Beberapa spesies bakteri tertentu dapat membentuk spora.

Spora
dihasilkan di dalam tubuh vegetatif bakteri tersebut, dapat berada di
bagian tengah (central), ujung (terminal) ataupun tepian sel. Pelczar
(1986), menyatakan bahwa spora merupakan tubuh bakteri yang secara
metabolik mengalami dormansi, dihasilkan pada faselanjut dalam
pertumbuhan sel bakteri yang sama seperti asalnya, yaitu sel vegetatif.
Spora bersifat tahan terhadap tekanan fisik maupun kimiawi.

Santoso (2010) menyebutkan bahwa ada dua genus bakteri yang dapat
membentuk endospora, yaitu genus Bacillus dan genus
Clostridium.Strukturspora yang terbentuk di dalamtubuh vegetative bakteri
disebut sebagai ‘endospora’ (endo=dalam, spora=spora) yaitu spora yang
terbentuk di dalam tubuh. Secara sederhana, dapat dikatakan bahwa
endospora merupakan sel yang mengalami dehidrasi dengan dinding
yang mengalami penebalan serta memiliki beberapa lapisan tambahan.

Dengan adanya kemampuan untuk membentuk spora ini, bakteri tersebut

dapat bertahan pada kondisi yang ekstrim.Menurut Pelczar (1986) bakteri
yang dapat membentuk endospore ini dapat hidup dan mengalami
tahapan-tahapan pertumbuhan sampai beberapa generasi, dan spora
terbentuk melalui sintesis protoplasma baru di dalam sitoplasma sel
vegetatifnya.

Menurut Volk & Wheeler (1988), dalam pengamatan spora bakteri

diperlukan pewarnaan tertentu yang dapat menembus dinding tebal spora.
Contoh dari pewarnaan yang dimaksudkan oleh Volk & Wheeler tersebut
adalah dengan penggunaan larutan hijau malakit 5%, dan untuk
memperjelas pengamatan, sel vegetative juga diwarnai dengan larutan
safranin 0,5% sehingga sel vegetative ini berwarna merah. Dengan
demikian ada atau tidaknya spora dapat teramati, bahkan posisi spora di
dalam tubuh sel vegetative juga dapat diidentifikasi.Namun ada juga zat
warna khusus untuk mewarnai spora dan di dalam proses pewarnaannya
melibatkan treatment pemanasan, yaitu; spora dipanaskan bersamaan
dengan zat warna tersebu tsehingga memudahkan zat warna tersebut
untuk meresap ke dalam dinding pelindung spora bakteri.

Beberapa zat warna yang telah disebutkan di atas, dapat mewarnai spora
bakteri, tidak lepas dari sifat kimiawi dinding spora itu sendiri.Semua spora
bakteri mengandung asam dupikolinat.Yang mana subtansi ini tidak dapat
ditemui pada sel vegetatif bakteri, atau dapat dikatakan, senyawa ini khas
dimiliki oleh spora.Dalam proses pewarnaan, sifat senyawa inilah yang
kemudian dimanfaatkan untuk di warnai menggunakan pewarna tertentu,
dalam hal ini larutan hijau malakit. Sedangkan menurut pelczar (1986),
selain subtansi di atas, dalam spora bakteri juga terdapat kompleks
Ca2+dan asam dipikolinan peptidoglikan.

Proses pembentukan spora disebut sprorulasi, pada umumnya proses ini

mudah terjadi saat kondisi medium biakan bakteri telah memburuk, hal ini
sesuai dengan kenyataan bahwa, sampel yang diambil dalam praktikum
ini berasal dari biakan bakteri yang dibuat beberapa minggu yang lalu,
sehingga di asumsikan, nutrisi di dalam medium telah hampir habis,
sehingga diharapkan bakteri melakukan proses sporulasi ini. Haapan ini
terbukti benanr dengan kenyataan bahwa dari kedua sampel yaitu koloni 1
dan koloni 2, keduanya sama-sama menghasilkan spora.

