BAB IV

METODE PENELITIAN

4.1 Rancangan penelitian

Penelitian yang akan dilakukan adalah penelitian observasional analitik dengan
menggunakan rancangan Potong Lintang (Cross Secional) untuk menentukan
ekspresi mutasi gen PIK3CA pada pasien kanker ovarium di Rumah Sakit
Soetomo Surabaya.

4.2 Subjek penelitian

4.2.1 Populasi
Populasi pada penelitian ini adalah pasien yang memenuhi kriteria kanker
Ovarium di poliklinik/rawat inap Bedah Onkologi Rumah Sakit Soetomo
Surabaya.
4.2.2 Sampel
Sampel pada penelitian ini adalah pasien yang memenuhi kriteria kanker
ovarium di poliklinik/rawat inap Bedah Onkologi Rumah Sakit Soetomo Surabaya
dan telah dilakukan pemeriksaan histopatologi oleh departemen Patologi
Anatomi Rumah Sakit Soetomo
4.2.3 Besar Sampel
Besar sampel pada penelitian ini menurut penelitian rujukan adalah minimal
orang dengan memakai rumus : (Lemeshow 1997)

Keterangan :
n = jumlah sampel minimal yang diperlukan
P = proporsi pasien yang menderita kanker ovarium
Q = 1-p (proporsi pasien yang tidak menderita kanker ovarium)
d = limit dari error atau presisi absolut, Jika ditetapkan =0,05 atau Zα= 1,96
23
4.2.4 Teknik Pengambilan Sampel
Sampel penelitian diperoleh dari jaringan organ ovarium pasien yang menderita
karsinoma ovarium yang berobat ke poliklinik/rawat inap Bedah Onkologi Rumah
Sakit Soetomo Surabaya yang memenuhi kriteria inklusi yang telah dilakukan
pemeriksaan histopatologi dengan diagnosis kanker ovarium (consecutive
sampling)
4.2.5 Kriteria Inklusi
Pemeriksaan histopatologi dilakukan di Departemen Patologi Anatomi Rumah
Sakit Dr. Soetomo, Penampilan mikroskopis sesuai dengan kriteria karsinoma
ovarium, dan jaringan tersebut digunakan membuat paraffin blok yang masih
cukup representatif untuk Tujuan dari penelitian ini.
4.2.6 Kriteria Ekslusi
Untuk sampel dengan jaringan yang tidak cukup dalam pembuatan paraffin blok
untuk penelitian ini.

4.3 Variabel penelitian

4.3.1 Variabel bebas (independent)
Variabel bebas berupa gen PIK3CA kodon 545 dan kodon 1047.
4.3.2 Variabel tergantung (dependent)
Variabel terrgantung berupa preparat histopatologi kanker ovarium.

4.4 Definisi operasional variable penelitian

No Variabel Definisi Operasional Alat Ukur Parameter Skala
1 Variabel bebas
(independent)
Gen PIK3CA Merupakan gen Polymerase Mutasi pada Nominal
kodon 545 menyandi subunit Chain urutan basa
katalistik p110 α yang Reaction DNA pada
bagian dari PI3K class (PCR) based hasil
IA pada urutan Restriction sekuensing
nukleotida 545 pada Fragment
domain helical ekson 9 Length
polymorphism

24
 (RFLP)
Gen PIK3CA Merupakan gen Polymerase Mutasi pada Nominal
kodon 1047 menyandi subunit Chain Urutan basa
katalistik p110 α yang Reaction DNA pada
bagian dari PI3K class (PCR) based hasil
IA pada urutan Restriction sekuensing
nukleotida 1047 pada Fragment
domain helical ekson Length
20 polymorphism
(RFLP)
2 Variabel
tergantung
(dependent)
Preparat Merupakan jaringan - Memenuhi Nominal
histopatologi dari organ ovarium kriteria
kanker ovarium yang memenuhi criteria kanker
kanker ovarium yang ovarium
cukup untuk
pembuatan blok
parafin

