TUGAS INDIVIDU BIOTEKNOLOGI FARMASI

RESUME GEN THERAPY CHAPTER 24

Disusun Untuk Memenuhi Tugas Mata Kuliah Bioteknologi Farmasi

Dosen Pembimbing :
Bawon Triatmoko, S.Farm., M.Sc., Apt.

Disusun oleh :
Devina Aulia Zulfa (172210101045)

Fakultas Farmasi Universitas Jember

2019
 PENDAHULUAN

Tubuh manusia terdiri dari berbagai protein. Pada pengobatan tradisional, molekul kecil obat
tradisional biasanya berinteraksi dengan protein seperti enzim, hormon, dan faktor
transkripsi untuk memberikan efek terapeutik. Namun, pada banyak penyakit parah dan
beberapa penyakit kronis pengobatan tidak dilakukan dengan obat tradisional.

Terapi gen adalah pengobatan suatu penyakit dengan menggunakan asam nukleat yang
digunakan sebagai obatnya (Gbr. 24.1). Target terapi gen dapat berupa onkogen abnormal
yang produknya berpotensi menyebabkan tumor atau gen cacat yang produknya sangat
penting untuk mempertahankan fungsi fisiologis normal.

Gambar 24.1 ■ Metode pemberian vektor terapi gen.

Potensi penggunaan asam nukleat sebagai terapi telah menarik perhatian besar
untuk mengobati penyakit genetik yang parah dan melemahkan energi. Kerugian utama
terapi gen adalah bahwa obat-obatan gen tidak mudah diformulasikan ke dalam bentuk
dosis konvensional dan diberikan untuk penggunaan rutin.

VEKTOR UNTUK TRANSFER GEN

■ Komponen Dasar Plasmid (lih. Bab 1)

Terapi gen dapat digolongkan ke dalam terapi gen virus dan terapi gen nonviral,
yang keduanya bergantung pada keberhasilan konstruksi gen plasmid ekspresi gen.
Plasmid adalah molekul DNA sirkuler, untai ganda yang berisi pengkodean urutan DNA
komplementer (cDNA) untuk gen terapeutik dan beberapa elemen genetik lainnya termasuk
elemen bakteri, elemen pengaturan transkripsi (TRE), beberapa situs kloning (MCS),
wilayah yang tidak diterjemahkan. (UTR), intron, urutan polyadenylation (polyA), dan tag
fusion, yang semuanya memiliki dampak besar pada fungsi produk akhir genetik.

Elemen Bakteri

Plasmid memiliki dua fitur yang penting untuk diperbanyak pada bakteri. Salah
satunya adalah orgin replikasi bakteri (Ori), yang merupakan urutan DNA spesifik yang
mengikat faktor-faktor pengatur replikasi plasmid dan mengendalikan jumlah salinan plasmid
pada bakteri. Marker membantu dalam pemilihan ekspresi gen pada bakteri yang diinginkan.
Escherichia coli (E. coli) adalah bakteri yang biasa digunakan untuk memperbanyak
plasmid.

Elemen Pengaturan Transkripsi (TRE)

Plasmid pengekspres gen mengandung elemen pengatur transkripsi (TRE) untuk

mengontrol transkripsi. Berbagai TRE (promotor, enhancer, operator, peredam suara,
isolator, dll.) berinteraksi dengan mesin molekuler (faktor transkripsi umum, aktivator, co-
aktivator, dan penekan) untuk mengontrol pola gen ekspresi.

Promotor adalah urutan DNA yang memungkinkan agen yang akan ditranskripsi.
Promotor diakui oleh RNA polimerase dan faktor transkripsi. Cytomegalovirus (CMV), virus
Rous sarcoma (RSV), dan virus Simian 40 (SV40) adalah beberapa di antaranya promotor
virus terkuat yang diketahui. Promotor lain seperti EF-1α, promotor β-aktin ayam ditambah
dengan CMV penambah dini (CAGG), dan SV40 lebih efisien untuk mendorong ekspresi
transgen dalam sel induk.

TRE lain termasuk isolator, operator, dan peredam suara. Insulator adalah elemen
batas genetik untuk memblokir interaksi penambah-promotor atau lebih jarang hambatan
terhadap kromatin kental protein.
Multiple Cloning Site (MCS)

Beberapa situs kloning (MCS), juga dikenal sebagai polylinker, adalah segmen DNA
pendek yang berisi banyak situs pengakuan pembatasan restorasi.Dalam setiap MCS,
biasanya ada hingga 20 situs pembatasan yang dapat diidentifikasi dan mudah dibelah
dengan restriksi endonucleases yang umum digunakan.

Untranslated Regions (UTR)

Untuk mengekspresikan protein terapeutik, mRNA harus dihasilkan dari templat

cDNA yang dimasukkan dalam MCS dan diangkut ke sitoplasma menjadi diterjemahkan. 5 ′
UTR berisi elemen pengatur yang mengendalikan ekspresi gen. Intron untuk mengontrol
splicing mRNA dan ekspor. 3 ′ UTR adalah wilayah transkrip mRNA mengikuti kodon
terminasi. 3 ′ Memainkan UTR peran penting dalam stabilitas mRNA.

Intron

Wilayah pengkode protein dalam gen eukariotik adalah sering terganggu oleh
rangkaian DNA yang tidak dikode disebut intron. Dalam setiap sel eukariotik, intron adalah
ditranskripsi dengan ekson pengode protein menjadi mRNA prematur dan dihilangkan oleh
mRNA penyambungan.Intron adalah sering dimasukkan ke dalam 5 ′ UTR transkrip unit.

