Ririn Vidiastuti

Liquid Solid Chromatography (LSC)

LSC adalah kromatografi penyerapan. Sebagai adsorben digunakan silika gel,
alumina, penyaring molekul atau gelas berpori dipakai dalam sebuah kolom
dimana komponen-komponen campuran dipisahkan dengan adanya fase gerak.
Kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis (TLC) merupakan teknik
pemisahan yang masuk golongan ini.

Teknik ini tergantung pada teradsorpsinya zat padat pada adsorben yang
polar seperti silika gel atau alumina. Kromatografi lapisan tipis (TLC)
adalah salah satu bentuk dari LSC. Dalam KCKT kolom dipadati atau dipak
dengan partikel-partikel micro or macro particulate or pellicular
(berkulit tipis 37 -44 μ).Sebagian besar dari KCKT sekarang ini dibuat
untuk mencapai partikel-partikel microparticulate lebih kecil dari 20μ .
Teknik ini biasanya digunakan untuk zat padat yang mudah larut dalam
pelarut organik dan tidak terionisasi. Teknik ini terutama sangat kuat
untuk pemisahan isomer-isomer.

Fase diam adalah adsorben dan pemisahan didasarkan pada adsorpsi berulang
dan desorpsi bahan terlarut (analit). Bahan terlarut ditambahkan ke sistem
padat (misal silika) cair (misal aseton).

Fasa geraknya adalah cairan

Fasar diamnya adalah padat

Pemilihan fase gerak dalam kromatografi padat cair (adsorpsi) akan dengan
baik tercapai dengan menggunakan parameter kekuatan pelarut e0 berdasarkan
pada pekerjaan Hildebrand dan baru-baru ini diubah oleh Snyder.

Kekuatan pelarut ditemukan dengan mengukur panas yang dihasilkan oleh

pelarut per unit area materi pengadsorbsi (adsorbat) selama pelarut
teradsorbsi pada adsorbat

Semakin aktif suatu pelarut maka semakin tinggi level panas yang
dihasilkan (atau energi bonding pelarut untuk adsorbat) dan secara
konsekuen kekuatan pelarut semakin tinggi. Oleh karena itu pelarut non-
polar seperti alkana sederhana memiliki kekuatan pelarut yang sangat
rendah. Pentana dalam skala kekuatan pelarut Snyder adalah nol. Tabel
kekuatan pelarut (e0) disusun dengan urutan meningkat, berdasarkan pada
deret Eluotropic. Alkohol dan air memiliki nilai kekuatan pelarut yang
tinggi berkaitan dengan gugus hidroksil aktif yang tinggi.

Kekuatan pelarut mengontrol rasio partisi k’. Peningkatan e 0 berarti

pelarut lebih kuat dan nilai k’ semakin kecil untuk semua pita sampel.

Campuran biner digunakan pada hampir semua kasus untuk menyediakan

kekuatan pelarut yang tepat sehingga dapat memberikan nilai rasio partisi
k’ yang tepat.

Tabel 18.6. Beberapa pelarut sebagai fase gerak

 Ririn Vidiastuti

Mekanisme pemisahan yang dapat digunakan pada kromatografi cair – padat

ini antara lain :
1. Adsorpsi
2. Pertukaran Ion
3. Saringan Molekular
4. Reaksi Selektif

Teknik yang dapat digunakan antara lain :

1. Kolom
2. Planar

Metode yang digunakan dalam kromatografi cair –padat :

1. Kromatografi Cair – Padat Klasik(LSC)
2. KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi) / HPLC
3. KLT ( Kromatografi lapis Tipis) / TLC
4. KLTKT (Kromatografi Lapis Tipis Kinerja Tinggi) / HPTLC
5. Kromatografi Pertukaran Ion
6. Kromatografi Ekslusi
7. Kromatografi Afinitas

 Metode kromatografi ini banyak digunakan untuk analisis biokimia dan

organik.
 Teknik pelaksanaanya dilakukan dengan kolom kaca, dimana fasa diam
dapat dipilih silica gel atau alumina.
 Kekurangan metode ini ialah:
a. pilihan fasa diam (adsorben) yang digunakan terbatas;
b. koefisien diatribusi untuk serapan seringkali tergantung pada
kadar total, sehingga pemisahannya kurang sempurna.

KROMATOGRAFI KOLOM
Kromatografi kolom merupakan metode kromatografi klasik yang masih banyak
digunakan. Kromatografi kolom digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa
dalam jumlah yang banyak berdasarkan adsorpsi dan partisi. Kemasan
 Ririn Vidiastuti
adsorben yang sering digunakan adalah silika gel G-60, kieselgur, Al2O3,
dan Diaion. Cara pembuatannya ada dua macam :

 Cara kering yaitu silika gel dimasukkan ke dalam kolom yang telah diberi
kapas kemudian ditambahkan cairan pengelusi.

