Definisi DNA Rekombinan

Menurut Cohen dan Boyer (1980: DNA rekombinan (rDNA) adalah bentuk DNA buatan yang dibuat
dengan menggabungkan dua atau lebih sekuens yang tidak akan biasanya terjadi bersama-sama.
Dalam hal modifikasi genetik, itu adalah diciptakan melalui pengenalan DNA yang relevan ke dalam
DNA organisme yang ada, seperti plasmid bakteri, untuk kode untuk atau mengubah sifat berbeda
untuk tujuan tertentu, seperti resistensi antibiotik (News Medical.Net)

Robert (2009) mengatakan bahwa DNA rekombinan adalah DNA yang mengalami perubahan karena
penyisipan suatu sekuens deuksinukleotida yang sebelumnya tidak terdapat dalam molekul DNA
yang sudah ada dengan cara enzimatik atau kimiawi. Rekayasa genetika adalah serangkaian teknik
untuk memodifikasi dan merekomendasi gen dari berbagai organisme yang berbeda yang juga
disebut teknologi DNA rekombinan.

Teknologi yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan, atau dengan istilah yang lebih populer
rekayasa genetika, ini melibatkan upaya perbanyakan gen tertentu di dalam suatu sel yang bukan sel
alaminya sehingga sering pula dikatakan sebagai kloning gen. Banyak definisi telah diberikan untuk
mendeskripsikan pengertian teknologi DNA rekombinan. Salah satu di antaranya, yang mungkin
paling representatif, menyebutkan bahwa teknologi DNA rekombinan adalah pembentukan
kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor
sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel
organisme lain yang berperan sebagai sel inang. Rekayasa genetika dapat memberikan hasil yang
sangat menguntungkan. Sebagai contoh pasien yang menderita diabetes tidak mampu membentuk
hormon insulin untuk mengatur kadar gula dalam darah. Oleh karena itu, pasien membutuhkan
suntikan insulin sebagai tambahan. Dengan teknik rekayasa genetika, para peneliti berhasil memaksa
mikroorganisme (bakteri) untuk membentuk insulin yang mirip dengan insulin manusia (suryo, 2001).

B. Teknologi DNA Rekombinan

Teknologi DNA rekombinan merupakan teknik kejuruteraan genetik yang melibatkan penggunaan
DNA rekombinan - yaitu DNA yang menggabungkan maklumat genetik dua species organisme yang
berlainan. Jika gen-gen ini digabungkan dalam sel telur atau sel sperma supaya maklumat genetik ini
boleh diturunkan kepada progeni, maka hasil daripada gabungan ini dinamakan organisme
transgenik.

Penghasilan DNA rekombinan melibatkan tiga proses:

1. Manipulasi DNA in vitro (luar sel organisma)

2. Gabungan, atau rekombinasi DNA sesuatu organisma dengan DNA bakteria dalam plasmid atau
bakteriofak

3. Pengklonan, atau teknik untuk mereplikasi progeni yang membawa DNA rekombinan.

Proses-proses diatas pertama kali dilakukan oleh Paul Berg dan A.D. Kaiser pada tahun 1972. Mereka
berjaya memasukkan DNA prokariot kedalam bakteria, kemudian oleh S.N. Cohen dan Herbert Boyer
yang berjaya menggabungkan DNA organisme eukariot bersama plasmid bakteria.

Komponen yang digunakan dalam teknik DNA rekombinan diantaranya enzim restriksi untuk
memotong DNA, enzim ligase untuk menyambung DNA dan vektor untuk menyambung dan
mengklonkan gen di dalam sel hidup, transposon sebagai alat untuk melakukan mutagenesis dan
untuk menyisipkan penanda, pustaka genom untuk menyimpan gen atau fragmen DNA yang telah
diklonkan, enzim transkripsi balik untuk membuat DNA berdasarkan RNA, pelacak DNA atau RNA
untuk mendeteksi gen atau fragmen DNA yang diinginkan atau untuk mendeteksi klon yang benar.
Vektor yang sering digunakan diantarnya plasmid, kosmid dan bakteriofag. Enzim restriksi, digunakan
untuk memotong DNA. Enzim restriksi mengenal dan memotong DNA pada sekuens spesifik yang
panjangnya empat sampai enam pasang basa. Enzim tersebut dikenal dengan nama enzim
endonuklease restriksi.

