengan menguunakan ose bulat, mengambil biakan bakteri dan masing-
masing digoreskan secara zig- zag pada medium agar cawan lalu di tututp

V. ANALISIS DATA

VI. KESIMPULAN
VII. DAFTAR PUSTAKA
VIII. LAMPIRAN
ASISTEN PRAKTIKAN
(……….……………) (……….……………)

JUDUL III
ENUMERASI
I. TUJUAN
1. Melakukan percobaan perhitungan jumlah sel melalui metode Colony Unit Form
(CFU)
2. Mengetahui enumerasi dengan cara pengenceran
3. Menghitung jumlah sel bakteri pada air sampel
4. Membandingkan jumlah sel bakteri pda setiap air sampel
5. Mengetahui air yang paling bersih dan yang paling buruk dari air sampel.
II. DASAR TEORI
Penghitungan jumlah bakteri dengan metode Plate Count (hitungan cawan)

Plate count / viable count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel
mikroorganisme hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah
ditumbuhkan dalam media pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai. Setelah
diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau dugaan
dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut.
Koloni yang tumbuh tidak selalu berasal dari satu sel mikroorganisme karena
beberapa mikroorganisme tertentu cenderung membentuk kelompok atau berantai.
Berdasarkan hal tersebut digunakan istilah Coloni Forming Units (CFU’s) per ml.
koloni yang tumbuh berasal dari suspensi yang diperoleh menggunakan pengenceran
bertingkat dari sebuah sampel yang ingin diketahui jumlah bakterinya.
Syarat koloni yang ditentukan untuk dihitung adalah sebagai berikut “
- Satu koloni dihitung 1 koloni.
- Dua koloni yang bertumpuk dihitung 1 koloni.
- Beberapa koloni yang berhubungan dihitung 1 koloni.
- Dua koloni yang berhimpitan dan masih dapat dibedakan dihitung 2 koloni.
- Koloni yang terlalu besar (lebih besar dari setengah luas cawan) tidah dihitung.
- Koloni yang besarnya kurang dari setengah luas cawan dihitung 1 koloni.
Cara menghitung sel relatif / CFU’s per ml

CFU’s / ml = jumlah koloni X faktor pengenceran
Misal : penanaman dilakukan dari tabung pengenceran 10 -6 dengan
metode Spread Plate dan Pour Plate.
Prosedur perhitungan jumlah bakteri dengan metode Plate Count.
Lakukan preparasi suspensi kepada sampel terlebih dahulu (swab, maserasi dan rinse)
(jika perlu).
Masukkan sampel ke tabung berisi 9 ml akuades untuk pengenceran pertama,
selanjutnya diencerkan sampai tingkat pengenceran (misalnya sampai 10-8) tertentu.
Dari 3 pengenceran terakhir diplating (ditanam) ke media NA (Nutrien Agar) atau
PCA (Plate Count Agar) sebanyak dua kali tiap pengenceran (duplo). Plating dapat
secara Spread Plate atau Pour Plate. Jika secara Spread Plate, dapat digunakan
batang L atau glass beads.
Inkubasi pada suhu 30º C selama 1-2 x 24 jam.
Setelah tumbuh, koloni dihitung dengan persyaratan yang telah diuraikan di depan.
Penghitungan koloni pada cawan sebaiknya dibuat transek atau dibagi-bagi jika
koloni yang tumbuh terlalu banyak. Transek dibuat dengan spidol/marker di bagian
bawah cawan petri. Pola transek dapat dibuat bervariasi, tergantung kebutuhan.
Penghitungan akan lebih mudah bila memakai Coloni Counter.

III. ALAT DAN BAHAN
a. Alat
Alat Jumlah
Bunsen 1
Gelas ukur 1
Tabung reaksi 8
Rak tabung reaksi 1
Pipet mikro 1
Cawan petri 4
Segitiga perata 1
Incubator 1
Lemari pendingin 1
b. Bahan
Bahan Jumlah
Alcohol 70% Secukupnya
Kertas buram 4 lembar
Media NA 4 buah cawan petri
Korek Api Secukupnya
Kertas label Secukupnya
Air sampel 1 ml
IV. CARA KERJA

1. Mensterilkan tempat praktikum dan kedua tangan praktikan dengan alcohol 70%
2. Menyiapkan air sampel yang digunakan serta media NA
3. Mengencerkan air sampel sampai tingkat konsentrasi mencapai 10-6 dan 10-8
dengan menggunakan aquades.
4. Mengambil media NA yang telah disiapkan, kemudian mendekatkan dengan
bunsen dan diputar-putar.
5. Mengambil 1 ml air sample dengan pipet mikro, kemudian meneteskan ke dalam
media NA dalam kondisi dekat dengan api bunsen
6. Meratakan dengan menggunakan segitiga perata yangs ebelumnya dimasukkan
ke dalam alcohol 70% agar steril.
7. Melakukan hal yang sama untuk pengenceran 10-8,

8. Membungkus cawan petri dengan menggunakan kertas buram dan diberi label
pada pembungkus kertas.
9. Masukkan ke dalam incubator selama 24 jam
10. Kemudian memasukkan ke dalam lemari pendingin dan melakukan pengamatan
menghitung jumlah koloni bakteri selama 4 hari berturut-turut.
11. Bandingkan sample terbaik dan terburuk.
V. ANALISIS DATA

VI. KESIMPULAN
VII. DAFTAR PUSTAKA
VIII. LAMPIRAN
ASISTEN PRAKTIKAN
(……….……………) (……….……………)

JUDUL IV
PENGARUH LINGKUNGAN TERHADAP PERTUMBUHAN

MIKROORGANISME
I. TUJUAN
1. Mengetahui pengaruh suhu terhadap pertumbuhan mikroorganisme
2. Mengetahui pengaruh pH terhadap pertumbuhan mikroorganisme
3. Mengetahui pengaruh pemberian antbiotik terhadap pertumbuhan
mikroorganisme
4. Membandingkan pertumbuhan koloni pada lingkungan yang berbeda
II. DASAR TEORI

Pengaruh suhu terhadap pertumbuhan mikroorganisme
Berdasarkan suhu optimum untuk pertumbuhan maka dapat dikelompokan menjadi 3
yaitu: 1. psikrofilik(0-200C),
2. mesofilik Mesofilik (20-300C),
3. termofilik (50-1000C).
Suhu merupakan faktor lingkungan yang sangat menentukan kehidupan
mikroorganisme, pengaruh suhu berhubungan dengan aktivitas enzim. Suhu rendah
menyebabkan aktiivtas enzim menurun dan jika suhu terlalu tinggi dapat mendenaturasi
protein enzim.
Cara Kerja :
8x2 tabung yang berisi Nutrient Broth untuk
suhu inkubasi 50C, 250C, 370C, dan 500C dan

mikroorganisma yang berbeda (E.coli dan
Bacillus sp.) diberi label . Setelah diinokulasi
dengan bekteri yang berbeda, diinkubasi sesuai
suhu yang tertera
setelah ditumbuhkan selama 48 jam,
bandingkan derajat kekeruhannya.