 Cara basah yaitu silika gel terlebih dahulu disuspensikan dengan

cairan pengelusi yang akan digunakan kemudian dimasukkan ke dalam kolom
melalui dinding kolom secara kontinyu sedikit demi sedikit hingga masuk
semua, sambil kran kolom dibuka. Eluen dialirkan hingga silika gel
mapat, setelah silika gel mapat eluen dibiarkan mengalir sampai batas
adsorben kemudian kran ditutup dan sampel dimasukkan yang terlebih
dahulu dilarutkan dalam eluen sampai diperoleh kelarutan yang spesifik.
Kemudian sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding
kolom sedikit demi sedikit hingga masuk semua, dan kran dibuka dan
diatur tetesannya, serta cairan pengelusi ditambahkan. Tetesan yang
keluar ditampung sebagai fraksi-fraksi.

Kromatografi Kolom Isap :

Suction Colomn
Isolasi komponen kimia dalam jumlah yang banyak, berdasarkan
absorpsi dan partisi, dimana kolom diisi dengan fase diam divakumkan
dengan suatu pompa vakum agar eluen dapat turun mengelusi komponen kimia
yang selanjutnya keluar sebagai fraksi-fraksi.

Rapid-Sigel
Isolasi komponen kimia dalam jumlah yang sedikit berdasarkan absorpsi
dan partisi, dimana kolom diisi dengan fase diam divakumkan dengan suatu
pompa vakum agar eluen dapat turun mengelusi komponen kimia yang
selanjutnya keluar sebagai fraksi-fraksi.

Press Colomn
Kromatografi kolom sederhana di mana fase gerak bergerak dengan cepat
karena penggunaan tekanan positif dari tabung nitrogren. Udara yang
ditekan mengandung O2 dan uap air yang dapat menyebabkan peruraian produk
dari ekstrak dan berubah saat pemisahan kromatografi.
 Ririn Vidiastuti

KROMATOGRAFI PLANAR
Kromatografi planar mempunyai dua bentuk, yaitu:
1.kromatografi kertas
Berdasarkan mekanismenya, tergolong ke dalam kromatografi partisi, dimana
fasa diamnya adalah air yang terikat pada selulosa kertas sedangkan fasa
geraknya adalah pelarut organik
yang bersifat nonpolar.
2.kromatografi lapis tipis.
Berdasarkan mekanismenya, tergolong ke dalam kromatografi adsorpsi.
Medium pemisahannya berupa lapisan tipis zat padat adsorben (alumina,
silica gel) pada lempeng kaca, plastik, atau alumunium.
Cara melakukannya banyak persamaannya dengan kromatografi kertas.

Kedua teknik kromatografi ini digunakan untuk memisahkan dan identifikasi

komponen analit dalam jumlah kecil.
Pada kromatografi planar :
Larutan cuplikan diteteskan pada suatu titik pada permukaan fasa diam
planar.
Setelah pelarut menguap, kemudian dikembangkan dengan fasa gerak melalui
permukaan tersebut dalam ruang pengembang.
Gerakan fasa gerak sebagai akibat dari efek kapiler pada fasa diam.
 Ririn Vidiastuti

KROMATOGRAFI ADSORPSI
2.1 Pengertian kromatografi adsorpsi
Adsorpsi ialah gejala timbulnya konsentrasi zat yang lebih besar pada
bidang perbatasan antara dua fasa daripada dalam masing-masing fasa.
Terjadinya pemisahan ialah akibat gaya tarik fasa stasioner yang kuat
terhadap komponen – komponen yang harus dipisahkan. Gaya tarik yang kuat
ini disebabkan oleh interaksi kimiawi dan atau interaksi Van Der Walls
Kromatografi adsorpsi adalah teknik kromatografi tertua dioperasikan
berdasarkan retensi terlarut pada permukaan adsorben. Adsorben yang umum
digunakan adalah silika gel dan alumina karena mereka dimiliki daerah yang
besar permukaan dan banyak situs aktif. Terlarut dan pelarut dalam cairan
dapat bersaing satu sama lain untuk mendapatkan situs yang aktif. Karena
ini, memilih pelarut yang tepat sangat penting untuk mendapatkan adsorpsi
maksimum zat terlarut pada situs aktif permukaan.
Pada kromatografi adsorpsi, fasa stasionernya terdiri atas zat padat dan
fasa mobilnya terdiri atas zat gas atau zat cair.
2.2 Contoh– contoh yang termasuk kromatografi adsorpsi
• Kromatografi kolom Adsorpsi
• Kromatografi gas
• Kromatografi lapis tipis
2.2.1. Kolom kromatografi Adsorpsi
a. Prinsip
Prinsip yang mendasari kromatografi kolom adsorpsi ialah bahwa komponen –
komponen dalam zat contoh yang harus diperiksa mempunyai afinitas yang
berbeda-beda terhadap adsorben dalam kolom. Apabila kita mengalirkan
cairan ( elutor ) secara kontinyu melalui kolom yang berisi zat contoh
yang telah diadsorpsikan oleh penyarat kolom, maka yang pertama – tama
dihanyutkan elutor ialah komponen yang paling lemah terikat kepada
adsorben. Komponen –komponen lainnya akan dihanyutkan menurut urutan
afinitasnya terhadap adsorben, sehingga terjadi pemisahan daripada
komponen – komponen tersebut.
 Ririn Vidiastuti
b. Penyarat kolom
Pola kecepatan arus elutor pada tiap irisan kolom yang dipilih di
sembarang tempat suddah tentu sedapat mungkin harus sama. Keseragaman ini
dapat dicapai dengan memilih adsorben yang ukuran butir – butirnya sama (
diayak ) dan dengan cara penyaratan yang baik.
Makin kecil ukuran butir adsorben, makin cepat keseimbangan adsorpsi akan
tercapai, dan makin besar pula kecepatan elusi yang boleh dipergunakan.
Tetapi dilain pihak, makin kecil butir adsorben, makin besar hambatan bagi
cairan yang harus mengalir melalui kolom. Apabila kecepatan lintas bagi
cairan elutor terlalu kecil, dapat dipergunakan pompa vakum yang
menimbulkan tekanan rendah dalam ruang di bawah kolom sehingga cairan
dapat mengalir lebih cepat melalui kolom. Cara yang lain ialah menambahkan
tekanan dalam ruang di atas kolom dengan menggunakan pompa pneumatic.

