3.

Mengapa metode Spektrofotometri IR dapat digunakan untuk mengidentifikasi kandungan

fitronutrisi dalam mikroalga Spirulina? (Jelaskan juga prinsip kerja instrumennya)
Spirulina merupakan ganggang hijau biru yang mengandung fitokimia atau kadang disbeut
fitonutrien, dalam arti luas adalah segala jenis zat kimia atau nutrient yang diturunkan dari sumber
tumbuhan, termasuk sayuran dan buah-buahan. Kompoosisi fitonutrisi dalam spirulina dapat
berpotensi sebagai antikanker, diantaranya:
a. Pigmen fikoasianin, klorofil a, karotenoid
b. Asam Lemak GLA (Gamma Linoleic Acid)
c. Enzim Superoksida Dismutase (SOD)
d. Oligosakarida
e. Kelenegkapan nutrisi yang terkandung dalam spirulina yang berperan dalam meningkatkan
sistem kekebalan tubuh, seperti : Protein, Karbohidrat, lemak, mineral, asam amino, asam
nukleat, vitamin, dan enzim.
Atom-atom di dalam suatu molekul tidak dapat diam melainkan bervibrasi (bergetar). Ikatan kimia
yang menghubungkan dua atom dapat dimisalkan sebagai dua bola yang dihubungkan oleh pegas,
dan ditunjukkan dalam Gambar 1

Gambar 1. Model ikatan kimia

Bila radiasi infra merah dilewatkan melalui suatu cuplikan, maka molekulmolekulnya dapat
menyerap (mengabsorpsi) energi dan terjadilah transisi diantara tingkat vibrasi (ground state) dan
tingkat vibrasi tereksitasi (excited state). Contoh suatu ikatan C – H yang bervibrasi 90 triliun kali
dalam satu detik harus menyerap radiasi infra merah pada frekuensi tersebut (9,0 x 1013 Hz, 3000
cm –1 ) untuk pindah ke tingkat vibrasi tereksitasi pertama. Pengabsorpsian energi pada berbagai
frekuensi dapat dideteksi oleh spektrofotometer infrared, yang memplot jumlah radiasi infra merah
yang diteruskan melalui cuplikan sebagai fungsi frekuensi (atau panjang gelombang) radiasi. Plot
tersebut adalah spektrum infra merah yang memberikan informasi penting tentang gugus
fungsional suatu molekul. A. Vibrasi Molekul Penyerapan radiasi inframerah menyebabkan
perubahan energi (ΔE) dan dinyatakan sebagai : ΔE = h υ, dengan tingkat-tingkat vibrasi
ditunjukkan pada Gambar 2
 Gambar 2. Tingkat-tingkat vibrasi untuk u=suatu ikatan yang bervibrasi

Spektrofotometer Infra merah (spektrofotometri IR) dapatdigunakan untuk mengidentifikasi suatu

senyawa. Yang menjadi parameter kualitatif pada spektrofotometer IR adalah bilangan gelombang
dimana muncul akibat adanya serapan oleh gugus fungsi yang khas dari suatu senyawa.
Spektrofotometer canggih selalu dilengkapi recorder untuk menekan hasil percobaan. Alat
perekam ini mempermudah dan mempercepat pengolahan data. Data absorbsi mulai dari panjang
gelombang 2,5 mikron (υ 4000 cm-1 ) hingga 25 mikron (υ 400 cm-1 ) direkam secara otomatis.
Bahkan spektrofotometer bias dilengkapi sistem komputer bias dibuat sesuai dengan yang
diinginkan.

