KROMATOGRAFI CAIR

KINERJA TINGGI (KCKT)

HIGH PERFORMANCE LIQUID

CHROMATOGRAPHIC (HPLC)

KD: MAMPU MENJELASKAN PRINSIP DAN APLIKASI

HPLC

SRI ROYANI, M.SI.

PENDAHULUAN
 Klasifikasi Kromatografi

Sumber: Ghosh dan Bhattacharya, 2009; Sopyan, 2009; De Lux Putra, 2004; Grob dan Barry, 2004; Gritter, et al., 1991
Perbandingan antara Kr. Kolom Cairan Klasik dan HPLC
 JENIS HPLC

1. Kromatografi fasa normal (Normal phase) :

- Fasa diam : polar
- Fasa gerak : kurang polar

2. Kromatografi fasa terbalik (Reverse Phase):

- Fasa diam : non polar
- Fasa gerak : lebih polar
INSTRUMENTASI

Injektor

Kolom

Fasa gerak Pompa

Pengolah data
Detektor
1. Wadah fase gerak

• Terbuat dari bahan yang inert terhadap fase gerak.

• Bahan yang umum digunakan adalah gelas dan baja anti
karat.
• Daya tampung tandon harus lebih besar dari 500 ml
sehingga dapat digunakan selama 4 jam dengan
kecepatan alir yang umumnya 1-2 ml/menit
2. Pompa

• Sistem pompa bertekanan tinggi mengalirkan pelarut /

fase gerak dari bejana pelarut ke kolom melalui pipa
tekanan tinggi.
• Jenis pompa yang dipakai antara lain pompa pneumatik,
pompa pendesakan tetap dan pompa torak dengan
pendesakan bolak-balik (paling banyak digunakan).
• Laju aliran pelarut dalam kolom pada umumnya sekitar
1-3 mL/menit dengan tekanan berkisar antara 500-
6000 psi.
• Teknik elusi HPLC dapat dilakukan secara isokratik
(komposisi pelarut tetap selama elusi) dan elusi landai
(gradient, komposisi pelarut berubah selama elusi)
3. Injektor

• Pada awalnya sampel diinjeksikan langsung kedalam

aliran pelarut dalam kolom dengan semprit mikro
melalui septum injektor menggunakan diafragma atau
tanpa diafragma.
• Volume suntik biasanya 10-50 μL
4. Kolom
• Kolom KCKT pada umumnya terbuat dari pipa baja tahan
karat.
• Merupakan jantung dari HPLC
• Berhasil tidaknya pemisahan tergantung pada pemilihan
kolom dan kondisi kerja

• Jenis kolom :
Kolom analitik : diameter 2 – 6 mm, panjang 50 – 100 cm
Kolom preparatif : diameter lebih besar, panjang 25–100 cm

• Kolom dapat dipanaskan sampai 60oC agar dihasilkan

pemisahan yang lebih efisien.
KOLOM HPLC
5. Detektor

• Detektor dihubungkan dengan pipa baja tahan karat atau

pipa jenis lainnya dengan ujung keluaran kolom.

• Guna detektor :
- mendeteksi adanya komponen dalam cuplikan
- mengukur banyaknya komponen dalam cuplikan

• Detektor memantau aliran pelarut yang keluar dari kolom

dalam waktu yang sebenarnya.
• Jenis detektor yang dipakai untuk deteksi adalah detektor
indeks bias, ultraviolet sinar tampak, fluoresensi,
elektrokimia dan spektrometri massa.
6. Rekorder
• Hasil pemisahan kromatografi biasanya ditampilkan
dalam bentuk kromatogram pada rekorder.
• Waktu retensi selalu konstan dari setiap kondisi
kromatografi yang sama dan dapat digunakan untuk
identifikasi atau analisis kualitatif.
• Luas puncak proporsional dengan konsentrasi
senyawa dalam sampel yang diinjeksikan sehingga
dapat digunakan untuk menghitung konsentrasi
senyawa dalam sampel pada analisis kuantitatif.
• Senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang
berbeda.
 FASA GERAK