c. Bentuk kolom
penempatan adsorben dalam kolom secara uniform betul sangat sukar
dilaksanakan. Sebagai akibatnya, zona – zona komponen yang dipisahkan
menjadi kurang teratur bentuknya. Bagi kolom yang lebar hal ini dapat
menyebabkan pembauran. Tetapi bagi kolom kecil bahaya ini seberapa besar.
Namun di lain pihak, kolom yang lebar dan pendek itu lebih memudahkan
dalam pemakaiannya.
Oleh karena itu, tinggi kebanyakan kolom ialah ± 20 kali diameternya. Di
bawah tabung yang umumnya terbuat dari gelas terdapat lempengan meduk yang
terbuat dari porselen atau dari serbuk gelas yang dipanaskan hingga
melengket jadi satu. Lempengan yang berbentuk cakram ini bergawai sebagai
penahan fasa yang stasioner. Di bagian tabung yang paling bawah terdapat
kapiler penyulur dilengkapi dengan pancur. Kapiler beserta pancur
dirakitkan dengan kolom memakai suku asah sehingga mudah dilepaskan guna
membersihkan kolom dan untuk meniup kolom sehingga menjadi bersih dari
cairan. Ruang antara pancur dan cakram penyaring harus sekecil mungkin
supaya tidak terjadi pembauran antara cairan – cairan yang keluar dari
kolom.

d. Kecepatan arus
Semakin rendah kecepatan arus cairan, semakin baik akibatnya bagi
tercapainya keseimbangan adsorpsi dan akan semakin baik pula pemisahannya.
Bentuk zona pun menjadi lebih teratur. Tetapi kecepatan arus yang terlalu
rendah dapat menimbulkan efek difusi axial dalam fasa mobil yang harus
dihindarkan sejauh mungkin.