Urutan Polyadenylation (polyA)

Urutan polyadenylation (polyA) penting untuk ekspor nuklir, terjemahan, dan

stabilitas mRNA. Sinyal polyA adalah situs pengenalan yang terdiri dar Hexamer AAUAAA
diposisikan 10-30 nukleotida hulu dari ujung 5 ′ dan elemen kaya GU atau U terletak
maksimal 30 nukleotida di hilir 3′end. Fungsi paling penting dari urutan poliA adalah untuk
mencegah mRN degradasi enzimatik.

Tag Fusion

Tag fusi adalah protein atau peptida yang terletak di C- atau N-terminal protein target
untuk mengerahkan satu atau beberapa fungsi seperti meningkatkan ekspresi, kelarutan,
deteksi, pemurnian, atau pelokalan. Tag protein fluoresen, seperti protein fluoresensi hijau
(GFP), memberikan informasi tentang lokasi intraseluler dari ekspresi transgen. Tag fusion
seperti glutathione S-transferase (GST) dan MBP membuat isolasi protein rekombinan
menjadi mudah menggunakan kromatografi afinitas dengan resin spesifik.

VEKTOR VIRAL
 Virus memiliki keunggulan yang diwarisi untuk mengikat host dan memasukkan
materi genetic kedalam sel host secara efisien. Dalam membentuk vector virus, gen untuk
replikasi virus dan patogenesitas dihilangkan diganti dengan kaset transgen. Kemudian
genom virus rekombinan dimasukkan kedalam kumparan plasmid dan ditransduksi dikemas
menjadi garis sel yang berisi gen yang bertanggung jawab atas replikasi virus untuk
menghasilkan vector virus rekombinan.

Penyusun vector berisi urutan terminal (ITR atau LTR), sinyal kemasan (ψ), dan
kaset transgen. Sinyal kemasan (ψ) mengatur proses penting pengemasan bahan genetic
kedalam kapsid virus selama replikasi.
 Retrovirus, lentivirus, adenovirus, dan adeno associated virus (AAV) adalah vektor
virus yang banyak dipelajari dan digunakan untuk terapi gen manusia. Karakteristiknya
terdaftar dan dibandingkan pada tabel table berikut :

■ Retrovirus

Biologi
Retrovirus adalah virus RNA yang diselimuti dan mengandung 2 salinan genom
RNA untai tunggal.

Retrovirus berdiameter 80-100 nm dan memiliki genom sekitar 7-10 kb, yang terdiri
dari grup antigen spesifik (gag) kode gen untuk protein inti dan structural virus, kode gen
polymerase (pol) untuk reverse transcriptase, protease, dan integrase, serta kode gen (env)
untuk lapisan protein retroviral. Long terminal repeats (LTRs) mengontrol ekspresi gen virus.
Elemen terakhir genome, sinyal pengemsan (ψ), membantu membedakan RNA virus dari
RNA inang.
Setelah pengikatan virus dan memasukkan RNA virus kedalam sel inang, reverse
transcriptase mengubah RNA virus menjadi DNA beruntai ganda. Konstruksi terintegrasi,
provirus, akan menjalani transkripsi dan translasi untuk menghasilkan RNA genomic virus
dan mRNA yang mengkode protein virus.

Kesesuaian Retrovirus Sebagai Vektor Untuk Transfer Gen

Untuk menghasilkan vector retroviral yang kurang repklikasi, urutan yang
mengkode protein virion (gag, pol, dan env) yang bertanggung jawab pada replikasi virus
dan patogenisitas digantikan oleh transgen. Transgen dapat dikontrol oleh LTRs atau
sekuens promoter.Genom chimeric dimasukkan kedalam sel pengemasan, sebagian besar
sel HEK293 untuk menghasilkan vector retroviral.
Vektor retroviral memiliki beberapa aplikasi transfer gen. Dapat menampung kaset
transgen sebesar 8 kb. Mampu berintegrasi kedalam genom inang. Retrovirus juga dapat
digunakan untuk mengarahkan transdifferensiasi sel induk atau memprogram ulang
diffensiasi sel somatic agar memiliki sifat seperti sel induk. Fitur tersebut membut retrovirus
berharga sehingga muncul nama “terapi gen berbasis sel induk”. Namun ada beberapa
kelemahan dari vector ini. Retrovirus tidak dapat mentransduksi sel yang tidak membelah.
Selain itu, metode saat ini dari produksi virus menghasilkan persiapan diman titer virus
sangat rendah (1x105-1x107 partikel virus aktif/ml), membuat penggunaan klinisnya sulit.
Retrovirus juga tidak aktif oleh sistem komplemen dan dengan cepat dihapus dari sirkulasi
sistemik.
Keterbatasan utama terapi gen berbasis retrovirus adalah bahwa retrovirus secara
acak memasukkan bahan genetic kedalam genom inang. Jika bahan genetic yang
dimasukkan di tengah gen sel inang, maka gen akan terganggu (insersional mutagenesis).
Jika gen yang mengatur pembelahan sel, maka pembelahan sel tidak terkontrol (penyisipan
onkogenesis). Untungnya masalah ini mulai diatasi oleh seng nuclease yang telah dirancang
khusus (ZFNs) atau oleh manipulasi genetic LTR genom virus.

