Hubungan antara Sitokrom P450 G1347A Gen Polimorfisme dan Risiko Stroke

Iskemik pada Penduduk India Utara: Studi Kasus-Kontrol

Abstrak
Tujuan: Penelitian saat ini diambil untuk membangun hubungan
antara polimorfisme CYP4F2 G1347A dan risiko stroke iskemik (IS) pada populasi
India Utara.
Metode: Dalam sebuah studi kasus-kontrol yang berbasis di rumah sakit, 250 kasus
dan 250 subjek kontrol yang cocok dengan usia dan jenis kelamin direkrut dari
Departemen Neurologi Rawat Jalan, Semua Institut Ilmu Kedokteran India, New
Delhi, India. Reaksi rantai polimerase - Polimorfisme panjang fragmen restriksi
(PCR-RFLP) digunakan untuk genotipe. Data dianalisis menggunakan perangkat
lunak STATA, Versi 13.
Hasil: Usia rata-rata pasien IS adalah 52,83 ± 12,59 tahun dan pada kelompok
kontrol adalah 50,97 ± 12,70 tahun. Distribusi frekuensi genotipik sesuai dengan
Hardy Weinberg Equilibrium (HWE) dalam kasus dan kontrol. Analisis regresi
logistik bersyarat menunjukkan hubungan independen antara
CY P450 G1347Apolimorfisme gen dengan risiko IS di bawah model dominan (OR
2.05; 95% CI 1,18 hingga 3,56). Analisis berdasarkan Uji Org 10172 dalam
klasifikasi Acute Stroke Treatment (TOAST) membedakan hubungan yang signifikan
dengan subtipe IS Large Vessel Disease (LVD) pada kedua subtipe IS yang tidak
disesuaikan (OR, 2,5; 95% CI 1,49 hingga 4,20) dan disesuaikan (OR, 3,32; 95% CI
1,72-6,43) analisis dan hubungan yang signifikan dengan subtipe Small Vessel
Disease (SVD) IS setelah analisis yang disesuaikan (OR, 2,43; 95% CI 1,14-5,16) di
bawah model resesif.

2
Kesimpulan: Penelitian ini menunjukkan
bahwa polimorfisme CYP4F2 G1347A mungkin merupakan faktor risiko penting
untuk IS terutama untuk subtipe LVD dari IS. Studi prospektif dengan ukuran sampel
yang besar diperlukan untuk mengkonfirmasi temuan ini.
Kata kunci :Stroke iskemik; Polimorfisme nukleotida tunggal; Sitokrom P450 ; India
Utara

Pengantar
Stroke adalah gangguan neurologis yang penting dan menghancurkan yang
dapat menyebabkan cacat permanen atau kematian. Telah diprediksi bahwa akan
ada> 200 juta Disability Adjusted Life Years (DALYs) yang hilang, 70 juta orang
yang selamat dan 20 juta kematian setelah stroke pada tahun 2030 di seluruh dunia
[ 1 ]. Stroke telah diakui sebagai gangguan neurologis yang rumit, multifaktorial, dan
poligenik yang terjadi dari lingkungan, genetik, dan kombinasi faktor risiko
vaskular. Heritabilitas menganggap stroke iskemik (IS) bervariasi dari 17 hingga 38%
[ 2 , 3] Studi asosiasi luas genom (GWAS) telah mereplikasi beberapa lokus genetik
yang terkait dengan subtipe IS spesifik. Ini telah memandu konsep bahwa risiko
genetik bervariasi dalam berbagai subtipe IS. Beberapa kandidat penelitian asosiasi
gen telah dilakukan sejauh ini untuk mengidentifikasi hubungan varian genetik dan
alel risiko dengan penyakit tertentu [ 4 ].
Gen sitokrom P450 ( CYP4F2 ) sebagian besar diekspresikan dalam arteri
serebral manusia, yang mengkode enzim ω-hidroksilase yang mempercepat
metabolisme asam lemak membran utama yaitu asam arakidonat menjadi asam 20-
hidroksikicosiketraenoat yang memiliki kontribusi penting untuk pemeliharaan
penyempitan pembuluh darah. dalam arteriol otot rangka, koroner, sirkulasi paru,
arteri ginjal dan serebral [ 5 , 6 ]. 20-HETE adalah vasokonstriktor yang kuat dan
dapat merangsang vasokonstriksi miogenik sel-sel otot arteri serebral [ 7 , 8] Sebuah
studi menunjukkan kadar 20-HETE yang lebih tinggi dalam plasma setelah oklusi
arteri serebral tengah stroke dan penyumbatan yang disarankan dari pembentukan 20-