Jadi dapat dikatakan bahwa pemisahan yang terbaik dapat dicapai dengan
mempergunakan kolom yang panjang dan sempit, diisi dengan adsorben yang
berbutir halus, dan arus yang lambat. Elusi dapat dimulai apabila campuran
yang harus dipisahkan sudah dimasukan dalam kolom. Elusi ini dilakukan
dengan memasukan cairan elutor berenyai – renyai melalui kolom dan harus
dijaga supaya arusnya tidak berhenti. Komponen – komponen yang telah
diadsorpsikan oleh adsorben akan bergerak dalam bentuk gelang – gelang
atau zona dengan kecepatan yang berbeda – beda melalui kolom dan ditampung
di bawah kolom secara terpisah memakai beberapa tabung yang dibubuhi tanda
– tanda. Tabung – tabung ini ditempatkan dalam sebuah fraksikolektor.
Setelah itu fraksi – fraksi yang diperoleh mulai dapat diselidiki.
 Ririn Vidiastuti
2.2.2. Kromatografi gas
Kromatografi Gas adalah metode kromatografi pertama yang dikembangkan pada
jaman instrument dan elektronika yang telah merevolusikan keilmuan selama
lebih dari 30 tahun. Sekarang kromatografi gas dipakai secara rutin di
sebagian besar laboratorium industri dan perguruan inggi. kromatografi gas
dapat dipakai untuk setiap campuran yang komponennya atau akan lebih baik
lagi jika semua komponennya mempunyai tekanan uap yang berarti pada suhu
yang dipakai untuk pemisahan.
Campuran gas dapat dipisahkan dengan kromatografi gas. Fasa stationer
dapat berupa padatan (kromatografi gas-padat) atau cairan (kromatografi
gas-cair).
Umumnya, untuk kromatografi gas-padat, sejumlah kecil padatan inert
misalnya karbon teraktivasi, alumina teraktivasi, silika gel atau saringan
molekular diisikan ke dalam tabung logam gulung yang panjang (2-10 m) dan
tipis. Fasa mobil adalah gas semacam hidrogen, nitrogen atau argon dan
disebut gas pembawa. Pemisahan gas bertitik didih rendah seperti oksigen,
karbon monoksida dan karbon dioksida dimungkinkan dengan teknik ini.
Dalam kasus kromatografi gas-cair, ester seperti ftalil dodesilsulfat yang
diadsorbsi di permukaan alumina teraktivasi, silika gel atau penyaring
molekular, digunakan sebagai fasa diam dan diisikan ke dalam kolom.
Campuran senyawa yang mudah menguap dicampur dengan gas pembawa
disuntikkan ke dalam kolom, dan setiap senyawa akan dipartisi antara fasa
gas (mobil) dan fasa cair (diam) mengikuti hukum partisi. Senyawa yang
kurang larut dalam fasa diam akan keluar lebih dahulu.
Metoda ini khususnya sangat baik untuk analisis senyawa organik yang mudah
menguap seperti hidrokarbon dan ester. Analisis minyak mentah dan minyak
atsiri dalam buah telah dengan sukses dilakukan dengan teknik ini.
Efisiensi pemisahan ditentukan dengan besarnya interaksi antara sampel dan
cairannya. Disarankan untuk mencoba fasa cair standar yang diketahui
efektif untuk berbagai senyawa. Berdasarkan hasil ini, cairan yang lebih
khusus kemudian dapat dipilih. Metoda deteksinya, akan mempengaruhi
kesensitifan teknik ini. Metoda yang dipilih akan bergantung apakah
tujuannya analisik atau preparatif.
2.2.3. Kromatografi lapis tipis
Kromatografi lapis tipis merupakan kromatografi adsorpsi dan adsorben
(silika gel (asam silikat), alumina (aluminium oxide), kieselguhr
(diatomeous earth), dan selulosa) bertindak sebagai fase stasioner. Dalam
kromatografi lapis tipis, bahan penyalut yang digunakan beraneka macam.
Silika gel yang paling banyak dipakai (Djide , 2003).
Teknik ini dikembangkan tahun 1938 oleh Ismailoff dan Schraiber. Adsorbent
dilapiskan pada lempeng kaca yang bertindak sebagai fase diam. Fase
bergerak (Untuk senyawa organik yang polar akan lebih mudah larut dengan
air dari pada pelarut organik, dan hendaknya untuk senyawa-senyawa
tertentu menggunakan pelarut sesuai dengan kepolaran pelarut yang
digunakan dan pembuatan fase mobil harus hati-hati karena sulitnya
keterulangan dalam campuran serta pelarut jangan digunakan dalam selang
yang lama) akan merayap sepanjang fase diam dan terbentuklah kromatogram.
Dikenal juga sebagai kromatografi kolom terbuka. Metode ini sederhana,
cepat dalam pemisahan dan sensitif. Kecepatan pemisahan tinggi dan mudah
untuk memperoleh kembali senyawa-senyawa yang dipisahkan (Petrucci, 1987).
Pelarut-pelarut yang digunakan biasanya berupa campuran satu komponen
 Ririn Vidiastuti
organik yang utama, air dan berbagai tambahan seperti asam-asam, basa-basa
atau pereaksi komplek, utk memperbesar atau mengurangi kelarutan untuk
zat-zat tertentu (Ganiswarna, 1995). Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam
teknik kromatografi adalah metode (penaikan, penurunan, mendatar), macam
kertas, pemilihan dan pembuatan eluen (fase mobil), kesetimbangan dari
bejana yang dipilih, pembuatan cuplikan, waktu pengembangan, metode
deteksi dan identifikasi (Petrucci, 1987)

Read more: http://susanblogs18.blogspot.com/2012/11/makalah-kromatografi-

adsorpsi.html#ixzz2RHJoMGu3

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

Kromatografi lapis tipis merupakan kromatografi adsorpsi dan adsorben
(silika gel (asam silikat), alumina (aluminium oxide), kieselguhr
(diatomeous earth), dan selulosa) bertindak sebagai fase stasioner. Dalam
kromatografi lapis tipis, bahan penyalut yang digunakan beraneka macam.
Silika gel yang paling banyak dipakai (Djide , 2003).
Teknik ini dikembangkan tahun 1938 oleh Ismailoff dan Schraiber. Adsorbent
dilapiskan pada lempeng kaca yang bertindak sebagai fase diam. Fase
bergerak (Untuk senyawa organik yang polar akan lebih mudah larut dengan
air dari pada pelarut organik, dan hendaknya untuk senyawa-senyawa
tertentu menggunakan pelarut sesuai dengan kepolaran pelarut yang
digunakan dan pembuatan fase mobil harus hati-hati karena sulitnya
keterulangan dalam campuran serta pelarut jangan digunakan dalam selang
yang lama) akan merayap sepanjang fase diam dan terbentuklah kromatogram.
Dikenal juga sebagai kromatografi kolom terbuka. Metode ini sederhana,
cepat dalam pemisahan dan sensitif. Kecepatan pemisahan tinggi dan mudah
untuk memperoleh kembali senyawa-senyawa yang dipisahkan (Petrucci, 1987).
Pelarut-pelarut yang digunakan biasanya berupa campuran satu komponen
organik yang utama, air dan berbagai tambahan seperti asam-asam, basa-basa
atau pereaksi komplek, utk memperbesar atau mengurangi kelarutan untuk
zat-zat tertentu (Ganiswarna, 1995). Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam
teknik kromatografi adalah metode (penaikan, penurunan, mendatar), macam
kertas, pemilihan dan pembuatan eluen (fase mobil), kesetimbangan dari
bejana yang dipilih, pembuatan cuplikan, waktu pengembangan, metode
deteksi dan identifikasi (Petrucci, 1987)