Namun menurut Dwijoseputro (1979) beberapa bakteri mampu

membentuk spora meskipun tidak dalam keadaan ekstrem ataupun
medium yang kurang nutrisi. Hal ini dimungkinkan karena bakteri tersebut
secara genetis, dalam tahapan pertumbuhan dan perkembangannya
memang memiliki satu fase sporulasi. Masih menurut Dwijoseputro (1979)
jka medium selalu diadakan pembaruan dan kondisi lingkungan disekitar
bakteri selalu dijaga kondusif, beberapa jenis bakteri dapat kehilangan
kemampuannya dalam membentuk spora. Hal ini dimungkinkan karena
struktur bakteri yang sangat sederhana dan sifatnya yang sangat mudah
bermutasi, sehingga perlakuan pada lingkungan yang terus menerus
dapat mengakibatkan bakteri mengalami mutasi dan kehilangan
kemampuannya dalam membentuk spora.

Proses pembentukan spora di dalam sel vegetatif bakteri, terjadi dalam

beberapa tahapan, secara singkat bagan proses pembentukan spora
bakteri di atas dapat dijelaskan sebagai berikut:
1. Terjadi kondensasi DNA pada bakteri yang akan membentuk spora
2. Terjadi pembalikan membran sitoplasma, sehingga, lapisan luar
membran kini menjadi lapisan dalam membran (calon) spora.
3. Pembentukan korteks primordial (calon korteks)
4. Pembentukan korteks
5. Spora terlepas dan menjadi spora yang bebas, pada tahap 5 ini,jika
spora mendapatkan lingkungan yang kondusif, maka ia bisa tumbuh
menjadi satu sel bakteri yang baru. (sumber: FMIPA UPI)

Spora bakteri ini dapat bertahan sangat lama, ia dapat hidup bertahun-
tahun bahkan berabad-abad jika berada dalam kondisi lingkungan yang
normal. Kebanyakan sel vegetatif akan mati pada suhu 60-70oC, namun
spora tetap hidup, spora bakteri ini dapat bertahan dalam air mendidih
bahkan selama 1 jam lebih. Selama kondisi lingkungan tidak
menguntungkan, spora akan tetap menjadi spora, sampai kondisi
lingkungan dianggap menguntungkan, spora akan tumbuh menjadi satu
sel bakteri yang baru dan berkembangbiak secara normal (Volk &
Wheeler, 1988)

Posted by JavAurora on 3 Juli 2011 in Ilmiah and tagged Pewarnaan, spora bakteri

http://erickbio.wordpress.com/2011/07/03/pewarnaan-spora-bakteri-2/

Pewarnaan Gram merupakan salah satu teknik pewarnaan yang dikerjakan di

laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme. Morfologi
mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pewarnaan
tertentu (pewarnaan Gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal.
Pewarnaan Gram
Posted on September 11, 2011 by Tito Wahyu Anggoro
http://mikrobiologiku.wordpress.com/2011/09/11/pewarnaan-gram/

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-
sifat yang khas, termasuk bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan
kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara
untuk melihat dan mengamati bentuk sel bakteri dalam keadaan hidup sangat
sulit, sehingga untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau
pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Hal
tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui
reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. Oleh karena itu teknik
pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam
penelitian-penelitian mikrobiologi.

Struktur di dalam sel pada tempat-tempat yang dibentuk oleh spesies ini, disebut
endospora. Endospora dapat bertahan hidup dalam keadaan kekurangan nutrien,
tahan terhadap panas, kekeringan, radiasi UV serta bahan-bahan kimia. Ketahanan
tersebut disebabkan oleh adanya selubung spora yang tebal dan keras. Sifat-sifat
ini menyebabkan dibutuhkannya perlakuan yang keras untuk mewarnainya.
Hanya bila diperlukan panas yang cukup, pewarna yang sesuai dapat menembus
endospora. Tetapi sekali pewarna memasuki endospora, sukar untuk dihilangkan.
Ukuran dan letak endospora di dalam sel merupakan ciri-ciri yang digunakan
untuk membedakan spesies-spesies bakteri yang membentuknya.

Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna

, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu
preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam
encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang
tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan
asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies
 LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI UMUM
PENGECATAN MIKROBA :
PENGECATAN SEDERHANA, GRAM, DAN KAPSUL

Disusun oleh :
1. Nur Afidatul Maulidiyah (080914016)
2. Citra Hardiyanti Rukmana (080914019)
3. Ratih Kuspriyadani (080914023)
4. Lyna Febriyanti (080914029)
5. Evi Kustiningtyas (080914031)
6. Hendra Susilo (080914053)
7. Pratima Niana (080914118)

Dosen Pembimbing :
Tri Nurhayati, S.Si., M.Kes.
Fatimah, S.Si., M.Kes.

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS AIRLANGGA
TAHUN 2010

I. TUJUAN
Memberi pengetahuan dan keterampilan mahasiswa dalam hal : dasar
kimiawi dan teoritis pewarnaan biologis, teknik preparasi smear, serta
pewarnaan sederhana dan diferensiasi.
II. BAHANPRAKTIKUM
1. Pseudomonassp;
2. Bacillussubtilis;
3. Staphylococcusaereus;
4. Kristalviolet,iodine,safranin,alkohol,MalachitGreen;
5. Akuades.

III. ALATPRAKTIKUM
1. Tabung;
2. Raktabungreaksi;
3. Bunsen;
4. Mikroskopcahaya.
5. Objekglass;
6. Coverglass;
7. Tissue;
8. Jarumose;
9. Wadahpengering;
IV. LANDASANTEORI
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit,
karena selain tidak berwarna, bakteri itu juga transparan dan sangat
kecil. Untuk mengatasi hal tersebut, maka dikembangkan suatu teknik
pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah
diamati. Oleh karena itulah pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah
satu cara yang paling utama dalam penelitian mikrobiologi. Adapun
macam-macampewarnaan,antaralain:
1. PewarnaanSederhana
Pewarnaan sederhana merupakan pewarnaan dengan menggunakan satu
jenis pewarna saja dengan tujuan untuk mengetahui morfologi dan
susunan selnya. Pewarnaan ini dapat menggunakan pewarna basa pada
umumnya, antara lain : kristal violet, metylen blue, karbol fuchsin, dan
safranin.
2. PewarnaanGram
Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk
mengelompokkan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif.
Pewarna yang digunakan antara lain : kristal violet sebagai gram A,
iodine sebagai gram B, alkohol sebagai gram C, serta safranin sebagai
gramD.
3. PewarnaanKapsul
Pewarnaan ini mengunakan dua reagen, yaitu: kristal violet sebagai
dekolorisator (penghapus warna utama) serta kopper sulfat sebagai
pewarna tandingan teradsorbsi bahan kapsular yang mengalami
dekolorisasi. Hasil pewarnaannya ialah kapsul akan berwarna biru
terang kontras dengan warna ungu gelap dari sel.
4. PewarnaanSpora
Pewarnaan spora merupakan pewarnaan dengan menggunakan malchit
green dan safranin, yang dalam hasil pewarnaanya akan muncul warna
hijau pada sporanya, serta warna merah pada sel vegetatifnya, yaitu
padaBacillussubtilis.
Teknik- teknik pewarnaan secara umum, antara lain :
A. PewarnaanSederhana
Pewarnaan ini digunakan untuk visualisasi bentuk morfologis yang
berupa basil, kokus, basil, vibrio dan spiral), dan susunan (rantai,
gerombol,berpasangan,dantetrad).
B. Pewarnaandiferensial
Pewarnaan ini digunakan untuk pemisahan dalam kelompok yang terbagi
menjadi dua, yaitu pewarna gram dan pewarna tahan asam. Selain itu
juga digunakan untuk visualisasi struktur yang dibedakan menjadi
empat, yaitu pewarna kapsul, pewarna flagel, pewarna spora, dan
pewarna inti.
V. CARAKERJA
A. PewarnaanSederhana
1. Mensterilkan objek glass dengan melakukan preparasi slide;
2. Mensterilkan jarum ose dengan dilewatkan pada api bunsen;
3. Memberi setetes akuades dengan kondisi tidak perlu tebal dan
juga tidak perlu tipis pada objek glass;
4. Mengambil biakan dengan menggunakan jarum ose yang sudah
steril, dengan satu arah, dari baewah ke atas. Cukup satu ose saja dan
tidak boleh terlalu jauh dari api bunsen;
5. Menyebarkan jarum ose yang berisi mikroba tersebut dengan
merata, persis di atas genangan air pada objek glass tadi. Setelah
pengambilan, ose disterilkan kembali;
6. Melewatkan objek glass yang berisi mikroba tersebut pada api
bunsen hingga kering;
7. Meneteskan kristal violet hingga menutupi permukaan bakteri;
8. Mendiamkannya selama 1 menit;
9. Membilas pewarna kristal violet dengan akuades;
10. Membersihkan sisa air akuades dengan menggunakan tissue
kering;
11. Menutup bakteri dengan menggunakan cover glass;
12. Memberi minyak emersi di atas cover glass pada objek yang akan
kitaamati,
13. Mengamatislidetersebut.