3
HETE mungkin berguna untuk pengobatan IS [ 9 ]. Bukti dari literatur menunjukkan
bahwa gen CYP dan kadar 20-HETE ginjal yang berubah memiliki peran vital dalam
hipertensi dan IS.
Ini adalah subfamili dari enzim CYP4F2 yang terlibat dalam metabolisme
Leukotriene B4 (mediator ampuh peradangan) dan 20- HETE. Gen terletak pada
kromosom 19p.13.11 yang mengurangi ω-hidroksilase yang mempercepat
metabolisme LTB4, tokoferol, dan asam arakinodonat. Studi gen kandidat
menunjukkan bahwa polimorfisme G1347A (rs2108622) mengarah pada substitusi
Valine ke Methionine yang mengarah pada berkurangnya aktivitas metabolisme
AA. Meta-analisis terbaru menunjukkan bahwa variasi gen CYP4F2 meningkatkan
risiko stroke iskemik [ 10] Namun, karena efek sederhana SNPs dalam fenotipe, studi
dengan jumlah sampel yang memadai dari populasi yang berbeda diperlukan untuk
dilakukan untuk validasi temuan. Oleh karena itu, kami bertujuan untuk mempelajari
hubungan antara polimorfisme gen CY P450 ( G1347A ) dengan risiko IS pada
populasi India Utara.

Bahan dan metode

Peserta studi
Ini adalah studi kasus-kontrol yang cocok dengan usia dan jenis kelamin,
dilakukan (November 2012 hingga Oktober 2014) di rumah sakit rujukan tersier di
India (Neurosciences Center, Semua Institut Ilmu Kedokteran India (AIIMS), New
Delhi). Sebanyak 250 pasien dengan 250 kontrol terdaftar setelah skrining kriteria
kelayakan [ 11 , 12 ]. Persetujuan Komite Etik Kelembagaan Lokal telah
diambil. Semua pasien menjalani evaluasi klinis terperinci [ 13 ]. Uji coba Org 10172
dalam kriteria Acute Stroke treatment (TOAST) digunakan untuk klasifikasi IS lebih
lanjut [ 14 ]. Definisi variabel demografis dan faktor risiko adalah sama dalam studi
yang diterbitkan sebelumnya Kumar et al. [ 15 ]

4
Investigasi laboratorium
Sampel darah tepi (4 ml) diambil dari semua peserta penelitian untuk
ekstraksi DNA menggunakan metode isolasi fenol kloroform.

Penentuan genotipe
Polimorfisme gen sitokrom P450 ditentukan dengan menggunakan metode
PCR-RLFP. Primer dirancang melalui perangkat lunak Primer-3 online untuk
polimorfisme nukleotida tunggal. Wilayah G1347A diperkuat dalam TaKaRa PCR
Thermal Cycler Dice (TAKARA BIO INC) menggunakan urutan primer: Maju
5'ATCAACCCGTTCCCACCT3 'dan Membalikkan
5'ACATTGTGCTCCCAGACG3' pada suhu anil 59,8 ° C. Ukuran produk PCR yang
diamplifikasi dari 491 pasangan basa dicerna dengan menggunakan enzim restriksi
PvuII setelah semalam pada suhu 37 ° C. Produk dipisahkan dengan menggunakan
elektroforesis gel agarosa 2,5%. Polimorfik 1347 Kekurangan alel pada tempat
restriksi; karenanya produk PCR 491 bp tidak dibagi. Namun, alel G memiliki situs
restriksi yang memberikan fragmen 313 dan 178 bp setelah pencernaan ( Gambar 1).

Gambar 1: Gambar gel polimorfisme gen PCR-RFLP dari CYP4F2 G1347A .

5
Analisis statistik
Distribusi frekuensi genotipe menurut Hardy-Weinberg equilibrium (HWE)
dilakukan dengan uji chi-square. Hubungan antara risiko IS dan gen polimorfisme
dievaluasi oleh Odds Ratio (OR) dengan interval kepercayaan 95% (CI) dengan
menggunakan analisis regresi logistik bersyarat. Regresi logistik bersyarat multivariat
digunakan untuk dampak independen SNP G1347A dengan risiko IS. Signifikansi
statistik dianggap sebagai p <0,05. STATA versi 13.0 (StataCorp, 2013. Perangkat
Lunak Statistik Stata: Rilis 13. College Station, TX: StataCorp LP) digunakan untuk
analisis data kualitatif dan kuantitatif.

