Polimorfisme Gen Pengatur Imun Sebagai Predisposisi Faktor

Risiko untuk Perkembangan Inhibitor Faktor VIII di India pada

Pasien Hemofilia A Berat

Ringkasan. Perkembangan dari penghambat faktor VIII, merupakan komplikasi

yang serius dari terapi penggantian pada pasien hemofilia A, menyebabkan
peningkatan perdarahan, morbiditas dan mortalitas. Tidak ada data tentang
faktor risiko untuk perkembangan inhibitor pada pasien di India dengan
hemofilia A berat. Tujuan kami adalah untuk mempelajari peran polimorfisme
gen pengatur imun pada perkembangan inhibitor. Empat belas polimorfisme gen
pengatur imun (IL1b, IL4, IL10,TNFA dan CTLA4) dianalisis pada 120 pasien
dengan hemofilia A berat, yaitu 50 pasien inhibitor positif, dan 70 pasien
kontrol inhibitor negatif, dengan PCR-RFLP, sekuensing DNA dan allele-
specifixC PCRs. IL10 Haplotipe promotor ‘GCC’ secara keseluruhan (P:0,002,
OR: 3,452, 95% CI: 1,607-7,416), dan haplotipe ‘GCC / ATA ’(P: 0,011, OR:
3,492, 95% CI: 1,402-8,696), terkait dengan produksi IL10 tinggi dan
menengah, masing-masing, secara signifikan lebih tinggi pada pasien inhibitor
positif, sedangkan haplotip ‘non-GCC’ secara keseluruhan (P: 0,002, OR: 0,290,
95% CI0.135-0.622) dan haplotipe ‘ATA / ATA P (P: 0,025, ATAU: 0,278, 95%
CI: 0,096-0,802), terkait dengan sintesis IL10 rendah, yang secara signifikan
lebih tinggi di antara pasien inhibitor negatif. Prevalensi heterozigot TNFA
rs1799724 C / T secara signifikan lebih tinggi pada kelompok inhibitor positif
(P: 0,021, OR: 3,190, 95% CI: 1.273-7.990), sedangkan polimorfisme lainnya
tidak menunjukkan hubungan yang signifikan secara statistik dengan adanya
inhibitor. Polimorfisme gen Regulator imun yang berbeda memainkan peran
penting sebagai faktor risiko yang memungkinkan untuk perkembangan
inhibitor pada pasien hemofilia A berat.
Kata Kunci : Faktor VIII, hemofili A, India, Inhibitor

PENGENALAN

Perkembangan dari inhibitor faktor VIII (FVIII) atau alloantibodies terhadap

infus FVIII merupakan komplikasi yang sangat serius dari terapi penggantian
faktor pada pasien hemofilia A berat. Prevalensi keseluruhan dari perkembangan
inhibitor pada pasien dengan bawaan Hemofilia A berat di India sebelumnya
telah dilaporkan menjadi 8,2% [1]. Pasien, yang mengembangkan inhibitor
FVIII, tidak hanya menunjukkan peningkatan frekuensi episode perdarahan,
yang tidak dapat dikontrol secara memadai oleh FVIII, tetapi juga peningkatan
morbiditas dan mortalitas [2]. Biaya penatalaksanaan episode perdarahan juga
meningkat secara signifikan dengan kebutuhan akan agen bypassing yang mahal
[3]. Di India, terjadi kecenderungan peningkatan untuk mengembangkan
inhibitor FVIII setelah prosedur pembedahan (Lebih dari 19% di antara pasien
hemofilia A parah) juga telah dilaporkan [4].

Mekanisme dari perkembangan inhibitor FVIII pada pasien hemofilia A

bawaan cukup kompleks dan belum sepenuhnya dipahami, seperti yang tampak
merupakan multifaktorial [5-8]. Ada beberapa laporan yang menyatakan
respons imun humoral pada hemofilia A melibatkan interaksi yang berbeda dari
Th1, Th2 & Th3 Sel T CD4 + spesifik FVIII [9,10]. Dengan demikian,
polimorfisme genetik pada gen terkait respons imun, yaitu IL1b, IL4, IL10,
TNFA dan CTLA4, dan gen lainnya telah dianalisis dalam kaitannya dengan
perkembangan inhibitor dalam beberapa penelitian [11-17].

Tujuan utama dari penelitian ini adalah analisis polimorfisme gen respon imun
tertentu, yang diketahui dikaitkan dengan kondisi autoimun, atau dengan
perkembangan inhibitor FVIII di populasi lain pada pasien hemofilia A
kongenital berat di India, dengan dan tanpa inhibitor.
BAHAN DAN METODE

Pasien dan kontrol

Sebanyak 120 pasien hemofilia A parah, dengan dan tanpa inhibitor, termasuk
dalam penelitian ini, yang dirawat Pusat Perawatan Hemofilia Komprehensif di
National Institute of Immunohaematology (Dewan Penelitian Kedokteran India)
dan KEM Hospital, Mumbai selama 2 tahun terakhir. Lima puluh pasien dengan
inhibitor positif menunjukkan status inhibitor positif (> 1 BU / mL) dengan
Nijmegen-modified Bethesda assay[18,19], dan pasien yang positif di masa lalu
setidaknya pada satu kesempatan, dianggap sebagai “Inhibitor positif”, dan 70
kontrol,yang merupakan pasien hemofilia A berat (di atas 10 tahun, yang pernah
menderita lebih dari 10 paparan produk darah atau faktor rekombinasi) juga
dimasukkan dalam penelitian ini. Pasien dengan Hemofilia A yang didapat
(Acquired Haemophilia) dikeluarkan dari penelitian. Penelitian ini disetujui
oleh the Institutional Ethics Committee for Research on Human Subjects of the
National Institute of Immunohaematology (ICMR), Mumbai. proforma klinis
mencakup semua informasi pasien yang relevan, seperti umur, jenis kelamin,
etnis, tipe perdarahan, kerabat orangtua, riwayat keluarga dari inhibitor,
perincian mengenai infus FVIII, riwayat operasi, infeksi dan vaksinasi, proses
inflamasi pada anak usia dini, dll.