Pengaruh pH terhadap pertumbuhan mikroorgansime
pH berpengaruh terhadap sel dengan mempengaruhi metabolisme, pada umumnya
bakteri tumbuh dengan baik pada pH netral (7,0). Berdasarkan nilai pH yang dibutuhkan
untuk kehidupannya dikenal 3 kelompok mikroorganisme yaitu :
1. Acidofilik,
2. Mesofilik/Neutrofilik dan
3. Basofilik
Cara Kerja :
Buatlah tabung reaksi berisi NB dan atur pH-nya (pH 3, 7 dan 9) masing-masing 2
tabung untuk tiap nilai pH
Labeli dengan nama bakteri yang akan diinokulasikan
Inokulasi tiap tabung dengan Bacillus sp dan E.coli lalu diinkubasi pada suhu 370C
selama 48 jam
Amati perbedaan kekeruhan pada tiap nilai pH
Pengaruh Antiobiotik terhadap pertumbuhan mikroorganisme.
Zat antimikroba adalah senyawa yang dapat membunuh atau menghambat pertumbuhan
mikroorganisme. Zat antimikroba dapat bersifat membunuh mikroorganisme (microbicidal) atau
menghambat pertumbuhan mikroorganisme (microbiostatic). Disinfektan yaitu suatu
senyawa kimia yang dapat menekan pertumbuhan mikroorganisme pada permukaan
benda mati seperti meja, lantai dan pisau bedah. Adapun antiseptik adalah senyawa

kimia yang digunakan untuk menekan pertumbuhan mikroorganisme pada jaringan
tubuh, misalnya kulit. Efisiensi dan efektivitas disinfektan dipengaruhi oleh beberapa
faktor yaitu:
Konsentrasi
Waktu terpapar
Jenis mikroba
Kondisi lingkungan: temperatur, pH dan jenis tempat mikroba hidup
Pengertian dan Jenis Antibiotik

Antibiotik adalah bahan yang dihasilkan oleh mikroorganisme atau sintetis yang dalam
jumlah kecil mampu menekan menghambat atau membunuh mikroorganisme lainnya.
Antibiotik memiliki spektrum aktivitas antibiosis yang beragam.
Antibiotik dikelompokkan berdasarkan gugus aktifnya, misal antibiotic macrolide,
antimikroba peptida. Adapun penamaannya biasanya berdasarkan gugus kimiawinya
ataupun mikroorganisma produsernya, misalnya:
ragam antibakteria:
Penicillin dan cephalosporin
Erythromycine
Sulfa drugs
Trimethoprim dan sulfamethoxazole
Polymyxin B
Quinolone
Tetracycline
Antifungi :
Nystatin
Azoles

Mekanisme kerja antibiotik antara lain :
Menghambat dsintesis dinding sel
Merusak permeabilitas membran sel.
Menghambat sintesis RNA (proses transkripsi)
Menghambat sintesis protein (proses translasi).
Menghambat replikasi DNA.
Prosedur difusi-kertas cakram-agar yang distandardisasikan (metode Kirby-Bauer)

merupakan cara untuk menentukan sensitivitas antibiotik untuk bakteri. Sensitivitas
suatu bakteri terhadap antibiotik ditentukan oleh diameter zona hambat yang terbentuk.
Semakin besar diameternya maka semakin terhambat pertumbuhannya, sehingga
diperlukan standar acuan untuk menentukan apakah bakteri itu resisten atau peka
terhadap suatu antibiotik.
Faktor yang mempengaruhi metode Kirby-Bauer :
- Konsentrasi mikroba uji
- Konsentrasi antibiotik yang terdapat dalam cakram
- Jenis antibiotik.
- pH medium
Cara kerja pengujian antibiotik dengan metode Kirby-Bauer :
Celupkan cotton bud (cotton swab) dalam biakan bakteri kemudian tekan kapas ke
sisi tabung agar air tiris

Ulaskan pada seluruh permukaan cawan Mueller-Hinton Agar secara merata
Biarkan cawan selama 5 menit
Kertas cakram dicelupkan dalam larutan antibiotik dengan konsentrasi tertentu.
Angkat, biarkan sejenak agar tiris, selanjutnya letakkan kertas cakram pada
permukaan agar.
Kertas cakram ditekan menggunakan pinset supaya menempel sempurna di
permukaan agar.
Inkubasi pada suhu 37 0C selama 24-48 jam.
Ukur diameter zona hambat (mm) kemudian bandingkan dengan table sensitivitas
antibiotik.

Cara menginterpretasikan :
Ukur diameter zona hambat (zona jernih). Misal didapatkan zona hambat suatu bakteri
berdiameter 26 mm untuk Eryhtromycin.
Maka interpretasinya adalah bakteri tersebut peka terhadap antibiotic Eryhtromycin.
Resistent : tahan
Intermediate : medium
Susceptible : peka
III. ALAT DAN BAHAN

Alat
Nama Jumlah
Cawan petri 7
Jarum ose 1
Bunsen 1
Incubator 1
Kulkas 1
Bahan
Nama Jumlah
Medium NA kondisi asam, basa dan Secukupnya
netral
Bakteri Bacillus sp Secukupnya
Bakteri E.Coli Secukupnya
Kertas buram Secukupnya
Kertas label Secukupnya
Korek api Secukupnya
Antibiotic Secukupnya
Alcohol 70% Secukupnya
IV. CARA KERJA

A. Pengaruh Suhu
1. Menyiapkan 3 cawan petri yang berisi medium NA dengan PH netral
2. Menginokulasi bakteri Bacillus sp pada masing-masing media

3. Membungkus media dengan kertas buram
4. Melabeli masing-masing cawan petri sesuai dengan suhu
5. Menempatkan masing-masing cawan petri tsb pada suhu yang berbeda yaitu
suhu panas, dingin dan kamar
6. Mengamati pertumbuhan bakteri setiap hari selama 3 hari
7. Mencatat dan menggambarkan hasil pada laporan sementara
B. Pengaruh PH
1. Menyiapkan 3 cawan petri yang berisi medium NA dengan pH netral (7), pH
asam (4) dan pH basa (9)
4. Melabeli masing-masing cawan petri sesuai dengan pH
5. Menempatkan masing-masing cawan petri tsb pada suhu kamar
C. Pengaruh antibiotic
1. Menyiapkan 1 cawan petri yang berisi medium NA dengan PH netral
3. Menempatkan antibiotic pada goresan bakteri
5. Melabeli masing-masing cawan petri sesuai dengan suhu
6. Menempatkan masing-masing cawan petri tsb pada suhu yang berbeda yaitu
suhu panas, dingin dan kamar