Penggunaan Klinis Retrovirus

Sekitar 20% dari uji klinis yang aktif saat ini menggunakan vector retroviral untuk
transver gen. Moloney murine leukemia virus (MoMLV), salah satu retrovirus yang
dikarakterisasi secara menyeluruh, adalah vector virus pertama yang digunakan secara
klinis untuk mengobati defisiensi ADA yang disebabkan oleh SCID,ADA merupakan
rekombinan yang mengekspresikan MoMLV yang digunakan untuk mentransduksi limfosit T
autologus yang diisolasi dari pasien ex vivo.

Percobaan klinis lain yang berhasil menggunakan retrovirus adalah untuk mengobati
bentuk langka dari X yang terkait dengan kombinasi immunodefisiensi (X-SCID). Namun
sindrom leukimia dilaporkan pada beberapa pasien yang terdaftar dalam uji coba.Akibatnya
Administrasi Makanan dan Obat-obatan Amerika Serikat (FDA), Komite Penasihat Terapi
Gen (GTCA), dan Komite Keselamatan Obat di Inggris telah menyatakan bahwa pendekatan
ini tidak boleh menjai terapi lini pertama untuk X-SCID , tetapi harus dipertimbangkan
dengan tidak adanya pilihan terapi lainnya.

■ Lentivirus

Biologi Lentivirus adalah retrovirus yang unik mampu mewakili keadaan di kedua hal
yaitu membagi dan membelah sel. HIV adalah salah satu contoh lentivirus terkenal. Sel
HEK293 garis-garis yang paling sering digunakan kemasan sel untuk generasi lentivirus.

Kesesuaian Lentivirus Sebagai Vektor Untuk Gene Transfer

Signifikan dari vektor lentiviral terletak pada kenyataan bahwa mereka dapat secara
efisien mentransduksi sel-sel yang tidak membelah atau sel-sel yang berbeda secara
terminal seperti neuron, makrofag, sel-sel induk hematopoietik, otot, dan sel-sel hati serta
jenis sel lainnya yang berbasis retrovirus.

Lentivirus tidak menimbulkan respons imun yang signifikan dan karenanya ideal
untuk ekspresi gen in vivo. Nanopartikel magnetik telah digunakan untuk pengiriman vektor
lentiviral yang ditargetkan ke sel endotel bahkan dalam pembuluh darah perfusi.

Penggunaan Klinis Lentiviral Vektor

Karena risiko yang dirasakan terkait dengan penggunaan lentivirus, uji klinis dengan
vektor-vektor ini tidak dimulai sampai tahun 2001, yang sebagian besar untuk mengobati
infeksi HIV. Tujuan klinis untuk pendekatan pengobatan ini adalah untuk mengurangi viral
load HIV dan mempromosikan kelangsungan hidup sel T CD4 in vivo. Hasil dari uji coba ini
menunjukkan bahwa meskipun tidak ada efek samping serius terkait pengobatan yang
terjadi, tidak ada efek anti-HIV yang signifikan secara statistik dapat diamati dalam uji coba
percontohan.

■ Adenovirus
 Adenovirus adalah non-envelope (tanpa bilayer lipid luar), icosahedral, virus DNA litik
yang terdiri dari nukleokapsid dan genom beruntai ganda linier. Adenovirus mampu
menginfeksi sel yang membelah dan yang tidak membelah.Mereka dikelompokkan menjadi
7 subkelompok (A-G),Serotipe 2 dan 5 adenovirus adalah yang paling banyak dipelajari dan
pertama kali digunakan sebagai vektor untuk terapi gen. Genom adenoviral adalah linier,
Gen awal mengkode protein yang diperlukan untuk replikasi virus, sedangkan gen akhir
mengkode protein untuk berkumpul menjadi partikel virus Infeksi Adenovirus. Setelah
pengikatan awal, dasar penton berinteraksi dengan integrin pada permukaan sel untuk
memulai serangkaian proses pensinyalan sel. Partikel adenovirus memasuki nukleus 30
menit setelah kontak seluler awal. Replikasi DNA virus dan perakitan partikel di Sebuah
nukleus dimulai 8 jam setelah infeksi dan berujung pada pelepasan 10 4-10 partikel virus
matang per sel, 30-40 jam pasca infeksi oleh lisis sel.

Kesesuaian Adenovirus sebagai Vektor untuk Transfer Gen

Untuk menyusun vektor adenoviral untuk terapi gen, wilayah E1 dan E3 dari genom
virus sering dihapus untuk mencegah replikasi virus dan mengakomodasi kaset-kaset
transgen.Selain itu, adenovirus dengan penghapusan E1, E3, dan E4, serta adenovirus
“gutless” (adenovirus tanpa daerah kode virus) telah disusun untuk mendorong ekspresi
transgen.

Karakteristik lain yang menguntungkan dari adenovirus yaitu bahwa biologi virus
dipahami dengan baik, virus rekombinan dapat dihasilkan dengan titer dan kemurnian
tinggi, ekspresi transgen dari adenovirus cepat dan kuat, dan bahwa adenovirus dapat
 menginfeksi sel yang membelah ataupun tidak.Sementara ini meminimalkan risiko
mutagenesis insersional, ekspresi gen sementara membuat adenovirus tidak cocok untuk
penyembuhan jangka panjang cacat genetik.