Ada dua bagian terpenting yang selalu digunakan dalam rekayasa genetika yaitu sebagai berikut :

1. Enzim seluler/Cellular Enzymes

Enzim yang dipakai dalam memanipulasi DNA diantaranya adalah :

a. enzim Endonuklease, yaitu enzim yang mengenali batas-batas sekuen nukleotida spesifik dan
berfungsi dalam proses restriction atau pemotongan bahan-bahan genetik. Penggunaan enzim ini
yang paling umum antara lain pada sekuen palindromik. Enzim ini dibentuk dari bakteri yang dibuat
sedemikian rupa sehingga dapat menahan penyusupan DNA, seperti genom bacteriophage.

b. DNA polimerisasi, yaitu enzim yang biasa dipakai untuk meng-copy DNA. Enzim ini mengsintesis
DNA dari sel induknya dan membentuk DNA yang sama persis ke sel induk barunya. Enzim ini juga
bisa didapatkan dari berbagai jenis organisme, yang tidak mengherankan, karena semua organisme
pasti harus meng-copy DNA mereka.

c. RNA polimerisasi yaitu enzim yang berfungsi untuk ’membaca sekuen DNA dan mengsintesis
molekul RNA komplementer. Seperti halnya DNA polimerisasi, RNA polimerisasi juga banyak
ditemukan di banyak organisme karena semua organisme harus ’merekam’ gen mereka.

d. DNA ligase merupakan suatu enzim yang berfungsi untuk menyambungkan suatu bahan genetik
dengan bahan genetik yang lain. Contohnya saja, enzim DNA ligase ini dapat bergabung dengan DNA
atau RNA dan membentuk ikatan phosphodiester baru antara DNA atau RNA yang satu dengan
lainnya.

e. Reverse transcriptases adalah enzim yang berfungsi membentuk blue-print dari molekul RNA
membentuk cDNA (DNA komplementer). Enzim ini dibuat dari virus RNA yang mengubah genom RNA
mereka menjadi DNA ketika mereka menginfeksi inangnya. Enzim ini biasa dipakai ketika bertemu
dengan gen eukariotik yang biasanya terpisah-pisah menjadi potongan kecil dan dipisahkan oleh
introns dalam kromosom.

2. Vektor natural/ Natural Vectors

Sebagai salah satu cara untuk memanipulasi DNA di luar sel, para ilmuwan dalam bioteknologi harus
bisa membuat suatu tempat yang keadaannya stabil dan cocok dengan tempat DNA yang
dimanipulasi. Sekali lagi, alam telah memberikan solusi dari masalah ini. Vektor disini bisa diartikan
sebagai alat yang membawa DNA ke dalam sel induk barunya.
Agar suatu metode dalam rekayasa genetika dianggap berhasil, di dalam vektor, DNA hasil
rekombinan seharusnya benar-benar hanya dibawa setelah sebelumnya DNA rekombinan
digabungkan dengan DNA vektor melalui enzim ligase. Namun di dalam vektor, DNA rekombinan
tidak termutasi lagi membentuk DNA dengan sifat baru. Contoh dari vektor natural dari alam adalah
plasmid dan virus atau bacteriophage(Witarto, 2005).

Adapun teknik pembuatan DNA rekombinan adalah sebagai berikut:

1. Teknik mengisolasi DNA

2. Teknik memotong DNA dengan menggunakan enzim retriksi endonuklease

3. Teknik menggabung/ menyambung DNA dengan menggunakan enzim ligase

4. Teknik memasukkan DNA kedalam sel hidup (vektor)

5. Vektor berkembang dengan seleksi DNA yang direkayasa.

Gambar 1: mekanisme DNA Rekombinan

1. Isolasi DNA yang diawali dengan melakukan perusakan serta penghilangan dinding sel. Dalam
proses ini dapat dilakukan secara mekanis ataupun dengan cara enzimatis. Setelah perusakan sel
telah dilakukan, langkah selanjutnya adalah pelisisan sel hal ini dapat dilakukan dengan
menggunakan buffer nonosmotik, serta deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium
dodesil sulfat (SDS). Remukan sel yang diakibatkan oleh lisisnya sel dibuang dengan melakukan
sentrifugasi sehingga bias dibedakan antara bagian yang rusak serta organel target yang pada
akhirnya didapatlkan DNA yang nantinya dilakukan pemurnian dengan penambahan amonium asetat
dan alcohol.