B.PewarnaanGram
1. Mensterilkan objek glass dengan melakukan preparasi slide;
2. Mensterilkan jarum ose dengan dilewatkan pada api bunsen;
3. Memberi setetes akuades dengan kondisi tidak perlu tebal dan
juga tidak perlu tipis pada objek glass;
4. Mengambil biakan dengan menggunakan jarum ose yang sudah
steril, dengan satu arah, dari baewah ke atas. Cukup satu ose saja dan
tidak boleh terlalu jauh dari api bunsen;
5. Menyebarkan jarum ose yang berisi mikroba tersebut dengan
merata, persis di atas genangan air pada objek glass tadi. Setelah
pengambilan, ose disterilkan kembali;
6. Melewatkan objek glass yang berisi mikroba tersebut pada api
bunsen hingga kering;
7. Meneteskan kristal violet hingga menutupi permukaan bakteri;
8. Mendiamkannya selama 1 menit;
9. Membilas pewarna kristal violet dengan akuades;
10. Meneteskan iodine hingga menutupi permukaan bakteri kemudian
mendiamkannya selama kurang lebih 1-2 menit;
11. Membilas biakan tadi dengan air akuades;
12. Meneteskan alkohol 95% ke atas bakteri kemudian
mendiamkannyaselama30detik;
13. Membilasnyadenganaakuades;
14. Meneteskan safranin ke atas bakteri dan mendiamkannya selam
kurang lebih 1 menit, kemudian membilasnya dngan air akuades;
15. Membersihkan sisa air akuades dengan menggunakan tissue
kering;
16. Menutup bakteri dengan menggunakan cover glass;
17. Memberi minyak emersi di atas cover glass pada objek yang akan
kitaamati,
18. Mengamatislidetersebut.