Read more: http://susanblogs18.blogspot.com/2012/11/makalah-kromatografi-

adsorpsi.html#ixzz2RHJDetat
Salah satu metode pemisahan yang sederhana ialah kromatografi lapis tipis.
Pada dasarnya prinsip pada KLT sama dengan kromatografi kertas hanya KLT
mempunyai kelebihan yang khas dibandingkan dengan kromatografi kertas
yaitu keserbagunaan, kecepatan, dan kepekaannya.
KLT dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama, dipakai sebagai metode untuk
mencapai hasil kualitatif, kuantitatif, ataupun preparatif. Kedua, dipakai
untuk menjajaki sistem pelarut dan sistem penyangga yang akan dipakai pada
kromatografi kolom atau kromatografi cair kinerja tinggi/KCKT. Analisis
dari KLT dapat membantu menentukan pelarut terbaik apa yang akan dipakai
 Ririn Vidiastuti
dan berapa perbandingan antar pelarut yang akan digunakan sebagai fasa
gerak pada kromatografi kolom. Kromatografi lapis tipis sangat berhubungan
dengan kromatografi kolom, hal ini karena fasa-fasa senyawa yang digunakan
dalam teknik keduanya sama. Alumina dan silika gel adalah fasa diam yang
biasa digunakan, dan fasa geraknya menggunakan eluen yang sama. Walaupun
demikian, tetap terdapat perbedaan antara KLT dan kromatografi kolom. Fasa
gerak (cair) di dalam kromatografi kolom bergerak turun, sedangkan dalam
KLT bergerak naik. Bahan fasa diam yang digunakan dalam kromatografi kolom
yang berupa kolom digantikan dengan suatu lapisan tipis (tebalnya 100 μm)
pada KLT, yang merata pada seluruh bagian permukaannya. Bahan-bahan dari
gelas atau lembaran-lembaran plastik dapat digunakan sebagai bahan
pendukung fasa diam untuk lapis tipisnya.
Sangat dimungkinkan bagi kita untuk menyiapkan lembaran KLT yang dari
gelas, tetapi untuk yang bahan pendukungnya plastik hanya tersedia secara
komersil. Lembaran yang pendukungnya plastik sangat menarik karena dapat
dipotong dengan gunting menjadi lembaran-lembaran yang lebih kecil dengan
berbagai ukuran. Biasanya lembaran kecil itu berukuran 1×3 inci tetapi
untuk lembaran yang lebih kecil dapat disesuaikan.
KLT mempunyai beberapa keuntungan, diantaranya: waktu yang dibutuhkan
tidak lama (2 – 5 menit) dan sampel yang dipakai hanya sedikit sekali (2 –
20 μg). Kerugiannya dengan menggunakan KLT adalah tidak efektif untuk skala
industri. Walaupun lembaran KLT yang digunakan lebih lebar dan tebal,
pemisahannya sering dibatasi hanya sampai beberapa miligram sampel saja .
Larutan cuplikan atau sampel ditotolkan pada plat dengan pipet mikro atau
injektor pada jarak 1 – 2 cm dari batas plat. Setelah kering plat siap
untuk dikembangkan dengan fasa gerak sampai pada batas tertentu.
Proses pengembangan dikerjakan dalam wadah tertutup yang diisi eluen dan
telah dijenuhi uap eluen agar dihasilkan pemisahan yang baik.
Langkah selanjutnya yaitu mengeringkan sisa eluen dalam plat, kemudian
melakukan identifikasi yang dapat dilakukan dengan beberapa cara, yaitu:
pengamatan langsung (untuk noda/bercak yang tampak), dengan lampu
ultraviolet, atau dengan pereaksi semprot penimbul warna . Dalam
penelitian ini menggunakan pereaksi yangdigunakan adalah Dragendorff.

KROMATOGRAFI CAIR TINGKAT TINGGI

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Pressure Liquid

Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia.
KCKT termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi
dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan
metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya (Done dkk, 1974; Snyder
 Ririn Vidiastuti
dan Kirkland, 1979; Hamilton dan Sewell, 1982; Johnson dan Stevenson,
1978). Kelebihan itu antara lain:
• mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran
• mudah melaksanakannya
• kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
• dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang
dianalisis
• Resolusi yang baik
• dapat digunakan bermacam-macam detektor
• Kolom dapat digunakan kembali
• mudah melakukan "sample recovery"

DETECTOR
3. 4. Detektor (Detector) .
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di
dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis
kuantitatif).Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi,
gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi
respons untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap
aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu
dapat diperoleh.
Detektor KCKT yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel
panjang gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan
range yang lebih luas. Detektor indeks refraksi juga digunakan secara
luas, terutama pada kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif
jika dibandingkan dengan detektor UV. Detektor-detektor lainnya antara
lain:
Detektor Fluorometer -Detektor Spektrofotometer Massa
Detektor lonisasi nyala -Detektor Refraksi lndeks
Detektor Elektrokimia -Detektor Reaksi Kimia

Types of detector

1. UV-visible absorbance detector : for aromatic compounds. Nonionic surfactant

2. RI (Refractive Index)
3. Fluorescence
4. Electrochemical
5. Conductivity: for inorganic ions eg. Cl-, So42- , Na+ ,anionic and cationic surfactant