2. Pemotongan molekul DNA, baik genomik maupun plasmid dilakukan dengan enzimrestriksi. Ada
dua macam enzim restriksi yaieu enzim restriksi tipe I dan enzim restriksitipe II. Enzim restriksi tipe II
mempunyai sifat-sifat umum yang penting sebagai berikut:

a. mengenali urutan tertentu sepanjang empat hingga tujuh pasang basa di dalammolekul DNA.

b. memotong kedua untai molekul DNA di tempat tertentu pada atau di dekat tempat
pengenalannya.

c. menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran dan urutan basa.

Berdasarkan tempat hasil pemotongan, fragmen-fragmen DNA memiliki dua macamujung yaitu:

Ujung lengket (sticky end) atau ujung kohesif, terjadi jika tempat pemotongan pada kedua
untai DNA terpisah sejauh beberapa pasang basa, sehinggamenghasilkan fragmen-fragmen
dengan ujung 5’ yang runcing karena masing-masing untai tunggalnya menjadi tidak sama
panjang. Dua fragmen DNA denganujung yang runcing akan mudah disambungkan satu sama lain.

Ujung tumpul (blunt end), terjadi jika tempat pemotongan DNA pada posisi yangsama. Kedua fragm
en hasil pemotongannya akan mempunyai ujung 5’ yang tumpul karena masing-masing untai tun
ggalnya sama panjangnya.
Penyatuandua fragmen DNA ujung tumpul sulit dilakukan sehingga memerlukan
perlakuantambahan, misalnya pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau penambahanenzim d
eoksinukleotidil transferase.

3. Tahap selanjutnya adalah penyambungan molekul DNA.

Ada tiga cara yang dapatdigunakan untuk meligasi fragmen-fragmen DNA secara in vitro. Pertama, lig
asimenggunakan enzim DNA ligase dari bakteri. Kedua, ligasi menggunakan DNA ligasedari sel-
sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofag T4 atau lazim
disebut sebagaienzim T4 ligase. Ketiga yaitu pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untukme
nyintesis untai tunggal homopolimerik 3’. Suhu optimum bagi aktivitas DNA ligasesebenarnya
37ºC. Akan tetapi, pada suhu ini ikatan hidrogen yang secara alamiterbentuk di antara ujung-
ujung lengket akan menjadi tidak stabil dan
kerusakan akibatpanas akan terjadi pada tempat ikatan tersebut. Oleh karena itu, ligasi biasanya
dilakukan pada suhu antara 4 dan 15ºC dengan waktu inkubasi (reaksi) yangdiperpanjang (sering
kali hingga semalam).
4. Setelah tahap penyambungan molekul
DNA, dilakukan analisis terhadap hasilpemotongan DNA genomik dan DNA vektor serta analisis hasil l
igasi molekul-molekulDNA tersebut. menggunakan teknik elektroforesis. Jika
hasil elektroforesismenunjukkan bahwa fragmen-fragmen DNA genomik telah terligasi dengan
baikpada DNA vektor sehingga terbentuk molekul DNA rekombinan, campuran reaksi ligasi
dimasukkan ke dalam sel inang agar dapat diperbanyak dengan cepat. Tahap memasukkan
campuran reaksi ligasi ke dalam sel inang dinamakan transformasikarena sel inang diharapkan
akan mengalami perubahan sifat tertentu setelah dimasukimolekul DNA rekombinan.