Kelemahan yang tidak dapat diterima dari penggunaan Adenovirus rekombinan

adalah kemampuan yang kuat virus untuk memperoleh respons imun termasuk “imunitas
seluler” penghasil limfosit dan “imunitas humoral” penghasil antibodi.Imunitas serotipe 5
adenovirus yang sudah ada sebelumnya telah terbukti secara signifikan mengurangi
kemanjuran vektor-vektor ini dalam studi praklinis dan uji klinis.

Imonogenisitas adenovirus rekombinan juga meningkatkan keamanan intensif

dalam aplikasi klinisnya. Respons imun masif yang disebabkan oleh pemberian adenovirus
dapat menyebabkan kegagalan banyak organ dan kematian otak. Studi praklinis juga
menegaskan bahwa respons imun yang dihasilkan oleh vektor adenovirus harus ditekan
sebelum efek terapeutik dapat diharapkan.

Upaya yang dapat dilakukan telah diajukan untuk mengatasi masalah respon
imun sistemik yang diinduksi adenovirus. Adenovirus “Stealth” yang dilapisi dengan
polietilen glikol (PEG) atau polimer lain juga dirancang untuk mengurangi imunogenisitas,
meningkatkan waktu sirkulasi darah, dan memperpanjang ekspresi transgen. Namun,
menutupi adenovirus dengan PEG atau polimer lain secara signifikan menurunkan efisiensi
transfer gen adenovirus.

Penggunaan Klinis Vektor Adenoviral

Hari ini, sekitar 23 % dari semua uji klinis terapi gen melibatkan adenovirus
rekombinan, menjadikannya vektor yang paling banyak digunakan untuk transfer gen
.Masalah keamanan mengenai imunogenisitas adenovirus adalah rintangan utama untuk
aplikasi klinisnya.Selain itu, meskipun lebih dari 300 uji klinis yang telah menunjukkan itu
ditoleransi dengan baik dan efisien dalam transfer gen, kemanjuran klinis vektor ini belum
dapat dibuktikan.

Namun, terobosan tertentu dalam terapi gen berbasis adenovirus telah

dibuat. Dengan bantuan dari strategi bertarget jaringan spesifik, generasi baru vektor
adenoviral lebih kecil kemungkinannya untuk menginduksi kekebalan sistemik yang parah.
Cerepro, sebuah obat yang terdiri dari thymidine kinase (TK) yang mengkode adenovirus
rekombinan.

■ Adeno-Associated Virus (AAV)

 Genom AAV berukuran 4,7 kb linear, merupakan molekul DNA untai tunggal terdiri
dari dua frame pembacaan terbuka (ORF), rep, cap, dan dua pengulangan terminal terbalik
(ITR) yang menentukan awal dan akhir dari genome virus dan urutan pengemasan. Gen rep
menyandikan protein yang bertanggung jawab untuk replikasi virus, sedangkan gen penutup
melode protein kapsid struktural. ITR diperlukan untuk replikasi, pengemasan, dan integrasi
gen.

Kapsul AAV icosahedral berdiameter 25 nm. AAV adalah deficient dalam replikasi,
dan tidak ada sel pembungkus yang dapat mengekspresikan semua protein yang
berhubungan dengan replikasi dari AAV.Karena itu AAV membutuhkan koinfeksi dengan
virus penolong, seperti adenovirus atau virus herpes simplex untuk ditiru.

Gambar 24.7 ■ Siklus hidup AAV.

Virus yang Cocok Terhadap Adeno untuk Transfer Gen

Vektor AAV diproduksi dengan mengganti gen rep dan cap dengan transgen.
Kapasitas vektor ini pengemasannya terbatas (4,7 kb) untuk transgen. Gen yang besar tidak
cocok untuk digunakan dalam vektor AAV standar. Untuk mengatasi kapasitas pengkodean
yang terbatas, ITRs dari dua genom AAV dapat diambil untuk membentuk struktur head-
totail melalui trans-splicing antara dua genom.
 Pemberian vektor AAV intravena pada tikus menyebabkan produksi sementara dari
sitokin pro-infl amasi dan infiltrasi neutrofil yang terbatas, berbeda dengan respons bawaan
yang berlangsung selama 24 jam atau lebih lama yang disebabkan oleh virus agresif.

Penggunaan Klinis Vektor Virus Adeno-Associated

Penggunaan klinis pertama AAV rekombinan adalah untuk mentransfer cystic fibrosis
transmembrane conductance regulator (CFTR) cDNA ke epitel pernapasan untuk mengobati
fibrosis kistik. Ini adalah percobaan pertama yang menunjukkan bahwa terapi gen dapat
mengobati fibrosis kistik secara positif.

VEKTOR NONVIRAL

Vektor nonviral secara signifikan kurang imunogenik dan tidak cenderung

menginduksi mutagenesis insersi dan rekombinasi homolog yang tidak diinginkan setelah
diserap oleh sel. Mereka juga relatif mudah untuk dimanipulasi dalam skala besar
dibandingkan dengan virus laiannya. Terapi gen nonviral meliputi pemberian plasmid
telanjang secara lokal atau menggunakan pembawa khusus untuk mengirim plasmid ke area
ini.