KROMATOGRAFI PENUKAR ION

 Ion-exchange chromatography

Teknik ini menggunakan zeolitas, resin organik atau anorganik sebagai

penukar ion. Senyawaan yang mempunyai ion-ion dengan afinitas yang berbeda
terhadap resin yang digunakan dapat dipisahkan.
 Ririn Vidiastuti
Kromatografi pertukaran ion (ion-exchange chromatography) biasa digukanan
untuk pemurnian materi biologis, seperti asam amino, peptida, protein.
Metode ini dapat dilakukan dalam dua tipe, yaitu dalam kolom maupun ruang
datar (planar). Terdapat dua tipe pertukaran ion, yaitu pertukaran kation
(cation exchange) dan pertukaran anion (anion exchange). Pada pertukaran
kation, fase stasioner bermuatan negatif; sedangkan pada pertukaran anion,
fase stasioner bermuatan positif. Molekul bermuatan yang berada pada fase
cair akan melewati kolom. Jika muatan pada molekul sama dengan kolom, maka
molekul tersebut akan terelusi. Namun jika muatan pada molekul tidak sama
dengan kolom, maka molekul tersebut akan membentuk ikatan ionik dengan
kolom. Untuk mengelusi molekul yang menempel pada kolom diperlukan
penambahan larutan dengan pH dan kekuatan ionik tertentu. Pemisahan dengan
metode ini sangat selektif dan karena biaya untuk menjalankan metode ini
murah serta kapasitasnya tinggi, maka metode ini biasa digunakan pada awal
proses keseluruhan.

Prinsip kerja kromatografi adsorpsi

 Didasarkan pada retensi zat terlarut oleh adsorpsi

permukaan
 Berguna pada pemisahan senyawa-senyawa non polar dan
konstituen yang sukar menguap
 Pemisahan bergantung kesetimbangan yang terbentuk pada :
permukaan butiran fasa diam dan fasa cair yang bergerak,
serta kelarutan realtif zat terlarut pada fasa geraknya
 Terjadi kompetisi antara molekul zat terlarut dan pealrut
dengan permukaan adsorben.

Prinsip kerja kromatografi penukar ion

 Terjadi pertukaran kation atau anion antara zat terlarut

dalam fasa gerak dengan kation atau anion dalam fasa diam.
 Biasa digunakan untuk penentuan konsentrasi asam, basa,
garam total; pengeluaran ion-ion pengganggu.

Prinsip kerja kromatografi partisi

 Contoh : - Kromatografi kertas

- Kromatografi lapis tipis

 Pemisahan dipengaruhi oleh distribusi sampel dalam zat cair

fasa gerak dan dalam zat cair fasa diam. (partisis zat
terlarut dalam fasa diam dan fasa gerak)

Prinsip kerja kromatografi gas (GC)

Fasa gerak : gas
 Ririn Vidiastuti
Zat terlarut : gas *
Fasa diam : gas *
*bisa dimodifikasi

 Sampel diinjeksikan dalam injection part, senyawa-senyawa

dalam sample akan menguap dan akan dibawa oleh gas
pengemban menuju kolom.

PROSEDUR PEMISAHAN TEKNIK KROMATOGRAFI KOLOM

1. elusi
2. frontal
3. pergeseran (displacement)

Elusi → Eluent dilewatkan melalui kolom yang dapat menyebabkan

differential migration dengan laju aliran tertentu.
Frontal → Sampel dialirkan secara kontinyu melalui pengadsorpsi
Komponen yang sukar teradsorpsi akan keluar terlebih dulu
Pergeseran → pengaliran suatu reagen yang teradsorpsi lebih kuat

Analisis Kuantitatif

Untuk menjamin kondisi yang digunakan dalam analisis kuantitatif stabil

dan reprodusibel, baik pada penyiapan sampel atau proses kromatografi,
berikut beberapa syarat yang harus dipenuhi dalam analisis kuantitatif:
 Ririn Vidiastuti
a.
Analit (solut) harus telah diketahui dan terpisah sempurna dari komponen-
komponen lain dalam kromatogram
b.
Baku dengan kemurnian yang tinggi dan telah diketahui harus tersedia
c.
Prosedur kalibrasi yang sudah diketahui harus digunakan.
Untuk kromatografi yang melibatkan kolom, kuantifikasi dapat
dilakukan dengan luas puncak atau tinggi puncak. Tinggi puncak atau luas
puncak berbanding langsung dengan banyaknya solut yang dikromatografi,
jika dilakukan pada kisaran detektor yang linier (Johnson dan Stevenson,
1991).

1. Metode tinggi puncak

Metode yang paling sederhana untuk pengukuran kuantitatif adalah
dengan tinggi puncak. Tinggi puncak diukur sebagai jarak dari garis dasar
ke
Universitas Sumatera Utara
 Ririn Vidiastuti
puncak maksimum seperti puncak 1, 2, dan 3 pada gambar 3.
Penyimpangan garis dasar diimbangi dengan interpolasi garis dasar antara
awal dan akhir puncak.