4.5 Alat dan bahan penelitian

4.5.1 Alat penelitian
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah : hot plate and stirer, vortex, ,
spindown,QIAamp spin column, collection tube 2 ml, centrifuge, microtube,
micropastle, blue tips, yellow tips, stopwatch, waterbath 56°C sarung tangan,
masker, tabung ependorf, tabung PCR, alat elektroforesis, transiluminator UV,
spektrofotometer, Alat PCR yang digunakan adalah Rotor-Gene® Q (Qiagen),
untuk proses amplifikasi yaitu menggunakan MyFi™ DNA Polymerase (Bioline),
dan squencer.
4.5.2 Bahan Penelitian
Untuk blok parafin dengan pemotongan jaringan dengan pisau microtome,
pemutih kloroks 20% untuk menghindari kontaminasi DNA, deterjen, etanol
absolute, xilol dan etanol.
25
 Untuk Isolasi DNA pada penelitian ini menggunakan QIAamp® DNA Kit
(Qiagen).
Bahan-bahan yang diperlukan dalam isolasi DNA adalah QIAmp® DNA Kit yang
terdiri dari; Proteinase K; Buffer AL; Buffer AW1; Buffer AW2; dan Buffer AE,
Etanol (100%), sampel darah, dan air murni (aquabidest).
Untuk Tahap amplifikasi bertujuan untuk memperbanyak fragmen DNA target
yang
telah diisolasi. Proses amplifikasi pada penelitian ini menggunakan teknik nested
Polymerase Chain Reaction (PCR) secara konvensional. Bahan yang dibutuhkan
adalah aqua for Injection, DNA template, dan primer DNA target (forward dan
reverse bprimer),Daftar primer yang digunakan pada penelitian ini yaitu :
Gen Primer Produk, bp
PIK3CA
Ekson 9 Forward: 5’-GGGAAAAATATGACAAAGAAAGC-3’ 250
Reverse: 5'-CTGAGATCAGCCAAATTCAGTT-3'
Ekson 20 Forward: 5'-TTTGCTCCAAACTGACCAA -3' 349
Reverse: 5'-TGGAATCCAGAGTGAGCTTTC -3'

Untuk tahap elektroforesis, bertujuan untuk menginterpretasikan hasil dari

proses PCR. Bahan yang dibutuhkan adalah agarose gel 1% (agarose 1 gr
dengan TBE 1× 100 ml), loading dye 6×, TBE 1×, red gel, aquabidest.
Untuk sekuensing DNA. Bahan untuk sekuensing adalah template (cetakan)
DNA, primer, dNTP, ddNTP dan enzym polymerase.

4.6 Tempat dan waktu penelitian

Penelitian ini dilakukan di Gedung Pusat Diagnostik Rumah Sakit Soetomo
departemen Patologi Anatomi, Laboratorium Patologi Anatomik FK Universitas
Airlangga Surabaya, yang meliputi studi kepustakaan, pengumpulan data,
pengolahan data dan penulisan laporan penelitian.

26
4.7 Prosedur Penelitian
Blok paraffin jaringan kanker ovarium.
1. Blok parafin dengan kriteria inklusi diambil untuk ekstraksi DNA secara
acak. Untuk proses persiapan blok parafin dilakukan seperti penelitian
sebelumnya.
2. Blok parafin dipotong sesuai ukuran 25 μm (5 μm × 5 μm keping). Pisau
microtome sebelumnya yang digunakan untuk memotong blok parafin dicuci
dengan Pemutih kloroks 20% untuk menghindari kontaminasi DNA.
3. Selanjutnya dicuci dengan deterjen, dibilas dengan air bersih, dikeringkan,
dan dibersihkan dengan etanol absolut.
4. Deparaffinasi dilakukan dengan xilol dan rehidrasi dengan etanol.
Isolasi DNA
1. Memasukan 20μl QIAGEN Protease (atau K Proteinase) ke dalam 1.5 ml
microcentrifuge tube;
2. Menambahkan 200μl sampel ke microcentrifuge tube;
3. Menambahkan 200μl buffer AL ke dalam sampel, kemudian di vortex selama
15 detik;
4. Menginkubasi selama 10 menit dalam suhu 56°C pada waterbath;
5. Melakukan spindown 1.5 ml microcentrifuge tube untuk menghilangkan cairan
yang terdapat pada tutup tube;
6. Menambahkan 200μl etanol (100%) ke dalam sampel, kemudian divortex
menggunakan pulse-vortexing selama 15 detik. Setelah itu, kembali
melakukan spindown untuk menghilangkan cairan yang terdapat pada tutup
tube;
7. Campuran larutan tersebut dipindahkan ke QIAamp Spin Column (2 ml
collection tube) tanpa membasahi pinggiran tube, menutup tube, lalu
dicentrifuge dalam 6000 x g (8000 rpm) selama satu menit. Kemudian
membuang hasil filter yang terdapat pada collection tube;
8. Menambahkan 500μl buffer AW1 pada QIAamp Spin Column tanpa
membasahi pinggiran tabung. Tutup, lalu lakukan centrifuge dalam 6000 x g
(8000rpm) selama satu menit. Membuang hasil filter yang terdapat pada
collection tube;

