BAB II

Deskripsi Metode dan Pilihan Sistem Pelarut

DCCC tumbuh dari pengamatan bahwa fase cahaya dengan afinitas permukaan dinding
rendah membentuk tetesan yang terpisah yang naik melalui fase berat dengan bukti nyata dari
gerak interfacial yang sangat aktif. Di bawah kondisi ideal masing-masing tetesan bisa menjadi
"pelat" jika disimpan lebih kurang diskrit di seluruh sistem. Metode yang dikembangkan oleh
TANIMURA. Mengeksploitasi ide ini dan pada dasarnya terdiri dari 200 ' hingga 600 panjang
kolom vertikal (20 hingga 60 cm) mempersempit kaca pipa silanized (1,5 hingga 2 mm, i.d)
saling berhubungan di seri oleh kapiler tabung teflon . Sebuah langkah pertama terdiri untuk
mengisi seluruh sistem dengan fase stasioner diikuti dengan suntikan sampel (terlarut baik
dalam fase cahaya atau dalam fase berat atau dalam campuran.. kedua fase) dalam ruang
sampel. Fase seluler adalah dari dipompa melalui ruang sampel dan dimasukkan dengan tabung
kapiler ke bagian bawah kolom kaca pertama dari lubang yang lebih luas. Sebuah aliran stabil
dari tetesan yang menaik terbentuk. Ketika tetesan mencapai bagian atas kolom, itu dikirim ke
bagian bawah kolom berikutnya melalui tabung teflon, sehingga regenerasi tetesan baru.
Di bawah kondisi yang sesuai, tabung kapiler hanya memungkinkan fase seluler untuk
mengalir. Sejumlah kecil fase stasioner juga dapat memasukkan tabung teflon awalnya, tetapi
efeknya tidak signifikan. Sebagai fase seluler bergerak melalui kolom, turbulensi dalam tetesan
mempromosikan efisien partisi dari zat terlarut antara dua fase.
Tergantung pada masalah pemisahan, fase seluler mungkin lebih berat atau lebih ringan
daripada fase stasioner. Bila lebih ringan, fase seluler akan dikirim di bagian bawah kolom
(mode menaik) dan, apabila lebih berat, melalui bagian atas (mode menurun). Sistem pelarut
yang membentuk dua lapisan yang tidak bercampur biasanya cocok untuk DCCC, namun ada
beberapa keterbatasan. Generasi tetesan memiliki ukuran dan mobilitas yang sesuai diatur oleh
sejumlah faktor seperti perbedaan dalam gravitas tertentu dari dua fasa cair, viskositas pelarut,
tegangan permukaan, laju aliran dari fase seluler, diameter ujung inlet dan diameter internal
kolom.
Secara umum, kolom kecil lubang (kurang dari 1,0 mm) menghasilkan plug aliran di
mana seluruh isi tabung dipindahkan. Di sisi lain, perlu dicatat bahwa diameter besar tabung
mengurangi efisiensi pemisahan. Sebuah kolom internal diameter sekitar 2 mm tampaknya
menjadi ideal. Kami telah menggunakan banyak sistem pelarut, di antaranya, beberapa tidak
diindikasikan. Sistem metanolheksana air yang sering digunakan dalam aliran fungsi counter
CRAIG distribusi menghasilkan busi yang mengakibatkan perpindahan fase stasioner oleh fase
seluler.
Sistem pelarut lain yang tidak cocok adalah air n-butanol-pyridine yang tidak
memberikan tetesan karena viskositasnya yang tinggi. Kami memperoleh hasil yang baik
dengan menggunakan CHCI3,/MeOH/H2O, CH2CI2/ MeOH/H2O or CHCI3/MeOH/PrOH/ H2O
campuran dalam proporsi yang berbeda. Modifikasi jumlah MeOH dalam campuran tertentu
menyebabkan perubahan besar dalam polaritas sistem. Sistem pelarut yang digunakan sejauh
ini untuk memberikan ukuran yang cocok tetesan untuk pemisahan efisien diberikan dalam
tabel I. Kebanyakan dari mereka adalah sistem tersier atau kuaterner, salah satu komponen
yang menjadi air.