Gambar 1. Pengukuran tinggi puncak

Metode tinggi puncak hanya digunakan jika perubahan tinggi puncak
linier dengan konsentrasi analit. Kesalahan akan terjadi jika metode ini
digunakan pada puncak yang mengalami penyimpangan (asimetris) atau jika
kolom mengalami kelebihan muatan.
2. Metode luas puncak
Prosedur penentuan luas puncak serupa dengan tinggi puncak. Suatu
teknik untuk mengukur luas puncak adalah dengan mengukur luas puncak
sebagai hasil kali tinggi puncak dan lebar pada setengah tinggi (W1/2).
Teknik ini hanya dapat digunakan untuk kromatografi yang simetris atau
yang mempunyai bentuk serupa (Johnson dan Stevenson, 1991).
Baik tinggi puncak maupun luasnya dapat dihubungkan dengan konsentrasi.
Tinggi puncak mudah diukur, akan tetapi sangat dipengaruhi perubahan waktu
retensi yang disebabkan oleh variasi suhu dan komposisi pelarut. Oleh
karena itu, luas puncak dianggap merupakan parameter yang lebih akurat
untuk pengukuran kuantitatif (Ditjen POM, 1995).

Identifikasi signal kromatogram HPLC

Prinsip dasar dari HPLC, dan semua metode kromatografi adalah memisahkan
setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif)
dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut
(kuantitatif). Sebetulnya hanya ada dua hal utama yang menjadi krusial
point dalam metode HPLC. Yang pertama adalah proses separasi/pemisahan dan
yang kedua adalah proses identifikasi. Dua hal ini mejadi faktor yang
sangat penting dalam keberhasilan proses analisa.

Yang berperan dalam proses separasi pada system HPLC adalah kolom. Ada
kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18 yang
dapat digunakan untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan
sebagainya. Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk tujuan analisa
tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrat (Agilent) yang khusus digunakan
untuk analisa karbohidrat (mono-, di-, polysakarida). Keberhasilan proses
separasi sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa
mobil.

Setelah komponen dalam sample berhasil dipisahkan, tahap selanjutnya

adalah proses identifikasi. Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk
signal kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang
menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample.
 Ririn Vidiastuti

Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai

kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling
bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan
perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini
dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap
diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi
biasanya jauh lebih mudah karena sedikit mengandung komponen selain zat
aktif. Sample ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja.

Contoh kromatogram dengan banyak peak

Kesulitan biasanya dihadapi ketika akan mengidentifikasi suatu kromatogram

yang terdiri atas banyak peak. Untuk mengetahui peak mana yang merupakan
milik analat (zat target analisa) kromatogram dibandingkan dengan
kromatogram standard. Nah disinilah kadang analis sedikit ceroboh. Cara
yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention
time (RT). Peak yang mempunyai RT yang sama dengan standard umumnya akan
langsung di vonis sebagai peak milik analat. Memang senyawa/zat yang sama
akan mempunyai RT yang juga sama, dengan catatan sample dan standard
dijalankan dengan kondisi dan sistem HPLC yang sama. Namun bukan berarti
RT yang sama pasti merupakan zat/senyawa yang sama. Disinilah para analis
biasanya terkecoh.

Saya pernah mengalami hal ini. Ketika bermaksud ingin melihat kandungan
Lovastatin dalam suatu sample hasil fermentasi dari Monascus, sejenis
fungi, Kromatogram yang saya peroleh mengandung banyak peak yang membuat
saya kesulitan untuk menentukan yang manakah dari peak-peak tersebut yang
merupakan peak milik Lovastatin. Setelah jalan standard Lovastatin, saya
temukan satu peak pada sample yang memilki RT yang sama dengan peak pada
Standard. Awalnya saya mengira bila peak tersebut adalah peak Lovastatin,
sehingga dari sini saya menyimpulkan bahwa sample yang saya analisa betul
mengandung Lovastatin. Namun setelah saya bandingkan spektrum 3D untuk
kedua peak, ternyata keduanya memilki spektrum 3D yang berbeda. Sehingga
 Ririn Vidiastuti
meskipun peak tersebut keluar pada RT yang sama dengan standard
Lovastatin, namun itu bukanlah Lovastatin karena spektrum 3D berbeda
dengan spektrum Lovastatin.

Jadi, melihat RT sebetulnya belumlah cukup untuk mengidentifikasi suatu

zat. Hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal
kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D yang juga sama.
Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut
juga dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama.

Lantas bagaimana bila sistem HLC yang digunakan tidak dapat memunculkan
spektrum 3D?
Spektrum 3D hanya dapat ditampilkan oleh HPLC yang telah menggunakan DAD
(Diode Array Detector) sebagai detektor. Sedangkan HPLC yang masih
menggunakan detektor UV tidak dapat melihat spektrum 3D. Namun, konfirmasi
masih dapat dilakukan dengan melihat spektrum UV. Prinsipnya sama. Jika
spektrum UV kedunya sama, maka keduanya adalah zat yang sama. Tapi jika
spektrum UV sample berbeda dengan standard, maka keduanya zat yang berbeda
sekalipun memiliki RT yang sama.

Analisa Kuantitatif Kromatografi

Kata Kunci: Analisa Kuantitatif, Kurva Gaussian

Ditulis oleh Adam Wiryawan pada 14-03-2011

Hubungan Dasar

Dengan komatrogram yang diperoleh dari detektor diferensial yang mana

memiliki respon linier, penggantian/jarak dari garis belakang pada saat
tertentu adalah suatu ukuran konsentrasi dari komponen dari gas pembawa di
saluran keluar kolom.