■ Metode Pengiriman untuk Transfer Gen Nonviral

Metode Fisik untuk Transfer Gen

Teknik awal untuk mengirimkan DNA rekombinan ke target seluler meliputi injeksi
mikro, penembakan partikel, dan elektroporasi. Mikroinjeksi, injeksi langsung DNA atau RNA
ke dalam sitoplasma atau inti sel tunggal, adalah metode paling sederhana dan paling
efektif. Pengeboman partikel, atau perawatan senjata gen, dimulai dengan melapisi partikel
tungsten atau emas dengan DNA plasmid. Partikel yang dilapisi dimasukkan ke dalam laras
senapan gen, dipercepat dengan tekanan gas dan ditembakkan ke sel atau jaringan yang
ditargetkan dalam cawan petri. Pengeboman partikel dapat digunakan untuk
memperkenalkan berbagai vaksin DNA ke dalam sel yang diinginkan secara in vitro.
Elektroporasi digunakan untuk menghasilkan pori-pori sementara di membran plasma untuk
mentransfer DNA plasmid ke sel-sel oleh medan listrik tegangan tinggi yang diterapkan
secara eksternal. Transfer gen yang dilakukan secara elektroporasi juga menunjukkan
keamanan dan keefektifan dalam uji klinis untuk mengobati melanoma, kanker prostat, dan
infeksi HIV. Metode fisik lainnya untuk transfer gen termasuk sonoporasi, iradiasi laser,
magnetofeksi, dan hidroporasi..
Gambar 24.8 ■ Hambatan untuk pengiriman gen nonviral. Setelah pemberian secara
sistemik, obat gen (plasmid atau siRNA) bercampur dengan nuklease darah. Kemudian
mereka dapat melintasi penghalang pembuluh darah dan kompartemen matriks
ekstraseluler sebelum melintasi penghalang membran plasma. Saat memasuki sel melalui
endositosis yang dimediasi reseptor, mereka terperangkap dalam endosom dan perlu
berelease dalam sitosol. Pelarian endosomal adalah langkah utama yang membatasi kadar
dalam pengiriman gen.
Lipid Kationik

Umumnya lipid kationik tersusun atas gugus anchor lipid hidrofobik, gugus linker
(ester, amida, karbamat), gugus head lipid yang berinteraksi dengan DNA plasmid
bermuatan negatif yang menyebabkan kondensasi dan pembentukan agregasi .Lipid
kationik biasanya dicampur dengan dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) untuk
mengurangi toksisitas dan meningkatkan pengiriman gen. PEGilasi poliplex digunakan untuk
mengurangi pengikatan plasma dan meningkatkan waktu sirkulasi liposom kationik.
Peptida

Peptida kationik memadatkan DNA seperti lipid kationik dan digunakan sebagai
pembawa pengiriman gen. Namun, PLL menyebabkan peningkatan sitotoksisitas dengan
peningkatan panjang, menunjukkan efisiensi transfeksi terbatas dan membutuhkan
penambahan agen endoosmolitik (peptida fusogenik) untuk memfasilitasi pelepasan plasmid
ke dalam sitoplasma. Sistem pengiriman gen berbasis peptida berpotensi untuk mengatasi
hambatan ekstraseluler dan intraseluler menggunakan urutan peptida tunggal. Namun,
terjadi pengikatan dan pengambilan protein plasma yang tidak spesifik oleh sistem
retikuloendotelial.

Polimer

Polimer kationik sintetik dan alami tergolong pembawa gen, contohnya

polyethyleneimine (PEI) digunakan untuk pengiriman gen. PEI dengan berat molekul tinggi
(> 25 kD) sangat sitotoksik karena menginduksi gangguan membran sel yang menyebabkan
nekrotis sel dan gangguan membran mitokondria yang mengarah ke apoptosis. PEI
berikatan dengan komponen darah, matriks ekstraseluler, dan sel yang tidak ditargetkan
setelah injeksi intravena. Oleh karena itu, dilakukan modifikasi PEI misalnya lipopolymer
cholesteryl chloroformate yang menunjukkan penurunan toksisitas dan efisiensi transfer gen
yang optimal.

■ Penggunaan Klinis Vektor-Nonvirus

Tidak dimungkinkan, dengan teknologi nonvirus saat ini, untuk mencocokkan efisiensi
transduksi yang tinggi dan tingkat ekspresi yang tinggi terapi gen nonviral dapat memberikan
cara untuk mencapai ekspresi jangka pendek dari produk gen terapeutik di jaringan tertentu
dengan tingkat keamanan yang tinggi.

uCRntuk menilai kemurnian persiapan DNA plasmid akhir, keamanan, dan potensi terapi
gen dan aplikasi vaksin DNA tercantum pada berikut:
 Saat ini ada 333 uji klinis menggunakan DNA plasmid untuk mengobati sejumlah
penyakit. Banyak uji coba ini masih dalam tahap I pengujian sejauh ini yang secara kolektif,
memberikan "prinsip pembuktian" . Juga harus disebutkan bahwa sebagian besar uji coba
ini tidak terkontrol, label terbuka, terutama fase I untuk menyelidiki keselamatan dan
kelayakan.Hasil efikasi dari studi ini harus ditafsirkan dengan hati-hati dan hanya dapat
dinilai dengan melakukan uji coba fase II / III lebih lanjut.

TERAPI GEN BERBASIS STEM-CELL

Terapi gen berbasis stem-cell muncul dalam terapi sel dan terapi gen. Terapi sel
menggambarkan proses memasukkan sel-sel baru ke dalam jaringan untuk mendorong
terobosan regeneratif dalam kedokteran.