C.PewarnaanSpora
1. Mensterilkan objek glass dengan melakukan preparasi slide;
2. Mensterilkan jarum ose dengan dilewatkan pada api bunsen;
3. Memberi setetes akuades dengan kondisi tidak perlu tebal dan
juga tidak perlu tipis pada objek glass;
4. Mengambil biakan dengan menggunakan jarum ose yang sudah
steril, dengan satu arah, dari baewah ke atas. Cukup satu ose saja dan
tidak boleh terlalu jauh dari api bunsen;
5. Menyebarkan jarum ose yang berisi mikroba tersebut dengan
merata, persis di atas genangan air pada objek glass tadi. Setelah
pengambilan, ose disterilkan kembali;
6. Melewatkan objek glass yang berisi mikroba tersebut pada api
bunsen hingga kering;
7. Setelah tampak keputih-putihan pada objek glass tersebut,
kemudian merendam dengan malachit green selama 10 menit;
8. Melewatkan objek glass tersebut di atas api bunsen dengan tidak
terlalu sering, dan jika pewrana sudah kering, perlu ditambhkan lagi
pewarna tersebut (diusahakan selama 10 menit tersebut malachit
green tidak kering);
9. Setelah 10 menit, mencuci objek glass dengan akuades hingga
warna hilang;
10. Mengeringkan sisa pencucian tado dengan tisue kering;
11. Merendam dengan safranin selama 1 menit;
12. Mencuci kembali dengan akuades;
13. Mengeringkan slide dengan dilewatkan pada api bunsen;
14. Menutupdengancoverglass;
15. Memberi minyak emersi di atas cover glass pada objek yang akan
kitaamati;
16. Mengamatislidetersebut.
VI. HASILPENGAMATAN
No Bakteri Pewarnaan Sederhana Pewarnaan Gram Pewarnaan
spora
1 Bacillus subtilis Strukutr morfologinya berbentuk batang (bacil),
susunan bekterinya berantai. Termasuk gram positif. Memiliki
endospora.
2 Staphylococcusaureus
Berbentuk coccus, susunan bakterinya bergerombol seperti buah
anggur. Termasukgrampositif.
3 Pseudomonas putida Berbentuk batang pendek (cocoid), susunan
bakterinyatunggal. Termasukgramnegatif.
VII. PEMBAHASAn
a. PewarnaanSederhana
1. Pewarnaan Sederhana pada Bacillus subtilis
Pada pewarnaan sederhana bakteri Bacillus subtilis zat pewarna yang
digunakan adalah kristal violet. Biakan murni diambil dari tabung reaksi
secara aseptik dan diletakkan langsung pada objek glass kemudian
difiksasi agar protein bakteri terkoagulasi serta dapat menempel pada
objek glass dan tidak ikut tercuci sewaktu dibilas dengan akuades. Hal
yang dilakukan selanjutnya adalah mengamati dalam mikroskop. Sel
bakteri berukuran sangat kecil dan tebal lapisan air tipis diantara
cover glass dan objek glass masih bisa menampung beberapa bakteri
bacillus yang ditumpuk vertikal, artinya tebal tersebut masih bisa
digunakan sel untuk berenang ke atas dan ke bawah. Jangan
menganggap gambar yang terlihat pada mikroskop adalah gambar datar.
Kontrol sangatlah penting, meskipun kita sulit untuk mendapatkannya.
Akan tetapi lebih baik jika bakteri yang dilihat dapat dibandingkan
dengan bakteri lain yang telah diketahui bentuknya dengan pasti. Dari
pengamatan mikroskopis diperoleh bentuk morfologi dari bakteri
Bacillus subtilis yaitu strukutr morfologinya berbentuk batang (bacil),
dan susunan bakterinya adalah berantai.
2. Pewarnaan Sederhana pada Pseudomonas putida
Pada pengecatan mikroba jenis Pseudomonas putida dilakukan
pengecatan dengan menggunakan zat warna basa kristal violet. Pertama
jarum inokulasi disterilkan lalu kemudian mulut tabung reaksi
disterilkan juga di api bunsen, kemudian mikroba yang ada di tabung
reaksi (media agar miring) diambil dan diletakkan di objek glass,
sebelumnya objek glass sudah diberi air sedikit. Kemudian setelah