Gambar 3. Spektrofotometri inframerah model 710b Perkin-Elmer

Spektrofotometer inframerah mempunyai sistem optik yang serupa dengan ultraviolet atau sinar
tampak. Perbedaan utama terletak pada sumber energi dan sel. Sumber radiasi pada
spektrofotometri bias laser. Oleh karena sinar inframerah mempunyai energi yang lebih rendah
dari sinar ultraviolet atau sinar tampak, maka tebal sel yang dipakai pada spektrofotometer lebih
tipis daripada untuk spektrofotometer lainnya ( 0,002 mm). Oleh karena tidak ada pelarut yang
sama sekali transparan terhadap sinar inframerah, maka cuplikan dapat diukur sebagai padatan
atau cairan murninya. Cuplikan padat digerus dalam mortir kecil bersama kristal KBr kering dalam
jumlah sedikit sekali (0,5-2 mg cuplikan + 100 mg KBr kering). Campuran tersebut dipres diantara
dua skrup (Gambar 26) memakai kunci, kemudian kedua skrupnya dibuka dan band yang berisi
tablet cuplikan tipis diletakkan di tempat sel spektrofotometer inframerah dengan lubang mengarah
ke sumber radiasi.
 Gambae 3. Salah satu pembuatan cuplikan padat
Preparasi sampel:
A. Sampel cair
1. Sampel cair harus bebas air
2. Oleskan sampel pada NaCl Window. Tekanlah kedua NaCl Window sehingga tidak ada
gelembung udara diantara keduanya.
3. Untuk analisis secara kuantitatif masukkan sampel dalam Demountable Cell.
4. Sampel siap dianalisis.
B. Sampel padat
1. Metode DRS – 8000 Sampel padat yang akan dianalisa dicampur dengan serbuk KBr (5
– 10 % sampel dalam serbuk KBr), kemudian tempatkan pada sampel pan dan siap untuk
dianalisis.
2. Metode Pelet KBr Campuran sampel padat dengan serbuk KBr (5 – 10 % sampel serbuk
KBr). Campuran yang sudah homogen kemudian dibuat pellet KBr(pil KBr) dengan alat
MINI HAND PRESS. Setelah terbentuk pil KBr siap untuk dianalisis.
Prinsip kerja Spektrofotmetri IR:
1. Sumber cahaya akan terkolimasi (berkas cahaya berpencar menjadi berkas cahaya sejajar)
akan mengenai beam splitter yang dimiringkan 45° terhadap sumber cahaya yang masuk.
2. Beam splitter akan membagi sumber cahaya menjadi dua bagian menuju stationary mirror
(kemudian dipantulkan kembali) sedangkan sebagian lagi ditransmisikan menuju detektor.
3. Meskipun sinar kehilangan beberapa intensitas karena interaksinya dengan stationary
mirror dan beam splitter. Hal ini akan menghasilkan sinar A’ dari sinar A yang akan
menuju ke detektor.
4. interaksi pertama dengan beam splitter, sebagian sinar A ditransmisikan ke kanan menuju
moveable mirror sebagai sinar B yang kemudian dipantulkan kembali ke beam splitter
menuju detektor.
 Gambar 4. Spektrofotometri IR The Perkin-Elmer 71 OB
Instrumentasi Spektrofotometri IR The Perkin-Elmer 71 OB :
1. On-off switch and indicator: tekan sekali ini, instrumen menyala, dan sakelar menyala.
Tekan ini lagi, instrumen mati, dan lampu padam.
2. Speed selector : memilih kecepatan (normal atau cepat). "Cepat" lebih cepat, tetapi lebih
lambat memberikan resolusi lebih tinggi, yaitu lebih detail
3. Scan control : tekan ini untuk memulai pemindaian. Saat instrumen memindai, optik dan
media kertas bergerak secara otomatis, menyebabkan [IRektrum IR ditarik pada kertas
grafik oleh pena.
4. Chart paper carriage: Di sinilah kertas grafik sementara Anda menjalankan IR. Jika
terlihat mencurigakan seperti clipboard, itu karena cara kerjanya.
5. Chart paper hold-down clip: seperti halnya clipboard, ini menahan kertas di dalam carrier
6. Frequency scale : skala ini digunakan untuk membantu menyelaraskan kertas grafik dan
untuk memberi tahu Anda selama proses di mana dalam spektrum instrumen tersebut
7. Scan position indicator : panah putih yang menunjuk, kira-kira, ke tempat dalam spektrum
instrumen berada
8. Line-up mark : sebuah garis, di sini di angka 4000, yang Anda gunakan untuk
mencocokkan angka-angka pada skala frekuensi instrumen dengan angka yang sama pada
kertas grafik
9. Pen and transmittance scale : di sinilah pena melacak spektrum IR Anda. Angka-angka di
sini berarti persentase IR yang ditransmisikan melalui sampel Anda. Jika tidak memiliki
sampel dalam sampel balok, lampu 100% sedang melewati. Blok balok dengan tangan
Anda dan 0% berhasil melewatinya. kita harus dapat melihat mengapa angka-angka ini
disebut% transmisi atau% T skala
10. The 100% control : mengatur pena pada 100% atau mencoba. ini adalah kontrol yang
cukup sensitif, jadi jangan paksa itu.
11. Sample beam aperture : tempat meletakkan dudukan yang berisi sampel, apakah itu pelet
atau pelet KBr. Kami menyelipkan dudukan ke jendela apertur untuk dianalisis
 12. Reference beam aperture : disinilah tidak ada yang berjalan. atau, dalam kasus ekstrem,
kami menggunakan attenuator berkas referensi untuk menurunkan jumlah cahaya yang
mencapai detector
Mekanisme atau prosedur Spektrofotometri IR The Perkin-Elmer 71 OB :
1. Menyalakan tombol on dan membiarkannya selama 3-5 menit
2. Dapatkan tempat kertas IR dan muat kereta kertas grafik. seperti clipboard. pindahkan
kertas untuk mendapatkan garis indeks di atas kertas untuk sejajar dengan indeks pada
instrumen. ini di 4000 cm-1 dan itu hanya panduan kasar.
3. Pastikan kereta kertas grafik berada di ujung atas spektrum (4000 cm-1)
4. Letakkan sampel dalam sampel balok. geser pemegang sampel dengan sampel ke dalam
celah berkas sampel
5. Apa yang harus dilakukan selanjutnya bervariasi untuk kasus paricular. tidak banyak, tetapi
cukup membingungkan dalam mengatur segalanya.
6. Lihat di mana pena (tinta) itu. hati-hati gunakan kontrol 100% untuk menemukan pena
pada tanda sekitar 90% ketika grafik (dan spektrum) berada di ujung atas (4000 cm-1)
Analisis kualitatif dengan spektrometri inframerah digunakan untuk menentukan struktur dan
identitas senyawa dalam sampel. Yang menjadi parameter kualitatif pada spektrofotometer IR
adalah bilangan gelombang dimana muncul akibat adanya serapan oleh gugus fungsi yang khas
dari suatu senyawa. Analisis kualitatif suatu sampel dilakukan dengan membandingkan pita
absorbsi yang terbentuk pada spektrum infra merah menggunakan tabel korelasi dengan spektrum
senyawa pembanding yang sudah diketahui (spektra standar pada tabel korelasi IR).
Analisis Spektrum fitonutrisi dalam spirulina
 Gambar 4. The FTIR Spectrum of Spirulina