V. ANALISIS DATA

VI. KESIMPULAN
VII. DAFTAR PUSTAKA
VIII. LAMPIRAN
ASISTEN PRAKTIKAN
(……….……………) (……….……………)

JUDUL V
KOLOM WINOGRADSKY
I. TUJUAN
1. Mengamati dan menjelaskan perubahan warna dan stratifikasi pada kolom
winogradsky.
2. Mengetahui jenis-jenis mikroorganisme yang mampu hidup di setiap lapisan
winogradsky.
II. DASAR TEORI
Salah satu kelompok makhluk hidup di atas yang penting dalam pembuatan
produk primer dan berperan dalam decomposer senyawa organic dan anorganik adalah
bakteri. Bakteri yang biasa ditemukan dalam lingkungan akuatik dimana dalam kondisi
an aerobic dan cahaya adalah bakteri fotosintetik, ungu dan hijau. Bakteri fotosintetik
mampu mendekomposisi senyawa senyawa organic dengan bantuan sinar matahari
menjadi O2, H2 dan senyawa organic sederhana di mana senyawa organic ini mampu
menyediakan sumber karbon untuk flora sekunder dari bakteri pereduksi sulfur. Bakteri
pereduksi sulfur selama respirasi anaerob akan menghasilkan H2S dan CasO4 yang
disuplementasi. H2S yang terbentuk merupakan sumber tenaga pereduksi bagi bakteri
fotosintetik sulfur jika tumbuh dalam kondisi ada cahaya. Salah satu cara yang
dikembangkan dalam mempelajari bakteri fotosintetik adalah kolom Winogradsky
(19880. Kolom ini merupakan kultur yang terdiri bahan tanaman dan lapisan-lapisan
lumpur yang digenangi air.
Penerapan hasil metaboliisme tersebut berhasil dibuktikan oleh Winogradsky

dengan kolom yang terdiri dari beberapa zone dengan habitat dan lingkungan yang
terkendali.

Zona aerobik
Zona mikroaerobik
Tumbuh bakteri non sulfur fotosintetik (pirang)
Zona Tumbuh bakteri non sulfur anaerob

anaerobik
Pengaturan ke dalam bentuk sampel ke dalam wadah yang bersih di campur

air dan disegel. Proses seleksi alam terhadap pertumbuhan mikroorganisme fotosintetik
selalu stabil dan didalamnya dengan sedikit O2 sampai terdapat banyak racun.
Kebanyakan dari berbagai macam spesies terjadi pola tingkat level yang berbeda pada
kolom. Interaksi dan hubungan timbale balik antara spesies yang berbeda mungkin
dapat dilihat. Gambaran kuadran O2 dalam suatu percobaan Winogradsky yaitu:
2H
Daerah bebas O2 aerob
Daerah pengurangan O2 fakultatif O2 dan-2H akseptor selain O2
anaerob
Daerah terbatas O2 -2H akseptor selain O2
Agar mikrobia dapat bertahan hidup selama masa pembiakan maka harus
ditaruh dalam lingkungan yang berair. Hal ini disebabkan karena kebanyakan bakteri
akan segera mati bila tidak tersedia kelembaban yang memadai.
Berdasasrkan keberadaannya dalam tanah, Winogradsky membaginya dalam

dua kelompok besar yaitu: (1) mikrobia otokton (autochtonous), yakni mikrobia
setempat atau pribumi (indigenous) pada tanah-tanah tertentu dan bersifat endemik,
contohnya Azospirilium halopraeferen yang selalu ditemukan di tanah salin, (2)
mikrobia zymogen, yaitu mikrobia yang pertumbuhannya dipengaruhi oleh adanya
perlakuan khusus seperti penambahan pupuk, bahan organic dan pengelolaan tanah.

Selain itu dikenal juga (3) mikrobia transien, yaitu mikrobia yang keberadaannya di
dalam tanah bersifat sebagai penetap sementara. Mikrobia transien umumnya
merupakan mikrobia yang diintrodusir ke dalam tanah baik sengaja maupun tidak
disengaja. Mikrobia ini kemungkinan juga bertahan untuk sementara waktu di dalam
tanah
III. BAHAN DAN ALAT

Bahan:
1. Pasir laut
2. Pasir sungai
3. Lumpur
4. Air laut
5. Air Sumur
6. Alumunium foil
7. Kuning Telur
8. CaCO3
9. Kertas Koran
10. Kertas label
Alat:
1. Kolom Winogradsky
2. Gelas Beker
3. Penggaris
4. Pengaduk
5. Timbangan analitik
IV. CARA KERJA

1. Menyiapkan dua buah kolom Winogradsky.
2. Tabung pertama diisi dengan campuran pasir pantai dengan 2 gram CaCO3 dan satu
kuning telur.
3. Tabung kedua diisi dengan campuran lumpur sungai dengan 2 gram CaCO3 dan
satu kuning telur.
4. Campuran tersebut dimasukkan dan dipadatkan hingga tidak ada rongga udara
dengan tinggi 5 cm.
5. Kertas koran dipotong-potong dibasahi dengan air hingga menjadi bubur koran dan
dimasukkan ke dalam tabung, lalu dipadatkan hingga tidak ada rongga udara
dengan tinggi 3 cm.
6. Pasir laut dimasukkan ke dalam tabung dengan hati-hati melalui dinding tabung
hingga tingginya 12 cm.

7. Tabung ditutup dengan rapat menggunakan alumunium foil.
8. Tabung ditempatkan pada tempat yang cukup mendapat sinar matahari.
9. Diamati setiap seminggu selama 3 minggu.
V. ANALISIS DATA

VI. KESIMPULAN
VII. DAFTAR PUSTAKA
VIII. LAMPIRAN
ASISTEN PRAKTIKAN
(……….……………) (……….……………)

JUDUL VI
PEMBUATAN NATA
I. TUJUAN
1. Mengetahui cara pembuatan nata dari berbagai substrat
2. Mengukur tebal nata pada berbagai macam substrat
3. Membandingkan tebal nata pada berbagai macam substrat
II. DASAR TEORI
Nata merupakan makanan pencuci mulut (desert). Nata adalah makanan yang
banyak mengandung serat, mengandung selulosa kadar tinggi yang bermanfaat bagi
kesehatan dalam membantupencernaan.
Kadungan kalori yang rendah pada Nata merupakan pertimbangan yang tepat
produk Nata sebagai makan diet. Dari segi penampilannya makanan ini memiliki nilai
estetika yang tinggi, penampilan warna putih agak bening, tekstur kenyal, aroma segar.
Dengan penampilan tersebut maka nata sebagai makanan desert memiliki daya tarik
yang tinggi. Dari segi ekonomi produksi nata menjanjikan nilai tambah. Pembuatan
nata yang diperkaya dengan vitamin dan mineral akan mempertinggi nilai gizi dari
produk ini.
Nata dibentuk oleh spesies bakteri asam asetat pada permukaan cairan yang
mengandung gula, sari buah, atau ekstrak tanaman lain. Beberapa spesies yang termasuk
bakteri asam asetat dapat membentuk selulosa, namun selama ini yang paling banyak
dipelajari adalah Acetobacter xylinum. Bakteri Acetobacter xylinum termasuk genus
Acetobacter. Bakteri Acetobacter xylinum bersifat Gram negatip, aerob, berbentuk
batang pendek atau kokus.
Pemanfaatan limbah pengolahan kelapa berupa air kelapa merupakan cara
mengoptimalkan pemanfaatan buah kelapa. Limbah air kelapa cukup baik digunakan
untuk substrat pembuatan Nata de Coco. Dalam air kelapa terdapat berbagai nutrisi
yang bisa dimanfaatkan bakteri penghasil Nata de Coco. Nutrisi yang terkandung dalam
air kelapa antara lain : gula sukrosa 1,28%, sumber mineral yang beragam antara lain