mikroba dan air dicampur, dilakukan metode smear yaitu meratakan
mikroba kira-kira membentuk sebuah bentuk koin. Kemudian dilakukan
fiksasi yaitu dengan melewatkan smear secara cepat di api bunsen, lalu
dikering-anginkan. Setelah melakukan metode smear, selanjutnya
adalah metode pengecatan. Objek glass yang sudah di titrasi diberi
pewarna kristal violet (selama 60 detik). Kemudian diberi air aquades
untuk membersihkan kelebihan warna. Sisa-sisa air yang ada di objek
glass dibersihkan dengan tissue. Terakhir objek glass ditutup dengan
cover glass, dan diletakkan di mikroskop cahaya untuk diamati dengan
perbesaran 1000 X dengan catatan menggunakan minyak emersi
setelah menemukan titik fokus perbesaran 40 X.
3. Pewarnaan sederhana pada Staphylococcus aureus
Kaca preparat diberi setetes air dan diberi bakteri Stapylococcus
aureus, kemudian dipaskan di atas api bunsen, dari sini akan nampak
lapisan putih yang tipis, semitransparan, dan rata yang menunjukkan
adanya bakteri. Setelah smear difiksasi, smear kemudian diberi
pewarna basa yaitu metilen blue. Dalam pemberian metilen blue ini,
diusahakan agar menutupi semua lapisan tipis smear. Pewarnaan dengan
menggunakan metilen biru dibutuhkan waktu 2-60 detik, setelah itu
dicuci dengan aquades. Dari sini akan nampak lapisan yang sebelumnya
berwarna putih tipis dan semitransparan, akan berubah warna menjadi
biru transparan. Selanjutnya adalah milangkan sisa aquades dengan
menggunakan kertas tissue. Setelah itu dilihat dalam mikroskop dengan
perbesaran 1000 X. dalam mikroskop akan nampak bakteri
Stapylococcus aereus berwarna biru matang dan bentuk bulat berantai.
B.PewarnaanGram
1.PewarnaangrampadaBacillussubtilis
Pada pewarnaan ini digunakan empat pewarna, yaitu Kristal violet
sebagai pewarna utama, iodine sebagai pengikat warna utama
(mordant), alcohol sebagai dekolorisasi, dan safranin sebagai pewarna
tandingan. Pada pengamatan dengan menggunakan mikroskop nampak
Bacillussubtilisberbentukbasil(batang) dan merupakan bakteri gram
positif. Ini bisa diketahui saat tahap dekolorisasi. Pada tahap tersebut
warna yang dihasilkan sama dengan warna utama, yaitu warna ungu. Ini
menunjukkan bahwa pada Bacillus subtilis memiliki dinding yang tebal
sehinnga saat bakteri mengalami dehidrasi, pori-porinya menciut yang
akhirnya menyebabkan warna utama tidak bisa keluar. Pada Bacillus
subtilis, koloninya bergerombol sedikit terpisah-pisah bahkan
membentuk rantai panjang.
Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk
batang,dan secara alami sering ditemukan di tanah dan vegetasi.
Bacillus subtilis juga telah berevolusi sehingga dapat hidup walaupun di
bawah kondisi keras dan lebih cepat mendapatkan perlindungan
terhadap stres situasi seperti kondisi pH rendah (asam), bersifat
alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan panas atau etanol.
2. Pewarnaan Gram pada Pseudomonas putida
Pada pengamatan genus Pseudomonas dengan menggunakan pewarnaan
gram, kami menggunakan bakteri Pseudomonas putida sebagai contoh
yang mewakili. Sebelum mewarnai perlu difiksasi di atas api bunsen,
pertama kali, koloni bakteri disuspensikan secara tipis di atas akuades.
Smear yang tipis memberikan hasil pada gelas objek dan
dihomogenkan .Selanjutnya dilanjutkan dengan tehnik pewarnaan.
Pertama, menggunakan Gram A yaitu kristal violet, bakteri tampak
terwarnai ungu. Fungsi dari gram A adalah sebagai pewarna utama yaitu
pewarna yang pertama kali digunakan. Baik bakteri gram positif maupun
gram negatif memberikan warna yang sama pada pewarnaan dengan