SUMBER: IJPBA, July - Aug, 2012, Vol. 3, Issue, 4

Analisis FT-IR untuk sampel spirulina tersebut mempresentasikan beberapa kandungan senyawa
yang terdapat dalam spirulina melalui peak atau puncak serapan yang berbeda-beda pada
spektrumnya. Salah satu senyawa fitonutrisi dalam spirulina adalah Fikosianin (Phycocyanin).
Phycocyanin memiliki struktur kimia atau molekuk sebagai berikut:

phycocyanin
Fikosianin memiliki beberapa gugus fungsi yang juga terindentifikasi dalam analisis FT-
IR tersebut. Puncak-puncak serapan yang menunjukkan gugus-gugus fungsi yang menjadi
karakteristik Fitosianin yaitu:
Spektrum infra merah menunjukkan rentang frekuensi dari puncak 2925-2875 cm-1 yang mewakili
getaran peregangan C-H alifatik. Rentang frekuensi dari puncak 1750-1735 cm-1 mewakili getaran
peregangan C = O (ester dan asam amino). Puncak-puncak berikut 1650-1580 cm-1 hadir dalam
getaran lentur N-H yang ada dalam karbonil β keton amida tak jenuh. Rentang frekuensi dari
puncak 1435-1405 cm-1 hadir dalam getaran lentur CH2. Frekuensi berikut berkisar antara 1300-
1250 cm-1, keberadaan C-O asimetris C-O-C peregangan kehadiran ester, kisaran puncak 1120-
1030 cm-1 hadir dalam peregangan C-H simetris, adanya enzim antioksidan.

DAFTAR PUSTAKA
Venkatesan S., Pugazhendy K. (2012) Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectoroscopic
Analysis of Spirulina. International Journal of Pharmaceutical & Biological
Archives 2012; 3(4):969-972
Khopkar, S.M. 2007. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI Press
Skoog, Douglas. 2004. Fundamentals of Analytical Chemistry Eighth Edition. USA: Thomson
Brooks/Cole