Mg2+ 3,54 gr/l, serta adanya faktor pendukung pertumbuhan (growth promoting factor)
merupakan senyawa yang mampu meningkatkan pertumbuhan bakteri penghasil nata
(Acetobacter xylinum).
Adanya gula sukrosa dalam air kelapa akan dimanfaatkan oleh Acetobacter
xylinum sebagai sumber energi, maupun sumber karbon untuk membentuk senyawa
metabolit diantaranya adalah selulosa yang membentuk Nata. Senyawa peningkat
pertumbuhan mikroba (growth promoting factor) akan meningkatkan pertumbuhan
mikroba, sedangkan adanya mineral dalam substrat akan membantu meningkatkan
aktifitas enzim kinase dalam metabolisme di dalam sel Acetobacter xylinum untuk
menghasilkan selulosa.
Pemeliharaan Kultur Murni Acetobacter xylinum
Biakan atau kultur murni Acetobacter xylinum yang diperoleh ditumbuhkan

pada media Hassid Barker. Koleksi kultur dapat dalam bentuk kering beku dalam
ampul, maupun dalam bentuk goresan dalam agar miring (slant agar). Koleksi kultur
dalam bentuk kering beku dalam ampul dapat bertahan hidup bertahun-tahun tanpa
peremajaan. Sedangkan koleksi kultur dalam agar miring perlu peremajaan setiap 2-3
bulan. Kebanyakan koleksi kultur pemeliharaannya dengan cara peremajaan dilakukan
pada media agar miring.
Pemeliharaan koleksi kultur yang dimiliki dapat dilakukan dengan cara:
pembuatan media Hassid Barker Agar (HBA) dalam tabung reaksi dan peremajaan
kultur setiap 2-3 bulan. Komposisi media HBA adalah sebagai berikut: sukrosa 10%,
(NH4)2SO4 0,6 g/L, K2HPO4 5,0 g/L, ekstrak khamir 2,5 g/L 2 % asam asetat glasial,
agar difco 15 g/L . Media HBA dimasukkan kedalam tabung reaksi dan disterilkan
dalam autoclave 121 oC, 2 atm, selama 15 menit. Media dalam tabung reaksi masih
panas diletakkan mring hingga membeku untuk menghasilkan media agar miring.
Peremajaan dapat dilakukan dengan cara menggoreskan 1 ose kultur kedalam media
agar miring yang telah dipersiapkan. Kutur baru diinkubasi pada suhu kamar, selama 2-
3 hari. Kultur akan tumbuh pada media HBA miring dengan bentuk sesuai alur goresan.
Kultur yang terlah diremajakan siap untuk kultur kerja, dan sebagian disimpan untuk
kultur simpan atau kultur stok (Stock Culture).

Sustrat adalah media pertumbuhan bakteri Acetobacter xylinum, bentuk cair
yang didalamnya mengandung nutrisi yang diperlukan untuk pertumbuhan Acetobacter
xylinum, untuk menghasilkan Nata. Cara penyiapan substrat untuk pembuatan Nata
dengan bahan baku air kelapa atau sari buah yang lain ádalah sebagai berikut; air kelapa
atau sari buah yang lain disaring dengan menggunakan kain saring bersih. Ke dalam
substrat ditambahkan sukrosa (gula pasir) sebanyak 10% (b/v). Gula ditambahkan
sambil dipanaskan, diaduk hingga homogen. Urea (sebanyak 5 gram urea untuk setiap 1
liter substrat bergula yang disiapkan) ditambahkan dan diaduk sambil didihkan. Substrat
ini didinginkan, kemudian ditambah asam acetat glacial (asam cuka ) sebanyak 2% atau
asam cuka dapur 25% (16 ml asam asetat untuk setiap 1 liter air kelapa). Substrat
disterilkan dengan cara dimasukkan dalam outoclave pada suhu 121 oC, tekanan 2 atm,
selama 15 menit (atau didihkan selama 15 menit).
Penyiapan Starter
Starter adalah bibit Acetobacter xylinum yang telah ditumbuhkan dalam substrat
pertumbuhan kultur tersebut sehingga populasi bakteri Acetobacter xylinum mencapai
karapatan optimal untuk proses pembuatan nata, yaitu 1 x 109 sel/ml. Biasanya
kerapatan ini akan dicapai pada pertumbuhan kultur tersebut dalam susbtrat selama 48
jam (2 hari).
Penyiapan starter adalah sebagai berikut: substrat disterilkan dengan outoclave

atau dengan cara didihkan selama 15 menit. Setelah dingin kira-kira suhu 40 oC,
sebanyak 300 ml dimasukkan ke dalam botol steril volume 500 ml. Substrat dalam botol
steril diinokulasi (ditanami bibit bakteri Acetobacter xylinum) sebanyak 2 ose (kira-kira
2 pentol korek api), bibit Acetobacter xylinum. Substrat digojog, sebaiknya
menggunakan shaker dengan kecepatan 140 rpm (secara manual digojog setiap 2-4
jam). Starter ditumbuhkan selama 2 hari, pada suhu kamar.
Fermentasi
Fermentasi adalah suatu proses pengubahan senyawa yang terkandung di dalam substrat
oleh mikroba (kulture) misalkan senyawa gula menjadi bentuk lain (misalkan
selulosa/Nata ), baik merupakan proses pemecahan maupun proses pembentukan dalam
situasi aerob maupun anaerob. Jadi proses fermentasi bisa terjadi proses katabolisme
maupun proses anabolisme.