Gram A. Setelah itu, diberikan perlakuan dengan Gram B yaitu iodin.
Fungsi dari iodin adalah sebagai mordant atau penguat warna. Kompleks
UK-Y dapat terbentuk di dalam sel. Dengan begitu, warna dari kristal
violet tetap terjaga. Kemudian dilanjutkan dengan pemberian Gram C
yaitu alkohol, yaitu berfungsi sebagai peluntur warna (dekolorisasi) dan
dehidrasi sel. Pada saat itu, di dalam dinding sel bakteri Pseudomonas
yang tersusun atas selapis sel yang tersusun atas lipid. Lipid
tereksitasi dari dinding sel,pori-pori dinding sel bakteri mengembang.
Kompleks UK-Y keluar dari sel sehingga sel menjadi tidak berwarna.
Terakhir diberi pewarna tandingan yaitu safranin. Pewarna tandingan
dapat masuk apabila pewarna utamanya telah keluar dari sel bakteri.
Bakteri pseudomonas dapat terwarnai merah. Dari uraian di atas, dapat
dilihat bahwa Pseudomonas putida memiliki karateristik mikroskopik
sebagai berikut yang diamati di bawah mikroskop cahaya yaitu :
• Gram-negatif;
• Berbentukkokoid(batangpendek);
• Tidakmembentukspora.
3.PewarnaangrampadaStaphylococcusaureus
Pewarnaan gram bertujuan untuk mengelompokkan bakteri kedalam
bakteri negatif dan bakteri positif. Staphylococcus aureus adalah
bakteri gram positif, karena bakteri tersebut tetap mempertahankan
zat warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan gram, sehingga
koloni bakteri tampak berwarna ungu atau biru. Pemberian alkohol
berfungsi untuk dekolorisasi bakteri, sehingga menyebabkan zat utama
dalam sel muncul, namun pada bakteri Staphylococcus aureus yang
termasuk gram positif jadi tidak terdekolorisasi, karena bakteri
tersebut memiliki membran plasma tunggal yang di kelilingi dinding sel
tebal berupa peptidoglikan sisanya berupa molekul lain berupa molekul
lain bernama asam teikhuat. Pada proses pewarnaan terakhir adalah
dengan pemberian safranin. Proses pewarnaan ini akan menghasilkan
bakteri dengan sel yang berwarna ungu tua atau biru, dan kapsul yang
berwarna biru terang. Staphylococcus aureus merupakan bakteri
gram positif yang tidak menghasilkan spora dan tidak motil, umumnya
tumbuh berpasangan maupun berkelompok, dengan diameter tiap sel
0,8 – 1,0 µm. Bakteri tersebut tumbuh optimum pada suhu 37º dengan
waktu pembelahan 0,47/jam. Bakteri tersebut merupakan bakteri
virulensi karena menghasilkan kapsul yang tebal untuk melindungi diri
dari fagositosis host, selain itu bakteri tersebut merupakan bakteri
patogen.
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sebagai
berikut:
1. Fase yang paling kritis dari prosedur pewarnaan gram adalah tahap
dekolorisasi yang mengakibatkan CV- iodine lepas dari sel. Pemberian
alkohol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan dekolorisasi
yang berlebih sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif.
Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan alkohol yang
tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram
negatifsepertigrampositif.
2. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur
muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh
pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada gram
positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel,
sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur.
C.PewarnaanSpora
1.PewarnaanSporapadaBacillussubtilis
Endosopora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya,
akan tetapi apabila sekali diwarnai, zat warna tersebut akan sulit
hilang. Hal inilah yang menjadi dasar dari metode pengecatan spora
secara umum. Pada metode Schaeffer-Fulton yang banyak dipakai