Kurva integral dihasilkan yakni area puncak dari puncak adalah sebanding
dengan jumlah komponen yang ada. Dalam kromatogram yang ideal dimana
puncak merupakan kurva Gaussian simetrik lalu ketinggian puncak akan
sebanding dengan.

Area puncak adalah a konsentrasi komponen bila Gaussian maka area a ke

tinggi puncak.

Kalibrasi

Oleh karena itu kalibrasi dapat dicapai dengan menjalankan satu rangkaian
standar yang diketahui konsentrasinya dan membandingkan respon area yang
dihasilkan antara standar dan sampel.

Sejumlah metode lainnya digunakan oleh para peneliti dalam menghitung

kuantitas komponen dalam sampel. Hal ini termasuk
 Ririn Vidiastuti
Normalisasi Internal

Area dari setiiap puncak sesuai dengan komponen spesifik dalam sampel
telah terbentuk kemudian ditambahkan untuk memberi suatu total area yang
ditetapkan pada 100%. Masing-masing area komponen kemudian dinyatakan
sebagai persen dari nilai ini.

Akan tetapi senyawa-senyawa yang berbeda akan memberikan respon berbeda

terehadap detektor, oleh karena itu perlu ditentukan faktor koreksi.
Karena detektor yang berbeda akan beroperasi pada prinsip yang berbeda
maka perlu dihitung faktor yang berbeda untuk tiap detektor yang berbeda.

Faktor dapat ditentukan berdasarkan berat atau molar.

 Ririn Vidiastuti

Plate Theory and Rate Theory

Plate theory and Rate theory are two theories that are applicable to chromatography. Plate theory describes a
chromatography system as being in equilibrium between the stationary and mobile phases. This views the
column as divided into a number of imaginary theoretical plates. This is significant because as the number of
plates in a column increases or the height equivelant theoretical plates or HETP increases, so does the
separation of components. It also provides an equation that describes the elution curve or the chromatogram of a
solute it can also be used to find the volume and the column efficiency.

HETP = L/N ; where L= column length and N= number of theoretical plates

The Rate theory on the other hand describes the migration of molecules in a column. This included band shape,
broadening, and the diffusion of a solute. Rate theory follows the Van Deemter equation, which is the most
appropriate for prediction of dispersion in liquid chromatography columns. It does this by taking into account
the various pathways that a sample must travel through a column. Using the Van Deemter equation, it is
possible to find the optimum velocity and and a minimunm plate height.

H=A+B u =Cu
Where:
 Ririn Vidiastuti
A = Eddy-Diffusion, B = Longitudinal Diffusion, C = mass transfer, u = linear velocity

Instrumentation

This schematic is of the basic instrumentation of a liquid-solid chromatograph. The solvent inlet brings in the
mobile phase which is then pumped through the inline solvent filter and passed through the injection valve. This
is where the mobile phase will mix with the injected sample. It then gets passed through another filter and then
passed through the column where the sample will be separated into its components. The detector detects the
separation of the analytes and the recorder, or usually a computer will record this information. The sample then
goes through a backpressure filter and into waste.

A basic LC system consists of (a) a solvent inlet filter, (b) pump, (c) inline solvent filter, (d) injection valve, (e)
precolumn filter, (f) column, (g) detector, (h) recorder, (i) backpressure regulator, and a (j) waste reservoir.

Advantages / Disadvantages

Liquid-solid column chromatography is an effective separation technique when all appropriate parameters and
equipment are used. This method is especially effective when the compounds within the mixture are colored, as
this gives the scientist the ability to see the separation of the bands for the components in the sample solution.
Even if the bands are not visible, certain components can be observed by other visualization methods. One
method that may work for some compounds is irradiation with ultraviolet light. This makes it relatively easy to
collect samples one after another. However, if the components within the solution are not visible by any of these
methods, it can be difficult to determine the efficacy of the separation that was performed. In this case, separate
collections from the column are taken at specified time intervals. Since the human eye is the primary detector
for this procedure, it is most effective when the bands of the distinct compounds are visible.

Liquid-solid column chromatography is also a less expensive procedure than other methods of separation
(HPLC, GC, etc.). This is because the most basic forms of column chromatography do not require the help of
expensive machinery like high pressure solvent pumps used in HPLC. In methods besides flash
chromatography, the flow of the mobile phase, the detection of each separation band, and the collection of each
component, are all done manually by the scientist. Although this introduces many potential instances of
experimental error, this method of separation can be very effective when done correctly. Also, the glass wear
used for liquid-solid column chromatography is relatively inexpensive and readily available in many
laboratories. Burets are commonly used as the separating column, which in many cases will work just as well as
an expensive pre-prepared column. For smaller scale chromatography, Pasteur pipettes are often used.
 Ririn Vidiastuti
Flash chromatography has the potential to be more costly than the previous methods of separation, especially
when sophisticated air pumps and vacuum pumps are needed. When these pieces of machinery are not needed,
however, a vacuum line can be instead connected to an aspirator2 on a water faucet. Also, home-made
pressurized air flow controllers can be made as shown previously.