Fermentasi substrat air kelapa yang telah dipersiapkan sebelumnya prosesnya sebagai
berikut; substrat air kelapa disterilkan dengan menggunakan outoclave atau dengan cara
didihkan selama 15 menit. Substrat didinginkan hingga suhu 40oC. Substrat
dimasukkan pada nampan atau baskom steril dengan permukaan yang lebar, dengan
kedalaman substrat kira-kira 5 cm. Substrat diinokulasi dengan menggunakan starter
atau bibit sebanyak 10 % (v/v). Substrat kemudian diaduk rata, ditutup dengan
menggunakan kain kasa. Nampan diinkubasi atau diperam dengan cara diletakan pada
tempat yang bersih, terhindar dari debu, ditutup dengan menggunakan kain bersih untuk
menghindari terjadinya kontaminasi. Inkubasi dilakukan selama 10 – 15 hari, pada suhu
kamar. Pada tahap fermentasi ini tidak boleh digojok. Pada umur 10-15 hari nata dapat
dipanen.
III. ALAT DAN BAHAN

Bahan:
1. Biakan Acetobacter xilinum
2. Gula pasir
3. Urea
4. Substrat (air kelapa, air siwalan, air jambu, air nanas, ampas tahu, air leri, aloe
vera, dll)
5. Air
6. Karet gelang
7. Kertas label
8. Asam cuka
9. Ekastrak tauge
Alat:
1. Kompor
2. Panic+tutup
3. Pengaduk
4. Toples+tutup
5. Saringan
6. Wadah
7. Blender
8. Pisau
9. Gelas ukur
10. Selotipe besar

IV. CARA KERJA
1. Substrat buah masing-masing bahan dikupas, dibersihkan, dipotong-potong dan
dimasukkan dalam blender lalu dihaluskan kemudian ditambahkan sedikit air agar
cepat halus.
2. Substrat disaring sehingga diperoleh substrat yang tidak berampas.
3. Substrat masing-masing bahan diambil 500 ml dimasukkan ke dalam panci
kemudian direbus dan ditambahkan 50 gr gula pasir 50 ml sari tauge.
4. Substrat yang telah mendidih dituang dalam wadah.
5. Setelah dingin ditambahkan cuka 15 ml dan ditambahkan 50 ml Acetobacter
xilinum sambil diaduk-aduk.
6. Memasukkan campuran tersebut ke dalam toples dan ditutup rapat dengan penutup
dan selotip.
7. Disimpan + 1 bulan pada suhu 20-25◦C.
8. Setelah 1 bulan diamati dan diukur tebal nata yang terbentuk
V. ANALISIS DATA

VI. KESIMPULAN
VII. DAFTAR PUSTAKA
VIII. LAMPIRAN
ASISTEN PRAKTIKAN
(……….……………) (……….……………)

JUDUL VIII
PEMBUATAN YOGURT
I. TUJUAN
1. Mengetahui cara pembuatan yoghurt berbahan dasar susu skim dengan campuran
bakteri Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophylus.
2. Menguji kualitas produk yoghurt dengan uji organoleptik.
3. Mengetahui tingkat keasaman (pH) yoghurt selama masa penyimpanan serta
mengetahui kadar asam laktat selama masa penyimpanan.
II. DASAR TEORI

Yogurt Berbahan Dasar Susu
Susu dapat dimanfaatkan oleh mikroorganisme sebagai substrat
pertumbuhannya. Aktivitas mikroorganisme menyebabkan terjadinya perubahan pada
susu baik yang diinginkan maupun yang tidak diinginkan. Yoghurt merupakan salah
satu produk olahan susu dengan memanfaatkan aktivitas mikroorganisme yang dikenal
dengan istilah fermentasi. Tujuan dari proses fermentasi adalah memperpanjang umur
simpan, penganekragaman produk, meningkatkan nilai gizi dan daya cerna, dan
menghasilkan kartakteristik rasa, aroma, dan tekstur yang diinginkan serta
menguntungkan bagi kesehatan. Dalam industri persusuan, susu yang difermentasi
dihasilkan dengan cara menginokulasikan susu yang telah dipasteurisasi dengan suatu
biakan mikroorganisme yang diketahui, yang kadang-kadang disebut starter kultur yang
dapat diandalkan untuk menghasilkan fermentasi yang dikehendaki sehingga menjamin
dihasilkannya produk yang baik dan seragam (Pelczar dan Chan, 1988).
Yogurt merupakan salah satu produk olahan susu fermentasi yang memiliki
tingkat nutrisi yang tinggi. Hasil olahan susu ini berbentuk seperti bubur yang kental,
dan biasanya dibuat dari bahan dasar susu segar maupun susu skim yang tanpa lemak.
Starter yang digunakan adalah bakteri asam laktat Lactobacillus bulgaricus dan
Streptococcus thermophillus dengan perbandingan yang sama. Karena digunakan
bakteri laktat yang mampu memproduksi asam laktat, maka produk yang terbentuk
berupa susu yang menggumpal dengan rasa masam dan mempunyai cita rasa yang khas.

Yoghurt sangat bermanfaat bagi kesehatan diantaranya dapat menurunkan kadar
kolesterol darah, menjaga kesehatan lambung dan mencegah penyakit kanker saluran
pencernaan. Manfaat yang terakhir ini dikarenakan yoghurt mengandung bakteri hidup
sebagai probiotik dari makanan yang menguntungkan bagi mikroflora dalam saluran
pencernaan. Selain itu mengkonsumsi yoghurt membolehkan seseorang yang menderita
kelainan lactoce intolerence seolah mampu mengkonsumsi susu (McLean, 1993).
Lactoce intolerance adalah suatu kelainan dari seseorang yang akan diare setiap minum
susu dikarenakan memiliki kekurangan laktosa dalam usus kecilnya. Laktosa adalah
enzim yang tersebar pada laktosa disakarida di dalam glukosa dan galaktose. Jika
terdapat laktosa tidak dikenal atau tidak diketahui, maka laktosa yang dicerna dalam
usus tetap tinggal pada usus dan sebagai hasil dari osmosis, air bergerak ke usus dan
menyebabkan diare. Pada yoghurt laktosanya telah difermentasikan ke dalam bentuk
asam laktat di mana setiap orang memiliki enzim untuk mencernanya (Ginting dan
Elgustri, 2005).
Gambar 16. Yogurt siap konsumsi.

Berdasarkan komposisinya, yogurt dibedakan menjadi yogurt berkadar lemak
penuh dengan kandungan lemak diatas 3%, yogurt berkadar lemak medium dengan
kandungan lemak 0,5-3%, dan yogurt berkadar lemak rendah bila kandungan lemaknya
kurang dari 0,5% (Noorkomalasari, 2009).
Berdasar metode pembuatannya, jenis yogurt dibagi menjadi dua, yaitu set
yogurt dan stirred yogurt. Bila fermentasi atau inkubasi susu dilakukan dalam kemasan
kecil sehingga gumpalan susu yang terbentuk tetap utuh dan tidak berubah sewaktu
didinginkan atau sampai siap dikonsumsi disebut set yogurt. Sedangkan stirred yogurt
adalah adalah yogurt yang difermentasi dalam kemasan besar, ketika dikemas dalam
wadah yang lebih kecil gumpalan susu akan pecah sebelum pengemasan atau
pendinginan selesai.