• Fasa gerak mengalir ke dalam kolom dengan bantuan

pompa bertekanan tinggi, sehingga cairan fasa gerak
mengalir dengan kecepatan tinggi, sehingga
komponen-komponen cuplikan akan terelusi dengan
cepat.
• Komposisi cairan fasa gerak (pelarut), merupakan
salah satu variabel yang mempengaruhi pemisahan
• Dapat dipakai berbagai macam pelarut sebagai fasa
gerak.
Syarat-syarat cairan fasa gerak :
• Inert (tidak boleh mengubah kolom & sifat-sifatnya)
• Murni tidak ada pengotor
• Dapat melarutkan cuplikan
• Sesuai dengan detector
• Mempunyai viskositas rendah
• Harus bebas dari gas-gas terlarut.
• Perlu dilakukan degassing, sehingga udara terlarut keluar.
Adanya gas terlarut menyebabkan gelembung-gelembung
pada detektor, menyebabkan noise pada output detektor.
Jenis elusi :
- Elusi isokratik : bila elusi dilakukan dengan satu
pelarut dan dengan komposisi tetap.

- Elusi bergradien (gradient elution) / pemrograman

pelarut, yaitu :
Mengubah komposisi fasa gerak pada waktu
analisis sedang berlangsung, akibatnya
memperpendek tR komponen-komponen yang
ditahan kuat oleh kolom.
Keuntungan elusi bergradien :
• Waktu analisis secara keseluruhan dapat diperpendek
• Resolusi (daya pisah) dari campuran dapat
ditingkatkan
• Bentuk puncak lebih baik (pembentukan ekor / tailing
berkurang)
• Kepekaan efektif bertambah baik karena bentuk
puncak kurang bervariasi
• Elusi bergradien dilakukan untuk pemisahan
campuran yang kompleks.
 ANALISIS KUALITATIF DAN
KUANTITATIF
• Analisis kualitatif → dengan membandingkan waktu retensi
sampel dengan standar
• Kondisi HPLC sampel harus sama dengan standar
• Analisis kuantitatif → Luas puncak proporsional dengan
konsentrasi senyawa dalam sampel yang diinjeksikan
sehingga dapat digunakan untuk menghitung konsentrasi
senyawa dalam sampel
CONTOH KROMATOGRAM HPLC
GC VS HPLC

1. Fase Gerak:
• kromatografi gas → gas sebagai fase geraknya dengan fase
diam baik berbentuk cair atau padat.
• Kromatografi Cair Kinerja Tinggi → cairan sebagai fase gerak
dan padatan sebagai fase diam dalam analisis.
2. Sifat Analisis:
• Kromatografi Gas → menganalisis sampel yang mudah
menguap atau semi-mudah menguap
• HPLC → menganalisis sampel yang hanya bersifat cair.
3. Instrumentasi:
• Kromatografi gas → menggunakan kolom yang panjang dan tebal
biasanya 10 sampai 30 meter panjangnya
• HPLC → kolom lebih pendek, berupa tabung
4. Biaya:
• Gas Chromatography lebih murah dibandingkan dengan sistem HPLC
yang menggunakan banyak peralatan termasuk pompa tekanan tinggi
untuk meningkatkan akurasi dan mempersingkat waktu yang diperlukan
untuk analisis sampel.
• Sehingga GC lebih banyak digunakan dibandingkan dengan HPLC.
• Namun untuk senyawa atau produk obat yang di hasilkan di industri
farmasi, banyak kandungan obat yang tidak mudah menguap, jadi tetap
penggunaan HPLC lebih banyak di Industri Farmasi.
KUIS
1. HPLC → High Performance Liquid Chromatographic,
merupakan perkembangan dari Kromatografi Kolom
klasik.
a. Mengapa kromatografi ini disebut High Performance Liquid
ChromatographIc?
b. Dan apa yg membedakannya dengan Kromatografi Kolom
Klasik?

2. Jelaskan bagaimana analisis kualitatif dan kuantitatif dg

HPLC!
3. Jelaskan perbedaan antara HPLC fasa normal dan fasa
terbalik!
4. Sebutkan dan jelaskan minimal 3 Perbedaan antara GC
dan HPLC!