 Cara cepat untuk memilih sistem pelarut terdiri dalam memeriksa sampel oleh
kromatografi thinlayer (TLC) pada Silica Gel dengan lapisan organik jenuh air. Secara empiris,
kami menemukan bahwa jika R, nilai senyawa yang akan dipisahkan lebih tinggi dari sekitar
0,50 (kurang zat terlarut), lapisan polar kurang cocok untuk digunakan sebagai fase seluler.
Dengan lebih banyak substrat polar (Rf < 0.50), lapisan lebih harus digunakan sebagai
fase seluler. Jika nilai Rf berada di kisaran 0,40 - 0,60, Pemisahan dapat dicapai dengan
menggunakan lapisan lebih polar atau kurang Polar lapisan sebagai fase seluler. Hal ini
diilustrasikan dalam berikut dengan pemisahan faraksi (60 mg) dari ekstrak kasar dari Rocky
Mountains Gentiana species (Gentiana strictiflora (RYDB). A. NELS) diperoleh setelah
kromatografi kolom pada Sephadex LH-20. Pada Silica Gel TLC, dengan CHCl3,-MeOH,-
PrOH-H2O (9:12:1:8), lapisan bawah, fraksi ini menunjukkan dua titik aktif UV di Rf = 0.35
dan 0.41. Pemisahan DCCC dengan menggunakan lapisan atas polar saat fase seluler
menghasilkan dua senyawa murni 1 (32 mg) dan 2 (26 mg), diidentifikasi sebagai 1,3,5-
trihydroxyxanthone-8-O-β-D-glucoside dan 1,s-dihydroxy-3-methoxyxanthone -8-O- β -D-
glucoside dengan perbandingan dengan sampel otentik. Kedua glycoside dipisahkan dengan
volume total sekitar 350 ml fase seluler. Seperti yang diharapkan, penggunaan lapisan lebih
Polar sebagai fase seluler mengakibatkan elusi sebelumnya lebih senyawa Polar 1. Untuk
perbandingan, campuran yang sama dari 1 dan 2 diserahkan kepada DCCC dan dielusi dengan
lapisan yang kurang polar. Total volume fase seluler yang digunakan untuk eluting kedua
senyawa adalah 800 ml. Namun, resolusi lebih baik daripada sebelumnya. seperti yang
diharapkan, glicoside 2 polar lemah merupakan dielusi pertama. Eksperimen perbandingan ini
menunjukkan bahwa dalam kasus separasi sulit, itu bisa lebih baik untuk menggunakan lapisan
yang kurang polar sebagai fase seluler untuk elusi senyawa dengan nilai Rf relatif rendah, dan
lapisan yang lebih polar untuk elusi senyawa dengan nilai Rf yang relatif tinggi. Resolusi yang
lebih baik akan diperoleh, tetapi waktu pemisahan akan lebih lama. Jika nilai Rf dari senyawa
yang akan dipisahkan terlalu rendah (< 0.3-0.2), atau terlalu tinggi (> 0.8-0.7), tidak ada elusi
akan berlangsung dalam waktu yang wajar, meskipun senyawa dapat pulih secara kuantitatif
dari fase stasioner yang tersisa.
Pemilihan sistem pelarut berdasarkan TLC sangat sederhana dan cepat dan memberikan
hasil yang umumnya memuaskan. Efek adsorpsi kecil dengan menggunakan lapisan organik
jenuh air sebagai eluent dan sebagian dapat dihilangkan dengan pengkondisian pelat sebelum
pengembangan. Tapi karena DCCC hanya tergantung pada koefisien partisi, pemisahan tidak
selalu dapat diprediksi dari perilaku TLC.