Berdasarkan cita rasanya, yogurt dibedakan menjadi yogurt alami atau sederhana
dan yogurt buah. Yogurt alami yaitu yogurt yang tidak ditambah cita rasa sehingga
asamnya tajam. Sedangkan yogurt buah adalah yogurt yang ditambah dengan komponen
cita rasa lain spserti buah-buahan, sari buah, flavor sintetik dan zat pewarna.
Pada pembuatan yoghurt dilakukan proses fermentasi dengan memanfaatkan
bakteri asam laktat misalnya dari golongan Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcuc
thermophilus. Streptococcus thermophilus berkembang biak lebih cepat dan
menghasilkan baik asam maupun CO2. Asam dan CO2 yang dihasilkan tersebut
kemudian merangsang pertumbuhan dari Lactobacillus bulgaricus. Di sisi lain, aktivitas
proteolitik dari Lactobacillus bulgaricus memproduksi peptida penstimulasi dan asam
amino untuk dapat dipakai oleh Sreptococcus thermophilus. Mikroorganisma ini
sepenuhnya bertanggung jawab atas pembentukan tekstur dan rasa yoghurt (Goff,
2003). Temperatur memegang peranan penting bagi pertumbuhan bakteri. Dalam
pengembangbiakannya dengan cara membelah diri, bakteri memerlukan temperatur dan
keadaan lingkungan tertentu sehingga daur hidupnya dapat terus berjalan. Menurut
Eckles (1980) pengaruh temperatur terhadap mikroorganisma dapat digolongkan 3
bagian yaitu temperature rendah yaitu di bawah 10°C, biasanya pertumbuhan
mikroorganisma menjadi lambat pada temperatur ini. Temperatur sedang yaitu 10 –
43°C. Diantara susu ini akan didapati suhu optimum bagi organisme secara mayoritas.
Temperatur tinggi yaitu di atas 43°C. Kebanyakan mikroorganisma mati pada
temperatur sekitar dan di atas 60°C.
III. CARA KERJA
Pembuatan Yogurt
Pembuatan yogurt dengan menggunakan dua jenis starter bakteri yaitu:
Lactobacillus bulgaricus dan Streptococus thermophyllus. Masing-masing starter
bakteri akan diujicobakan pada bahan dasar susu yang berbeda, diantaranya: susu sapi
segar, susu skim, susu full krim, dan susu kambing. Langkah-langkah pembuatan yogurt
mengacu metode yang dilakukan oleh Ginting (2005) yaitu:
(1) Persiapan bahan dasar susu
Siapkan bahan-bahan dasar susu, dan bahan tambahan berupa: gula, perisa
buah, dan penstabil berupa gelatin. Susu yang berupa susu segar dilakukan
pasteurisasi selama 30 menit dengan sushu 60-70 °C agar lebih kental atau lebih

pekat, sedangkan pada susu skim dapat dilarutkan dengan sedikit air dengan
perbandingan susu dan air sebesar 1 : 20. Sedangkan pada susu kental manis bisa
ditambahkan susu skim agar lebih pekat.
(2) Pembuatan Starter
Siapkan inokulum berupa Lactobacillus bulgaricus dan Streptococus
thermophyllus yang masing-masing dibiakkan dalam media susu secara terpisah
dan inkubasi selama 18 jam, kemudian dicampur dengan perbandingan 1: 1 ketika
akan digunakan.
(3) Pembuatan yogurt.
Bahan dasar susu sebelum diinokulasikan dengan starter harus dipanaskan
selama 30 menit pada suhu 85°C, hal ini bertujuan untuk menghilangkan bakteri
lain yang hidup dalam susu agar tidak mengganggu pertumbuhan bakteri asam
laktat, selain itu juga menguapkan kadar air dalam susu agar lebih kental. Setelah
dipasteurisasi, starter ditambahkan sebanyak 2- 5% dari bahan dasar susu yang
digunakan. Inkubasi atau fermentasi yogurt pada suhu 37°C selama 15 jam dalam
keadaan tertutup rapat, setelah 15 jam keluarkan dari ikubator dan simpan dalam
lemari pendingin. Selama inkubasi, susu akan mengalami penggumpalan
disebabkan karena penurunan pH akibat dari aktivitas bakteri asam laktat. Selama
masa inkubasi juga akan terjadi perubahan flavor karena terbentuk asam laktat,
asetal dehid, asam asetat dan diasetil.
(4) Penyimpanan starter
Starter atau bibit yogurt terdiri dari biakan bakteri Lactobacillus bulgaricus dan
Streptoccus thermophillus. Pembuatan bibit untuk yogurt dilakukan secara
bertahap. Pertama, kedua kultur bakteri tersebut dibiakkan dalam susu secara
terpisah. Untuk mempertahankan ketersediaan masing-masing bibit harus
dipindahkan ke dalam medium susu yang baru secara berkala atau kultur tersebut
dikeringbekukan.
(5) Pengamatan kualitas yogurt.
Setelah diikubasi, akan terbentuk gumpalan asam susu yang disebut yogurt. Dari
masing-masing jenis bahan dasar susu untuk yogurt, masing-masing diuji
bagaimana warna, tekstur, rasa (uji organoleptik), dan uji mikrobiologi
(mengetahui aktivitas bakteri pada level temperature tertentu).

IV. ALAT DAN BAHAN
a. BAHAN
· Susu sapi segar sebanyak satu liter
· Biakan murni bakteri Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus
thermophillus.
b. Alat
· Panci email
· Kompor atau alat pemanas lainnya
· pH meter atau kerta pH
· Panci penangas
· Erlenmeyer 500 ml
· Thermometer
· Pengaduk kaca
· Gelas ukur
· Kertas alumunium foil
IX. ANALISIS DATA

X. KESIMPULAN
XI. DAFTAR PUSTAKA
XII. LAMPIRAN
ASISTEN PRAKTIKAN
(……….……………) (……….……………)

JUDUL IX
HIDROLISIS PATI DAN SKIM
I. TUJUAN
1. Mengetahui indeks amilolitik pada media agar + pati dan indeks proteolitik pada
media agar + skim Bacillus sp dan E. Coli
2. Membandingkan kemampuan Bacillus sp dan E. Coli dalam menghidrolisis pati
dan skim
3. Membuktikan bahwa bakteri mampu menghidrolisis pati dan skim
II. DASAR TEORI

Hidrolisis adalah proses penguraian molekul dengan penambahan air. Beberapa
mikroorganisme dapat menyesuaikan diri dengan lingkunganya yang kaya akan molekul
kompleks dengan cara mensekresikan enzim yang disebut co-enzim.
a. Hidrolisis Pati
Salah satu polisakarida yang dapat dihidrolisis oleh mikroorganisme adalah pati.
Hidrolisis pati memeliki hasil akhir berupa dekstrin. Terjadinya hidrolisis pati
disebabkan oleh adanya enzim amylase pada mikroorganisme. Akan tetapi, tidak semua
mikroorganisme memiliki amylase. Dengan demikian, hidrolisis ini dapat sebagai
karakteristik dan dapat dipakai dalam identifikasi (Slamet, 2000 : 15)
Ratna (1999: 143) menambahkan bahwa larutan iodine garam adalah indicator pati.
Bila medium yang mengandung pati diberi larutan iodine, maka tempat-tempat yang
mengandung pati akan terlihat jernih.
b. Hidrolisis Kasein (protein)
Kasein adalah protein pokok pada suatu susu yang merupakan suspense koloid yang
menyebabkan susu terlihat putih mengkilap. Hans (1999 : 20) menambahkan bahwa
pengukuran terhadap garis tengah, lebar akan diperoleh volume. Volume atau berat
jenis jasad renik digunakan dalam proses industri. Selain itu jahad renik tadi dipakai
pula untuk medianya.