27
9. Menambahkan 500μl buffer AW2 pada QIAamp Spin Column tanpa
membasahi pinggiran tabung. Tutup, lalu lakukan centrifuge dalam kecepatan
penuh 20000 x g (14000rpm) selama tiga menit;
10. Meletakkan QIAamp Spin Column kedalam 1.5ml microcentrifuge tube dan
menyingkirkan collection tube yang terdapat filter. Menambahkan 200μl buffer
AE pada QIAamp Spin Column. Menginkubasi dalam suhu ruangan (15-25°C)
selama satu menit, lalu melakukan centrifuge dalam 6000 x g (8000rpm)
selama satu menit;
11. Membuang QIAamp Spin Column dan menutup 1,5 ml microsentrifuge tube,
hasil ekstraksi dapat disimpan pada lemari pendingin.
PCR dilakukan dengan cara :
1. Centrifuge seluruh bahan dengan kecepatan sedang, agar cairan yang
menempel pada bagian tutup dan dinding tabung seluruhnya terkumpul di
tabung.
2. Ambil 1 tabung microcentrifuge ukuran 1,5 ml tandai dengan kode MIX PCR.
3. Sedotlah bahan-bahan diatas (isolasi DNA) dengan menggunakan pipet tetes
ukuran mikro liter:
4. Ambil tabung PCR ukuran 0,2l, susun diatas rak besi yang dingin
5. Pipet Mix PCR sebanyak 23 μl ke masing-masing tabung PCR.
Vol mix PCR/tabung = total volume – vol. DNA = 25 – 2,5 = 22,5 l
6. Kemudian pipet 2 berisi Mix PCR (dikerjakan untuk setiap masing-masing
sampel DNA)
7. Komposisi PCR adalah master mix 10 μL, dH2O 5 μL, forward primer 1 μL,
reserve primer 1 μL, sampel 5 μL. Kondisi PCR adalah predenaturasi pada
94° C selama 5 menit, denaturasi 94° C selama 1 menit, Annealing 63° C
selama 1 menit, ekstensi 72 ° C selama 30 detik, 40 siklus dan final ekstensi
72 ° C selama 10 menit.
Elektroforesis
Pembuatan Gel Agarose untuk elektroforesis
1. Gel agarose dibuat dengan konsentrasi 0,8%.
2. Pembuatan gel dimulai dengan mencampurkan 800 mg gel agarose dengan
100 ml TBE 1x.
3. Mendidihkan campuran tersebut dalam microwave selama 25 menit pada ±
80˚C. Campuran dibiarkan hingga suhunya turun sampai dengan 55˚C.
28
 4. Selagi menunggu turunnya suhu agarose, dipersiapkan bilik elektroforesis
dengan memasang pembatas pada setiap sisi baki sebagai pencetak
agarose.
5. Setelah mencapai suhu yang sesuai, agarose dituangkan ke dalam baki
tersebut dan di letakkan comb pada salah satu ujung sisi baki (pada kutub
negatif). Agarose dibiarkan hingga mengeras menjadi gel yang padat. Setelah
mengeras sempurna, comb lalu dicabut.
6. Kemudian pembatas baki pada setiap sisi dilepaskan dan baki diletakkan ke
dalam bilik elektroforesis yang telah terisi larutan buffer.
Elektroforesis
1. Menyiapkan kertas parafilm atau solatip pada meja;
2. Meletakkan 2 μL loading dye pada parafilm atau solatip;
3. Mengambil 3 μL hasil amplifikasi kedua, kemudian mencampurkannya dengan
loading dye;
4. Mengambil 5 μL hasil campuran tersebut, kemudian memasukkannya ke
dalam sumur pada gel agarose;
5. Menyambungkan alat elektroforesis dengan sumber listrik dengan pengaturan
pada alat elektroforesis, yaitu 100 V, 50 Watt dan 250 mA selama 55 menit;
6. Setelah selesai, didiamkan beberapa saat dan mengangkat agarose dari bilik
elektroforesis dan meletakkannya pada alat UV untuk divisualisasikan.
Sekuensing dengan cara menterjermahkan urutan basa nitrogen dengan cara:
1. Tahapan sekuensing yang pertama adalah menyediakan dsDNA (double
strand DNA) .
2. Memotong dsDNA (double strand DNA) menjadi ssDNA (single strand DNA).
3. Mengambil template (cetakan) DNA dari ssDNA hasil potongan dari dsDNA.
4. Menyediakan seluruh alat dan bahan untuk sekuensing DNA. Bahan untuk
sekuensing adalah template (cetakan) DNA, primer, dNTP, ddNTP dan enzym
polymerase.
5. Menyiapkan 4 tabung reaksi. Masing-masing tabung reaksi diberikan ddNTP,
yaitu ddGTP, ddCTP, ddATP, dan ddTTP. Masing- masing tabung reaksi diisi
dengan ddNTP yang berbeda. Tabung pertama diisi dengan ddGTP, tabung
kedua diisi dengan ddCTP, tabung ketiga diisi dengan ddATP, dan tabung
keempat diisi dengan ddTTP.