5. Tahap selanjutnya adalah seleksi transforman dan seleksi

rekombinan. Oleh karena DNAyang dimasukkan
ke dalam sel inang bukan hanya DNA rekombinan, maka kita
harusmelakukan seleksi untuk memilih sel inang transforman yang membawa DNArekombinan.
Selanjutnya, di antara sel-sel transforman
yang membawa DNA rekombinanmasih harus dilakukan seleksi
untuk mendapatkan sel yang DNA rekombinannyamembawa fragmen sisipan atau gen yang
diinginkan. Pada dasarnya ada tigakemungkinan yang dapat terjadi setelah transformasi dilakukan, ya
itu:

1. Sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau berarti transformasi gagal.

2. Sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti ligasi gagal, dan

3. Sel inang dimasuki vektor rekombinan dengan/tanpa fragmen sisipan atau gen yangdiinginkan.

Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan mencari
fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe), yangpembuatannya dilakukan secara in
vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasiberantai atau polymerase chain reaction (PCR).
Pelacakan fragmen yang diinginkanantara lain dapat dilakukan melalui cara yang dinamakan
hibridisasi koloni(Tjahjoleksono, 2009).

Transfer DNA atau perpindahan DNA ke dalam bakteri dapat melalui tiga cara yaitu:

1. Transformasi : transfer DNA yang umumnya berasal dari satu sel bakteri ke dalam sel yang
berbeda. Prosesnya adalah ketika sebuah sel bakteri pecah atau lisis maka DNA sirkular akan terlepas
ke lingkungan. Efisiensi transformasi bergantung pada kompetensi sel.

2. Konjugasi : merupakan pemindahan materi genetik berupa plasmid secara langsung melalui
kontak sel dengan membentuk struktur seperti jembatan diantara dua sel bakteri yang berdekatan.
Umumnya terjadi pada bakteri gram negatif.

3. Transduksi : transfer materi genetik dari satu bakteri ke bakteri lainnya dengan menggunakan
virus bakteri sebagai vektor. Transfer ini menggunakan prinsip dasar dari galur donor yang
menyediakan DNA bagi galur resipien. Perbedaan utamanya dengan transfer DNA lainnya adalah
DNA ditransfer melalui perantaraan bakteriofag.

C. Manfaat Teknologi DNA Rekombinan

Berbagai penelitian tentang DNA rekombinan banyak gunakan dan dimanfaatkan dalam berbagai
bidang, diantaranya :

1. Bidang industri
Penelitian rekayasa genetika di bidang industry sedang meningkat dengan cepat. Berbagai usaha
yang telah giat dilakukan misalnya :

1. Menciptakan bakteri yang dapat melarutkan logam-logam langsung dari dalam bumi

2. Menciptakan bakteri yang dapat menghasilkan bahan kimia

Mencipatkan bakteri yang dapat menghasilkan bahan mentah kimia seperti etilen yang diperlukan
untuk pembuatan plastic

2. Bidang Pertanian

Beberapa manfaat rekayasa genetika dalam bidang pertanian diantaranya adalah:

1. Mengganti pemakaian pupuk nitrogen yang banyak dipergunakan tapi mahal harganya, oleh
fiksasi nitrogen secara alamiah. Bakteri tanah Rhizobium sp dapat mengadakan infeksi ke dalam akar
dari tanaman family Leguminosae. Infeksi ini menghasilkan bintil akar dan bakteri yang terdapat di
dalamnya dapat mengikat zat lemas bebas dari udara untuk di ubahnya menjadi nitrogen yang dapat
diambil dan digunakan oleh tanaman tersebut.

2. Teknik rekayasa genetika mengusahakan tanaman-tanaman (terutama yang mempunyai arti

ekonomi) yang tidak begitu pekah terhadap penyakit yang disebabkan oleh bakteri, jamur dan
cacing.

3. Mengusahakan tanaman-tanaman yang mampu menghasilkan peptisida sendiri.

3. Bidang Peternakan

1. Telah diperoleh vaksin-vaksin untuk melawan penyakit mencret ganas yang dapat mematikan
anak-anak babi

2. Sudah dipasarkan vaksin yang efektif terhadap penyakit kuku dan mulut, yaitu penyakit ganas
dan sangat menular pada sapi, domba, kambing, rusa dan babi

4. Bidang Kedokteran

Gen-gen bagi beberapa protein yang dibutuhkan dalam bidang kedokteran yang dibutuhkan dalam
bidang kedokteran yaitu pembuatan insulin manusia oleh bakteri Eschrechia coli untuk pengobatan
penyakit diabetes (Wikipedia.org).