dalam pengecatan endospora, endospora diwarnai pertama dengan
malachite green dengan proses pemanasan. Larutan ini merupakan
pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam endospora.
Setelah perlakuan malachite green, biakan sel dicuci dengan air lalu
ditutup dengan cat safranin. Teknik ini akan menghasilkan warna hijau
pada endospora dan warna merah muda pada sel vegetatifnya.
Bacillus subtilis memiliki endospora, endospora lebih tahan lama meski
dalam keadaan lingkungan ekstrim seperti kering, panas, atau bahan
kimia yang beracun. Selain itu, endospora juga lebih tahan terhadap
pewarnaan. Sekali berhasil diwarnai, spora sangat sukar untuk
melepaskan zat warna sehingga saat diberi warna dari saftranin tetap
berwarna hijau karena spora sudah mengkiat malachit green dan sulit
mengikat warna yang diberikan kemudian.
VIII. KESIMPULAN
Berdasarkan percobaan yang dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa :
1. Pewarnaan mikroorganisme dapat dilakukan pengecatan gram,
pengecatan sederhana, dan pengecatan spora.
2. Pewarnaan sederhana digunakan untuk melihat bentuk dan struktur
sel bakteri dengan menggunakan satu jenis pewarna seperti safranin
atau kristal violet, sedangkan pewarnaan gram digunakan untuk
membedakan antara bakteri gram (+) dan gram (-) dengan lebih dari
satuzatwarna.
3. Bakteri gram negatif pada teknik pewarnaan akan menghasilkan
warna merah dan bakteri gram positif akan menghasilkan warna ungu.
4. Pengecatan spora dilakukan dengan memberi warna pada endospora
suatu bakteri. Zat pewarna yang digunakan pertama adalah malachit
green. Pengecatan spora digunakan untuk mengetahui spora dengan sel
vegatatifnya.
5. Pada preparasi smear, ketebalan smear sangat penting dalam
pengamatan di mikroskop. Smear yang baik hanya sekali, jika sudah
kering, akan nampak lapisan putih yang tipis.
6.Fiksasi panas adalah teknik yang dilakukan supaya smear bakteri
tidak tercuci selama prosedur pewarnaan. Fiksasi panas dilakukan
dengan melewatkan secara cepat smear yang dikering-anginkan dua-
tiga kali pada api bunsen.
7. Pada bakteri Bacillus subtilis dan Staphylococcus aureus termasuk
dalam gram positif dikarenakan bakteri tersebut berwarna biru atau
ungu pada pewarnaan safranin. Sedangkan bakteri Pseudomonas putida
termasuk dalam gram negatif dikarenakan bakteri tersebut berwarna
merah pada pewarnaan safranin.
IX. DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 2009.http://www.microbiologybytes.com/video/Pputida.html.
Diakses pada tanggal 28 Oktober 2010 20:09.
Dwidjoseputro, D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang :
Djambatan.
Ekmon, 2008. http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/09/kunci-awal-
identifikasi-bakteri.html) diakses pada 29 Oktober 2010 13:28.
Jimmo., 2008. http ://Pembuatan PreParAT dannn PengeCaTAnnyA__
BloG Kita.mht ,. diakses pada tanggal 28 Oktober 2010 20:29.
Nurodin, Ade., 2009.
http://adenurodin.blogspot.com/2009/12/pembuatan-preparat-
bakteri-pewarnaan.html diakses pada 29 Oktober 2010 13:17.
Schlegel, Hans. 1994. Mikrobiologi Umum Edisi Keenam. Yogyakarta:
Gajah Mada University Press.
Stanier Roger, Edward Alderberg dan John Ingraham. 1982. Dunia
Mikroba 1. Jakarta: Bharata Karya Aksara.

X. LAMPIRAN
Bacillus subtilis (sederhana)
Bacillus subtilis (gram +)

Staphylococcus aureus (sederhana)

Staphylococcus aureus (gram +)
Pseudomonas putida (sederhana)

Pseudomonas putida (gram -)

Bacillus subtilis (spora)
http://ratihkuspriyadani.blogspot.com/2010/11/laporan-praktikum-mikrobiologi-
umum.html