Terapi gen berbasis sel punca adalah proses multistep, dimulai dengan isolasi sel punca
dari pasien.Akhirnya, sel-sel induk yang ditransfusikan diinfuskan kembali ke pasien untuk
mengobati penyakit tertentu.

TERAPI STEM-CELL

Sel induk ada di semua organisme multisel dan berbagi dua sifat karakteristik.Sel induk
paling awal dalam kehidupan manusia adalah embryonic stem cells (ESC), yang mampu
berdiferensiasi menjadi turunan tiga lapisan utama: ektoderm, endoderm, dan mesoderm.

Selain ESC, ada jenis sel punca lain di jaringan dewasa mamalia yang dapat diisolasi
dari yaitu, sel punca dewasa. Sel induk dewasa memiliki kapasitas pembaruan diri dan
potensi diferensiasi yang lebih terbatas.Sel punca dewasa yang terkenal adalah
hematopoietic stem cells (HSCs) sumsum tulang,Sumsum tulang juga mengandung sel
punca dewasa yang bernama mesenchymal stem cells (MSC).

Di antara semua jenis sel induk, MSC telah menarik perhatian khusus karena
penerapannya yang luas dalam regeneratif bidang kedokteran.MSC kurang potensial untuk
menginduksi teratoma atau transformasi ganas lainnya karena mereka hanya memiliki
potensi diferensiasi terbatas.

Dibandingkan dengan sel punca dewasa lainnya seperti HSC,MSC memiliki efek trofik
dan sifat imunomodulator yang dikarakterisasi dengan baik, sehingga menjadikannya
kandidat yang baik dalam mengobati penyakit degeneratif. MSC primer atau MSC yang
dimodifikasi secara genetik juga telah digunakan dalam regenerasi hematosit, tendon,
sumsum tulang, otot, dan jaringan ikat lainnya.
 Ada dua arah utama terapi gen berbasis sel induk:

(1) sel induk digunakan sebagai vehicles pengiriman

(2) sel punca diprogram ulang dengan modifikasi genetik

STEM CELL SEBAGAI VEHICLES PENGIRIMAN GEN

Kemajuan dalam terapi gen dalam dua dekade terakhir memiliki dampak besar
bagaimana sel induk dapat digunakan untuk mengobati penyakit tertentu. Sejak kasus terapi
gen pertama yaitu gen ADA, beberapa kelompok memiliki tujuan untuk memperbaiki
defisiensi ADA secara permanen. Meskipun hasil keseluruhan mengecewakan, ekspresi
transgen dalam sel progenitor hematopoietik mampu memberikan kelangsungan hidup,
pertumbuhan, dan diferensiasi keturunan limfosit. Terapi gen berbasis sel punca juga
menunjukkan hasil yang menjanjikan dalam uji klinis X SCID pada tahun 1999. Pada empat
dari lima pasien, infus sel CD34+ yang ditransduksi menyebabkan generasi sel T transduksi
periferal. Terapi gen tradisional berfokus pada pengenalan materi genetik untuk mengobati
penyakit genetik bawaan, sedangkan terapi gen berbasis sel punca dapat mewakili
pengobatan permanen untuk penyakit genetik.
Studi praklinis baru-baru ini menunjukkan masa depan yang menjanjikan untuk
menggunakan sel induk yang dimodifikasi secara genetic tidak hanya membalikkan
ketidakmampuan MSC primer tetapi juga memberikan MSC fungsi baru untuk menargetkan
berbagai penyakit.

STEM CELL SEBAGAI OBAT REGENERATIF

Sel induk dapat diprogram ulang atau ditransdiferensiasikan dengan modifikasi

genetik untuk mengisi sel atau jaringan yang rusak.Vektor virus secara efisien
mentransduksi sel punca dan mengarahkan diferensiasinya. Peng dan rekan kerja
menunjukkan bahwa sel-sel punca otot yang secara genetik direkayasa dengan retrovirus
untuk mengekspresikan tulang-morfogenetik protein-4 (BMP4) dan VEGF mempromosikan
pembentukan tulang dan penyembuhan tulang dalam model tikus.
Hal ini lebih lanjut didukung oleh temuan Tsuda dan rekan kerja bahwa MSC yang
direkayasa secara genetik dengan adenovirus untuk mengekspresi protein morfogenetik
tulang, meningkatkan pembentukan tulang ektopik pada tikus. Studi praklinis lainnya
menunjukkan bahwa sel punca dapat melakukan transdiferensiasi menjadi berbagai jenis sel
melalui modifikasi genetik menggunakan vektor virus atau nonviral.
Vektor virus adalah alat yang paling populer untuk mengarahkan diferensiasi sel
induk dalam pengobatan regeneratif. Namun, karena risiko mutagenesis insersi dan
generasi virus yang kompeten replikasi, vektor nonviral juga dipelajari dalam terapi gen
berbasis stemcell. Corsi et al., menjelaskan cara mentransfeksi MSC menggunakan
nanopartikel kitosan-DNA dan memperkenalkan sistem ekspresi transgen nonviral untuk
memprogram ulang sel somatik ke iPSC. Sumber sel punca adalah masalah lain untuk
terapi gen berbasis sel punca. iPSC yang diinduksi dari sel somatik menawarkan alternatif
potensial untuk ESC dan sel induk dewasa lainnya yang pasokannya terbatas saat ini. Perlu
dicatat bahwa sebagian besar terapi gen berbasis sel induk, terutama yang menggunakan
retrovirus/lentivirus sebagai vektor pengiriman gen, tidak menyediakan mekanisme.
Sistem yang dapat diinduksi dapat ditambahkan ke struktur vektor untuk mencapai
kontrol temporal dan spasial dari ekspresi transgen.Untuk membersihkan kelebihan sel
punca ketika jaringan yang rusak dengan rekayasa secara genetika untuk mengekspresikan
gen "bunuh diri" secara in vivo dengan pemberian obat gansiklovir yang disetujui FDA.