Uji Amilolitik
Amilum adalah senyawa yang memiliki berat molekul tinggi, terdiri atas polimer
glukosa yang bercabang-cabang yang diikat dengan ikatan glikosidik. Degradasi
amilum membutuhkan enzim amilase yang akan memecah/menghidrolisis menjadi
polisakarida yang lebih pendek (dextrin), dan selanjutnya menjadi maltosa.
Hidrolisis akhir maltosa menghasilkan glukosa terlarut yang dapat ditransport
masuk ke dalam sel. Indikator yang dipakai pada uji amilolitik adalah iodine. Amilum
akanbereaksi dengan iodine membentuk warna biru hitam yang terlihat pada media.
Prosedur di bawah ini menunjukkan aktivitas amilase. NA yang tersuspensi pati
digunakan sebagai media. Indikator yang dipakai adalah iodine. Amilum akan bereaksi
dengan iodine membentuk komplex warna biru hitam yang terlihat pada media. Warna
biru hitam terjadi jika iodine masuk ke dalam bagian kosong pada amilum yang
berbentuk spiral.
Indeks Amilolitik (IA) = Diameter zona bening
Diameter zona koloni
Uji proteolitik
Uji proteolitik ditujukan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme
menghasilkan enzim protease. Pada praktikum ini protein yang digunakan dalam bentuk
kasein susu. Hidrolisis kasein secara bertahap akan menghasilkan monomernya berupa
asam amino. Proses ini dinamakan peptonisasi atau proteolisis.

Indeks Proteolitik (IP) = Diameter zona bening
Diameter zona koloni
III. ALAT DAN BAHAN
1. ALAT
No Nama Jumlah
1. Cawan petri 4 buah
2. Bunsen 1 buah
3. Jarum ose 1 buah
4. Penggaris 1 buah
5. Simbol 1 buah
2. BAHAN
No Nama Jumlah
1 Media NA + Pati 2 buah
2 Media NA + Skim 2 buah
3 Biakan Bakteri E. coli 1 buah
4 Biakan Bakteri Bacillus sp 1 buah
5 Alkohol Secukupnya
6 Kertas Label Secukupnya
7 Korek api Secukupnya
8 Kertas buram 4 buah

IV. CARA KERJA
1. Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan

2. Menyemprotkan alcohol 70% pada tangan praktikan dan meja praktikum agar
berada dalam kondisi steril
3. Menyalakan api Bunsen dan menjaga kondisi ruangan
4. Mengambil cawan petri yang berisi media dan membaginya menjadi 4
kuadran
5. Melakukan inokulasi bakteri biakan di setiap kuadran dengan metode titik
dengan benar dan steril
6. Membungkus cawan petri dengan kertas buram dengan posisi terbalik
7. Menyimpan petri di ruangan yang steril pada suhu ruang
8. Setelah 2 hari, melihat perkembanganya dan dihitung diameter zona bening
dan zona koloni bakteri pada tiap kuadran untuk mendapatkan indeks
proteolitik dan amilolitik selama 3 hari berturut-turut
9. Mencatat dalam tabel data pengamatan
V. ANALISIS DATA

VI. KESIMPULAN
VII. DAFTAR PUSTAKA
VIII. LAMPIRAN
ASISTEN PRAKTIKAN
(……….……………) (……….……………)

JUDUL X
PEWARNAAN PADA SEL BAKTERI
I. TUJUAN
Untuk mengamati morfologi bakteri melalui pewarnaan sederhana dan
pewarnaan gram.
II. DASAR TEORI
Bakteri merupakan organism yang sangat kecil (berukuran mikroskopis). Bakteri
rata-rata berukuran lebar 0,5-1 mikron dan panjang hingga 10 mikron (1 mikron = 10 -3).
Hal ini berarti bahwa jasad renik sangat tipis sehingga dapat tembus cahaya. Akibatnya
pada mikroskop tidak tampak jelas dan sukar untuk melihat bagian-bagiannya. Untuk
melihat bakteridengan jelas, permukaan selnya perlu diisi dengan warna, pewarnaan ini
disebut dengan pewarnaan bakteri.
Pewarnaan bakteri sudah dilakukan sejak permulaan berkembangnya
mikrobiologi di pertengahan abad ke-19 oleh Louis Pasteur dan Robert Koch. Terdapat
dua macam zat warna yang sering dipakai, yaitu:
1. Zat warna yang bersifat asam; komponen warnanya adalah anion, biasanya dalam
bentuk garam natrium.
2. Zat warna yang bersifat alkalis; dengan komponen warna kation, biasanya dalam
bentuk klorida.
Untuk mendapatkan hasil pengewarnaan yang lebih baik, tidak jarang diperlukan
bahan penolong, yang biasanya disebut pemantek (mordant). Bahan yang sering
digunakan sebagai pemantek diantaranya: ammonium oksalat, fenol, asam tanat, garam
alumunium, besi, timah, krom, dll.
A. Pengewarnaan Sederhana
Tujuan pengewarnaan ini adalah untuk membedakan bakteri dari benda-benda
mati lain yang bukan bakteri dan untuk melihat bentuk dan ukurannya. Larutan warna
hanya terdiri dari satu bahan warna yang dilarutkan dalam suatu pelarut. Bahan yang
banyak dipakai untuk keperluan ini adalah karbol fuksin, Kristal violet dan methylen
Blue.