METODE

Pengumpulan dan pemrosesan sampel. Sepuluh mililiter dari darah

dikumpulkan dalam 3,18% trisodium sitrat (9: 1 rasio), dan disentrifugasi dua
kali pada kecepatan 4000 rpm / 15 mnt / 24 °C untuk mendapatkan platelet poor
plasma (PPP) untuk berbagai jenis tes penyaringan koagulasi (PT, APTT, Studi
Campuran, Faktor VIII: C, VWF: Ag, FVIII Inhibitor, dan tes skrining
antikoagulan lupus). The Nijmegen-modified Bethesda Assay dilakukan untuk
konfirmasi dan kuantifikasi titer inhibitor FVIII.
Analisis genotip. DNA diekstraksi dari leukosit darah menggunakan metode
fenol-kloroform. IL1ß rs1143634 C / T TaqI SNP dan IL4 rs2243250 C / T SNP
dianalisis dengan PCR-RFLP dan PAGE seperti yang dijelaskan sebelumnya
[12, 20-22]. Enam polimorfisme TNFA; rs1800629 G / A, rs361525 A / G,
rs1800630 C / A, rs4248158 C / T, rs1799724 C / T dan rs3093662 G / A dipilih
sebagian berdasarkan penelitian di MIBS cohort[13] dan dipelajari
menggunakan sekuensing DNA setelah perancangan in – house dari primer
yang sesuai. PCR Alel spesifik yang hemat biaya dan efektif juga kemudian
dirancang in-house untuk TNFA rs1799724 C / T dan rs3093662 SNPs. CTLA-
4 rs5742909 C / T dan CTLA-4 rs231775 A / G SNP juga dianalisis oleh PCR-
RFLP dan PAGE seperti dijelaskan sebelumnya [14,23,24]. Promotor IL10 ‘CA’
mikrosatelit dinucleotide, IL10G, di-genotipe menggunakan primer seperti yang
dijelaskan sebelumnya [12,25] kecuali bahwa forward primer diberi label '6-
FAM' sebagai ganti dari ‘Tet’, dan analisis dilakukan menggunakan Perangkat
lunak GeneMapper (v. 4.0). Tiga polimorfisme promotor IL10 yang terbukti
terkait dengan produksi IL10; rs1800896, rs1800871, rs1800872; dianalisis
menggunakan sekuensing DNA [15, 26].

Analisis statistik

Hasil yang diperoleh dianalisis dengan uji Chi-square. Semua nilai-P adalah dua
sisi dan nilai-P <0,05 dianggap signifikan secara statistik.

HASIL
Usia rata-rata pasien yang termasuk inhibitor positif adalah 24,73 tahun (kisaran
5-59 tahun) dan usia rata-rata kontrol negatif inhibitor adalah 23,54 tahun
(kisaran 10–65 tahun). Jumlah pasien yang terpapar baik untuk faktor VIII
rekombinan atau produk darah lainnya sebelum usia 6 bulan adalah 0,11% dan
0,12% di antara kasus inhibitor positif dan inhibitor negatif, masing-masing
secara aktif. Jumlah rata-rata pajanan di antara pasien inhibitor positif adalah
22,12 (kisaran 3 - 120) sedangkan pada pasien inhibitor negatif adalah 52,19
(kisaran 12-700).

Polimorfisme IL1b dan IL4 menunjukkan tidak ada perbedaan yang signifikan
secara statistik antara penghambat kelompok inhibitor positif dan inhibitor
negatif, seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1. Di antara polimorfisme TNFA,
prevalensi heterozigot TNFA rs1799724 C / T secara statistik lebih tinggi pada
kelompok inhibitor positif, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1 (P: 0,021,
OR: 3,190, 95% CI: 1,273-7,990).

Alel mikrosatelit promotor IL10 bervariasi dari 124 hingga 148 bp dalam
sampel yang diteliti, dan tidak ada perbedaan yang signifikan dalam distribusi
salah satu alel yang ditemukan antara pasien inhibitor positif dan kontrol.

Namun, berkenaan dengan promotor IL10 polimorfisme analisis berdasarkan

kelompok yang didefinisikan sebagai ‘GCC’ dan ‘non-GCC’, serta pembagian
lebih lanjut dari dua kelompok ini menjadi enam haplotipe telah menunjukkan
signifikansi hasil tidak bisa, seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2. Promotor
IL10 haplotipe ‘GCC / ATA found telah ditemukan secara signifikan lebih tinggi
di antara pasien inhibitor positif, (P: 0,011, ATAU: 3.492, 95% CI: 1.402–
8.696), sedangkan ‘ATA / Haplotipe ATA telah ditemukan lebih tinggi secara
signifikan di antara pasien hemofilia A kontrol inhibitor negatif (P: 0,025, OR:
0,278, 95% CI: 0,096-0,802). Secara keseluruhan, haplotipe ‘GCC’ terkait
secara signifikan lebih tinggi pada inhibitor sebagai pasien positif dibandingkan
dengan kontrol, sedangkan haplo 'non-GCC' tipe secara signifikan lebih tinggi
pada kontrol.