SASARAN PENYAKIT BAGI TERAPI GEN

Saat ini ada 1786 uji klinis terapi gen aktif di seluruh dunia.Pengobatan penyakit
neurologis, yang telah berkembang sangat cepat dalam 5 tahun terakhir, adalah tujuan dari
2% uji klinis aktif.

Distribusi geografis uji klinis terapi gen dirangkum dalam Gambar 24.11

Indikasi umum untuk semua uji coba terapi gen di klinik dirangkum dalam Tabel 24.4.
TERAPI GEN KANKER

Terapi gen digunakan untuk mengobati kanker.gen kerentanan kanker pada individu
yang memiliki dampak signifikan dalam mencegah penyakit sebelum terjadi kanker.

Strategi untuk mencapai terapi gen ini antara lain :

■ Koreksi Mutasi Genetik

Dalam pendekatan ini, terapi gen digunakan untuk memperbaiki mutasi genetik yang
berkontribusi pada fenotip ganas dengan mengganti gen yang hilang atau menghilangkan
gen cacat.Meskipun proses kompleks perkembangan tumor dan pertumbuhan membatasi
kegunaan dari strategi ini, sekitar 12% dari uji terapi gen kanker melibatkan ekspresi
berlebih dari penekan tumor.

Mutasi pada gen p53 paling sering terlihat pada spektrum tumor.Terapi gendicine
merupakan terapi gen pertama untuk pasien , dengan kanker skuamosa kepala dan leher
namun penghantaran gen penekan tumor sulit dihantarkan.

■ Imunoterapi

Dalam pendekatan ini, terapi gen digunakan untuk merangsang kemampuan alami
tubuh untuk menyerang sel kanker.Limfosit T yang direkayasa secara genetika kemudian
mengenali antigen pada permukaan sel tumor melalui TCR dan membunuh sel tumor.

■ Sensitisasi Tumor

Dalam pendekatan ini, gen dimasukkan ke dalam sel kanker untuk membuatnya
lebih sensitif terhadap kemoterapi konvensional dan radioterapi atau perawatan lain.
mekanisme RNAi digunakan untuk mengatasi multidrug resistance (MDR) dalam sel kanker.
MDR yang biasanya mewakili ekspresi berlebih dari P-glikoprotein.

Transporter pengangkut eflux obat pada membran sel kanker merupakan hambatan
yang sering terjadi untuk keberhasilan kemoterapi. Pembungkaman gen MDR1 siRNA atau
vektor yang dimediasi secara sintetik secara luas berhasil untuk mengurangi kemoresistensi
jenis kanker tertentu.
■ Terapi prodrug- Directed Enzim- Gen

Dalam pendekatan ini, terapi gen bertujuan untuk memaksimalkan efek obat beracun
dan meminimalkan efek sistemik di dalam tumor.Gen bunuh diri biasanya berasal dari virus
atau prokariotik tanpa homolog manusia. Namun, ini bukan persyaratan mutlak asalkan
prodrug tidak diaktifkan pada tingkat signifikan oleh enzim seluler asli.
 ilustrasi skematis Terapi prodrug- Directed Enzim- Gen

Kombinasi yang berhasil dari sistem gen bunuh diri dan imunoterapi untuk mengobati
metastasis hati pada tikus.Ada beberapa varian terapi enzim-prodrug antara lain Herpes
simplex virusthymidine kinase (HSV tk) / sistem gansiklovir, sistem cytosine deaminase / 5-fl
uorocytosine, sistem nitroreductase / CB1954, dan sistem G2 / CMDA carboxypeptidase.

Cerepro adalah adenovirus yang mengandung herpes simplex tipe-1 timidin kinase
transgen untuk mengobati glioma ganas bersama dengan gansiklovir.

■ Virus Oncolytic (Viroterapi)

Dalam pendekatan ini, virus oncolytic secara langsung dimasukkan ke dalam tumor
untuk menginduksi kematian sel melalui replikasi virus, ekspresi protein sitotoksik, dan lisis
sel. Virus Vaccinia, herpes simplex tipe-I (HSV), reovirus, virus penyakit Newcastle,
poliovirus, dan adenovirus sering dipilih.

Obat yang terbuat dari adenovirus replikasi kondisional di Cina digunakan untuk
mengobati kanker kepala dan leher.Obat ini juga diakui dalam uji klinis untuk mengobati
kanker paru-paru, kanker hati, kanker pankreas, dan efusi ganas.