29
 6. Setelah masing-masing tabung diisi dengan ddNTP, kemudian masing-
masing tabung diisi dengan dNTP, sebagai sumber nukleotida pada proses
polimerasi. Yaitu dGTP, dCTP, dATP, dan dTTP.
7. Kemudian memasukkan primer ke dalam tabung reaksi. Primer berfungsi
mengenali situs spesifik pada DNA template, juga berfungsi sebagai
landasan/pijakan untuk memulai polimerisasi.
8. Setelah pemberian primer, juga dimasukkan enzim polimerase
(taqpolymerase).
9. Keempat tabung reaksi tersebut dipersiapkan untuk di alirkan pada gel
agarosa .
10. Perbedaan panjang polinukleotida tersebut, mengakibatkan perbedaan letak
pada gel agarosa. Polinukleotida yang paling pendek
bermigrasi/pergerakannya paling cepat pada gel agarosa.
11. Hasil pembacaan sekeuensing dari arah 5’ ke 3’ adalah rantai kompemen,
yaitu 5’ AGCCGATCC 3’. Sehingga DNA templatenya adalah 5’
GGATCGGCT 3’
12. Langkah terakhir adalah pembacaan mesin hasil dengan mesin sequencer
disebut electropherogram, yaitu peak-peak berwarna yang menunjukkan
urutan basa DNA-nya.

4.8 Analisis statistik

Data-data yang terkumpul dianalisis dengan menggunakan sistem komputer.
Data kategorikal (skala nominal) disajikan dengan menampilkan distribusi
frekuensi dan persentase. Uji Chi Square digunakan untuk menguji hipotesis
adanya ekspresi mutasi gen PIK3CA pada pasien kanker ovarium di Rumah
Sakit Soetomo Surabaya pada signifikansi nilai p < 0,05 dengan menampilkan
nilai Odds Rasio (OR) dan 95% confidence interval.
Apabila penelitian ini tidak memenuhi syarat dari uji Chi-Square maka, akan
dilakukan uji alternatif dengan menggunakan uji Fisher’s Exact.

30
4.9 Kerangka operasional penelitian

Individu yang datang ke poliklinik/rawat inap Bedah Onkologi

Rumah Sakit Soetomo

Pemeriksaan mikroskopik yang memenuhi Kriteria kanker ovarium

Persiapan bahan berupa jaringan yang dilakukan blok paraffin

Isolasi DNA pada sampel jaringan

Melakukan amplifikasi PCR dan elektroferesis

Melakukan sequencing untuk mengetahui kode genetik dari

molekul DNA / penentuan urutan basa nukleotida pada molekul
DNA.