B. Pengewarnaan diferensial
Untuk pengewarnaan ini digunakan lebih dari satu macam bahan warna. Dengan
cara ini bahan-bahan warna yang dipakai ada kalanya terpisah atau tercampur dan
digunakan dalam satu larutan. Dua macam pengecatan yang terpenting dari golongan ini
adalah pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam.
Sediaan (preparat) untuk proses pewarnaan dibuat sebagai berikut:
1. Kaca objek dibersihkan, sehingga bebas lemak.
2. Pada bagian ujung kaca objek diberi tanda, sebaiknya di sebelah permukaan
yang tidak dicat.
3. Dengan ose dibuat goresan tipis pada permukaan yang telah dibersihkan.
4. Goresan dikeringkan di udara atau dengan hawa hangat dari api gas.
5. Fiksasi dilakukan dengan cara menyentuhkan permukaan kaca objek tiga kali
berturu-turut pada ujung api Bunsen.
6. Setelah didinginkan preparat sudah siap untuk dicat.
Yang dimaksud dengan fiksasi adalah meletakkan bakteri pada kaca objek,
mamatikan bakteri dengan cepat agar sifat-sifatnya tidak banyak berubah. Fiksasi harus
dilakukan setelah preparat kering.
Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram pertama kali dikemukakan oleh Christian Gram (1884).
Dengan pewarnaan ini goresan tipis bakteri mula-mula dilapisi dengan larutan zat warna
karbol gentinviolet (karbol kristal violet, karbol metal violet) dan didiamkan beberapa
saat, kemudian disiram dengan larutan iodium dan dibiarkan terendam dalam waktu
yang agak lama. Sampai tingkat pewarnaan ini selesai, semua sel bakteri akan berwarna
ungu.
Selajutnya preparat didekolorisasi dengan alcohol atau campuran alcohol atau
aseton sampai semua zat warna tampak launtur dari film bakteri. Setelah dicuci dengan
air, preparat diberi warna kontras (counterstain) seperti safranin atau karbolfuksin encer,
air fuksin, atau pironin B.

Diantara bermacam-macam bakteri yang diwarnai, ada yang dapat menahan
warna ungu (metil violet, Kristal violet, gentian violet) dalam selnya meskipun telah
didekolorisasi dengan alcohol atau aseton. Bakteri yang memberi reaksi demikian
dinamakan Bakteri Gram Positif. Sebaliknya bakteri yang tidak dapat menahan zat
warna setelah didekolorisasi dengan alcohol akan kembali menjadi tidak berwarna dan
bila diberikan pengecatan dengan dengan zat warna kontras akan berwarna sesuai
dengan zat warna kontras. Bakteri yang memperlihatkan reaksi semacam ini dinamakan
bakteri gram negatif. Atas dasar pewarnaan Gram ini dunia bakteri dibagi dalam dua
golongan besar, yaitu bakteri gram posistif dan bakteri gram negatif (Koes Irianto,
2006).
Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di
dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis
bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram
negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis.
Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua
lapis membran sel.
III. ALAT DAN BAHAN

Pewarnaan Sederhana
Alat Jumlah Bahan Jumlah
Object glass 1 Buah Sampel bakteri Secukupnya
Ose 1 Buah Methylene Blue Secukupnya
Bunsen 1 Buah Kapas Secukupnya
Korek api 1 Buah Air Secukupnya
Spidol Marker 1 Buah Spirtus Secukupnya
Rak Pengecatan 1 Buah Secukupnya
Pewarnaan Gram
Alat Jumlah Bahan Jumlah
Object glass 1 Buah Sampel bakteri Secukupnya
Ose 1 Buah Larutan gentian Secukupnya
violet

Bunsen 1 Buah Larutan iodium Secukupnya
Korek api 1 Buah Alkohol Secukupnya
Spidol Marker 1 Buah Safranin Secukupnya
Rak Pengecatan 1 Buah Kapas Secukupnya
Air Secukuonya
Spirtus Secukupnya
IV. CARA KERJA

a. Pembuatan preparat
1. Kaca objek (object glass) dibersihkan, sehingga bebas lemak
2. Pada bagian ujung kaca objek diberi tanda, sebaiknya di sebelah
permukaan yang tidak dicat
3. Dengan ose dibuat goresan tipis dari biakan bakteri pada permukaan
yang telah dibersihkan
4. Goresan dikeringkan di udara atau dengan hawa panas dengan api
gas
5. Fiksasi dilakukan dengan cara meneyentuhkan permukaan kaca objek
tiga kali berturut-turut pada ujung api Bunsen
6. Setelah didinginkan preparat sudah siap untuk dicat
b. Pewarnaan preparat
1. Pewarnaan sederhana
- Genangi preparat yang sudah jadi dengan larutan zat warna
(methylene blue)
- Cuci dengan air mengalir, keringkan
- Amati dibawah mikroskop
2. Pewarnaan Gram
- Genangi preparat yang sudah jadi dengan larutan zat warna gentian
violet selama 2-5 menit
- Buang sisa cat
- Genangi preparat dengan larutan iodium selama 30 detik sampai 1
menit
- Buang sisa cat

- Decolorisasi preparat dengan alkohol atau aseton sampai warna
ungu pada preparat memudar
- Cuci dengan air mengalir
- Genangi preparat dengan larutan safari selama 2-5 menit
- Cucu dengan air mengalir, keringkan
- Amati dibawah mikroskop
V. ANALISIS DATA

VI. KESIMPULAN
VII. DAFTAR PUSTAKA
VIII. LAMPIRAN
ASISTEN PRAKTIKAN
(……….……………) (……….……………)


Modul Praktikum Mikrobiologi

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Modul Praktikum Mikrobiologi

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 1

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 2

Untuk kelancaran praktikum

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 3

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 4

1. MEDIA DAN STERILISASI

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 5

II. DASAR TEORI

air (H2O) sebagai pelarut

oleh mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada suhu 45oC.

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 6

anorganik esuai dengan sifat mikrobanya. Jasad heterotrof memerlukan sumber

Sejumlah mikroba dapat menggunakan sumber N anorganik seperti urea.

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 7

media menjadi padat.

(Nutrient Broth), LB (Lactose Broth).

takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar.

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 8

pertumbuhan mikroba, misalnya Nutrient Broth, Blood Agar.

Media selektif/penghambat. Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah

Media diperkaya (enrichment). Media diperkaya adalah media yang mengandung

komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks

mendiagnosis atau menganalisis metabolism suatu mikroba. Contohnya adalah

Media untuk karakterisasi bakteri. Media yang digunakan untuk mengetahui

kemempuan spesifik suatu mikroba. Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk

Media diferensial. Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari

campurannya berdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial,

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 9

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 10

Prinsip cara kerja autoklaf

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 11

Paelarut organik, seperti fenol

Buffer engan kandungan detergen, seperti SDS

Untuk mencegah terjadinya presipitasi, pencoklatan (media menjadi coklat) dan

garam mineral lain.

Senyawa garam mineral disterilkan terpisah dengan agar

Media yang memiliki pH > 7,5 jangan disterilkan dengan autoklaf

Jangan mensterilisasi larutan agar dengan pH < 6,0

Gambar 13. Prinsip Kerja Autoklaf

III. ALAT DAN BAHAN

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 13

IV. CARA KERJA

Pembuatan Nutrient Broth

1. Menimbang NB bubuk sebanyak 7gr menggunakan neraca analitis

b. Pembuatan Potato Dextrose Agar (PDA)

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 14

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 15

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 20

VII. DAFTAR PUSTAKA

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 21

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 22

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 23

Gambar 15. Metode Tuang

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 24

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 25

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 26

III. ALAT DAN BAHAN

IV. CARA KERJA

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 27

B. Isolasi Bakteri dari Ekstrak Padat pada Agar miring

C. Isolasi Bakteri dari Ekstrak Padat pada Agar cawan

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 28

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 29