■ Terapi Gen Nonvirus

Dalam dua dekade terakhir, terapi gen telah banyak digunakan dalam uji klinis untuk
pengobatan kanker dan hasilnya cukup menggembirakan. Sebagian besar uji klinis
menggunakan terapi gen berbasis vektor virus, mungkin karena efisiensi transfeksi yang
tinggi strategi ini. Terlepas dari kenyataan bahwa terapi gen berbasis nonviral relatif lebih
aman dan lebih sedikit tumorigenik, pekerjaan yang luas masih diperlukan untuk lebih
mengoptimalkan strategi ini untuk membuat secara klinis dapat diterima.
PENYAKIT MONOGENETIK

Tujuan terapeutik utama terapi gen untuk kelainan monogenetik adalah mengganti
gen cacat secara permanen dengan salinan yang baik untuk mengembalikan fungsi normal
dan membalikkan proses penyakit secara permanen., untuk mencegah transfer gen yang
berhasil untuk penyakit monogenetik sampai saat ini termasuk (a) kurangnya teknologi
pengiriman gen yang cocok, (b) interaksi yang tidak menguntungkan antara inang dan
vektor transfer gen, (c) biologi kompleks dan patologi penyakit monogenetik dan organ
target , dan (d) kurangnya langkah-langkah yang relevan untuk menilai efektivitas klinis
transfer gen.

PENYAKIT KARDIOVASKULAR

penyakit ardiovaskular adalah kelompok penyakit terbesar ketiga yang diobati secara
aktif dengan uji klinis terapi gen. Kebanyakan uji klinis untuk penyakit kardiovaskular
dirancang untuk mengobati iskemia koroner dan perifer. Ekspresi berlebihan faktor pro-
angiogenik seperti faktor pertumbuhan endotel vaskular (VEGF), faktor pertumbuhan
fibroblast (FGF), dan faktor pertumbuhan hepatosit (HGF) telah efektif dalam iskemia
miokard dan perifer pada studi praklinis. Efektivitas terapi gen untuk penyakit kardiovaskular
kemungkinan besar akan ditingkatkan dengan strategi yang menggabungkan beberapa
target gen dengan pendekatan berbasis sel.

PENYAKIT INFEKSI

Transfer gen untuk memperoleh sindrom imunodefisiensi (AIDS) yang didapat

adalah aplikasi utama dalam kategori ini. Banyak uji coba terapi gen untuk AIDS melibatkan
transfer materi genetik secara ex vivo ke sel T autologous menggunakan vektor virus yang
secara inaktivasi atau bereplikasi secara kondisional untuk meningkatkan sistem kekebalan
pasien. Pencapaian paling penting dalam studi terapi gen untuk mengobati penyakit menular
adalah pengembangan vaksinasi DNA, suatu teknik untuk melindungi inang dari penyakit
dengan menghasilkan respons imunologis melalui suntikan DNA virus yang direkayasa
secara genetika (lihat Bab 22).

PENYAKIT NEUROLOGIS

Penyakit neurologis paling umum yang ditargetkan oleh gen terapi adalah penyakit
Alzheimer dan penyakit Parkinson. Secara singkat, fibroblas autologous diperoleh dari biopsi
kulit kecil di setiap individu secara genetic dan dimodifikasi untuk diproduksi untuk
mensekresi NGF manusia menggunakan vektor retroviral dan ditanamkan kembali ke otak
depan. Hasilnya ditunjukkan peningkatan dalam tingkat penurunan kognitif, peningkatan
yang signifikan dalam konsentrasi kortikal 18-fluorodeoxyglucose dan pertumbuhan saraf
yang kuat tanggapan terhadap NGF. Hasil penelitian menunjukkan bahwa terapi gen AAV-
GAD aman dan ditoleransi dengan baik oleh pasien Penyakit Parkinson.

ISU REGULASI PRODUK GEN TERAPI

Di Amerika Serikat dua organisasi di dalam Departemen Kesehatan dan Manusia

Amerika Serikat Layanan (DHHS), Kantor untuk Penelitian Manusia Perlindungan (OHRP)
dan Makanan dan Obat-obatan Administrasi (FDA), memiliki wewenang khusus dijelaskan
dalam Kode Peraturan Federal (CFR). Pusat FDA untuk Evaluasi dan Penelitian Biologi
(CBER) mengawasi uji klinis terapi gen manusia yang dilakukan oleh produsen. Produk
terapi gen apa pun harus diuji secara ekstensif untuk memenuhi persyaratan FDA untuk
keamanan dan kemanjuran sebelum persetujuan untuk pemasaran. Semua protokol
percobaan klinis terapi gen harus dilakukan dalam aplikasi Investigational New Drug (IND).
Setiap penelitian transfer gen manusia yang menerima dana NIH harus didaftarkan dengan
OBA dan- ditinjau oleh RAC.
 PENUTUP

Kesimpulan

Dalam 20 tahun terakhir banyak vector dikembangkan untuk transfer gen sekarang
telah diuji di klinik. Tiga produk (Gendicine dan Oncorine di Cina, Cerepro di Eropa) telah
diberi pemasaran persetujuan dan beberapa lainnya sedang dalam tahap akhir pengujian.
Meskipun biologi vektor transfer gen adalah dipahami dengan baik, beberapa hambatan
harus diatasi untuk mengubah gen menjadi terapi.

Faktor-faktor lain seperti penggunaan obat bersamaan dan kondisi medis bersamaan
serta penilaian efek plasebo perlu distandarisasi untuk mendapatkan hasil yang optimal dan
dapat direproduksi pada kelompok penelitian yang berbeda. Di masa depan, lebih jauh
pengembangan obat-obatan genetik yang bisa luas digunakan akan sangat bergantung
pada kolaborasi antara lembaga akademik dan mitra komersial dari industri farmasi dan
bioteknologi.