Analisa dan Mengolahan data

31
4.10 Ethical Clearance
Penelitian ini akan diajukan ke Komisi Etik Penelitian Kesehatan Fakultas
Kedokteran Universitas Airlangga dengan penjelasan terkait etika penelitian sebagai
berikut :
1. Judul penelitian : Ekspresi mutasi gen PIK3CA pada pasien kanker ovarium di
Rumah Sakit Soetomo Surabaya.
2. Perkiraan waktu yang akan digunakan menyelesaikan penelitian : 6 bulan
3. Tujuan penelitian :
Tujuan Umum
Mengidentifikasi Ekspresi mutasi PIK3CA pada kanker ovarium
Tujuan Khusus
1. Untuk mengetahui distribusi penderita kanker ovarium berdasarkan tipe
histopatologi kanker ovarium.
2. Untuk mengamati distribusi Frekuensi mutasi PIK3CA pada kanker ovarium di
RSUD Soetomo
3. Untuk mengamati dan menganalisa mutasi pada gen PIK3CA kodon 545
penderita kanker ovarium.
4. Untuk mengamati dan menganalisa mutasi pada gen PIK3CA kodon 1047
penderita kanker ovarium.
4. Manfaat penelitian :
a. Dapat memberikan informasi atau data ilmiah tentang Ekspresi mutasi
PIK3CA pada kanker ovarium di RSUD Soetomo.
b. Diharapkan bisa digunakan untuk deteksi dini kanker ovarium
c. Dapat memudahkan dalam melakukan intervensi farmakologi.
d. Data yang diperoleh selanjutnya dapat digunakan sebagai data awal untuk
penelitian selanjutnya.
5. Masalah Etika :
a. Penelitian ini menggunakan jaringan kanker ovarium pada pasien yang
telah menjalani operasi kanker ovarium pada departemen bedah onkologi
rumah sakit Soetomo Surabaya.
b. Jaringan kanker ovarium tersebut kemudian akan dilakukan blok paraffin di
departemen patologi anatomi rumah sakit Soetomo Surabaya.

23
6. Prosedur Penelitian :
a. Sampel diperoleh dari departemen patologi anatomi rumah sakit Soetomo
Surabaya berupa blok paraffin.
b. Dilakukan isolasi DNA pada sampel
c. Selanjutnya dilakukan amplifikasi DNA dengan PCR
d. Dan dilakukan sequencing DNA lalu dilakukan analisa data.
7. Bahaya langsung dan tidak langsung yang mungkin terjadi : tidak ada, mengingat
sampel yang diperoleh berupa blok paraffin dan tidak ada perlakuan khusus,
hanya prosedur pemeriksaan dengan metode PCR dan Sequencing DNA
8. Bagaimana cara pemilihan sampel :
Pemilihan sampel dengan memenuhi Kriteria inklusi dan Eklusi, dimana kliteria
inklusi : Pemeriksaan histopatologi dilakukan di Departemen Patologi Anatomi
Rumah Sakit Dr. Soetomo, Penampilan mikroskopis sesuai dengan kriteria
karsinoma ovarium, dan jaringan tersebut digunakan membuat paraffin blok yang
masih cukup representatif untuk Tujuan dari penelitian ini.
9. Bila penelitian ini dikerjakan pada manusia, jelaskan hubungan antara responden
dengan peneliti : Dalam hal ini peneliti menggunakan sampel jaringan kanker
ovarium dimana terlebih dahulu responden dilakukan pemeriksaan oleh dokter
bedah onkologi rumah sakit Soetomo Surabaya
10. Bila penelitian ini dikerjakan pada penderita jelaskan cara diagnosisnya :
responden didiagnosa kanker ovarium oleh dokter patologi anatomi dengan
menilai jaringan ovarium responden dengan penampilan mikroskopik yang
sesuai dengan criteria kanker ovarium.
11. Bentuk insetif bagi responden : tidak ada. Responden merupakan pasien rumah
sakit Soetomo dan penelitian hanya melibatkan jaringan kanker ovarium yang
telah diambil selama operasi.

24