Hasil
Usia rata-rata kontrol adalah 50,97 ± 12,70 tahun dan 52,83 ± 12,59 tahun
untuk kasus IS. Total 203 pria dan 47 wanita berada di kedua kelompok. Kami tidak
mengamati perbedaan yang signifikan secara statistik dalam usia antara pasien dan
kontrol. Variabel demografis dan faktor risiko untuk kedua kelompok telah diberikan
pada Tabel 1 . Berbagai faktor risiko IS secara signifikan lebih tinggi daripada
kontrol (hipertensi pada 58,4%, Diabetes pada 31,6% dan dislipidemia pada 22,8% IS
dan pada kelompok kontrol, hipertensi pada 16,8%, diabetes pada 10,8% dan 5,6%
adalah dislipidemia).

Tabel 1: Variabel faktor demografi dan faktor risiko untuk pasien stroke iskemik (IS)
dan subjek kontrol.
Kontrol (N = 250) Stroke iskemik Mentah ATAU [95% * Disesuaikan ATAU [95%
Karakteristik n (%) (N = 250) n (%) CI], nilai p CI], nilai p
Umur dalam tahun 52.83 ± 12.59 50,97 ± 12,70 Cocok
(Mean + SD)

Pria / Wanita, n 203/47 203/47

Hipertensi 42 (16.8) 146 (58.4) 8,4 [4,8 hingga 14,6], 6.2 [3,2 hingga 12], <0,0001
<0,0001
Diabetes 26 (10.4) 79 (31.6) 3,5 [2,1 hingga 5,7], 2.1 [1.1 hingga 4.2], 0,02
<0,0001

6
 Kontrol (N = 250) Stroke iskemik Mentah ATAU [95% * Disesuaikan ATAU [95%
Karakteristik n (%) (N = 250) n (%) CI], nilai p CI], nilai p
Dislipidemia 14 (5.6) 57 (22.8) 5.2 [2.6 to10.4], 2,4 [1,0 hingga 5,7], 0,04
<0,0001
Merokok 67 (26.8) 97 (38.8) 1,7 [1,1 hingga 2,5], 1.1 [0,6 to1.9], 0,69
0,005

Alkohol 56 (22.4) 81 (32.4) 1.8 [1.1 hingga 2.8], 1,8 [0,9 hingga 3,5], 0,05
0.008
Infark miokard 4 (1.6) 17 (6.8) 5.3 [1.5 hingga 18.3], 1,8 [0,4 hingga 7,1], 0,36
0.008

Migrain dengan Aura 8 (3.2) 10 (4) 1.2 [0,4 hingga 3,1], 1.6 [0,4 hingga 5,8], 0,40
0,63
Migrain tanpa Aura 4 (1.6) 5 (2) 1.2 [0,3 hingga 4,6], 1.3 [0,1 hingga 10.9], 0,78
0,33
Status Sosial Ekonomi 14 (5.6) 66 (26.4) 5.0 [2,7 hingga 9,0], 7.5 [3.0 hingga 18.2],
Rendah <0,0001 <0,0001
BMI tinggi 89 (35.6) 77 (30.8) 0,7 [0,4 hingga 1,0], 0,8 [0,4 hingga 1,4], 0,50
0,11
Gaya Hidup Menetap 106 (42.4) 127 (50.8) 1.4 [1.0 hingga 2.1], 1.1 [0,6 to1,9], 0,6
0,04
Aktivitas fisik 136 (54.4) 107 (42.8) 0,6 [0,4 hingga 0,8], 0,7 [0,4 hingga 1,3], 0,36
0,009

Riwayat stroke keluarga 9 (3.6) 32 (12.8) 3,5 [1,6 hingga 7,4], 6.8 [2,2 hingga 20,9], 0,001
0,001
Riwayat diabetes 28 (11.2) 48 (19.2) 1.8 [1.1 hingga 3.1], 3.1 [1.4 hingga 6.9], 0.004
keluarga 0,015
Riwayat keluarga 34 (13.6) 61 (24.4) 2.0 [1.2 hingga 3.1], 1,8 [0,9 hingga 3,4], 0,06
hipertensi 0.003
Sejarah keluarga 14 (5.6) 19 (7.6) 1.4 [0,6 hingga 3,1], 1,7 [0,5 hingga 5,9], 0,38
Serangan jantung 0,33
Analisis Regresi Logistik Bersyarat: * Variabel yang disesuaikan meliputi
Hipertensi, Diabetes, Dislipidemia, Merokok, Riwayat Keluarga dengan
stroke, Alkohol, Gaya Hidup Menetap dan Status sosial ekonomi rendah
Singkatan: BMI: Indeks Massa Tubuh; ATAU: Rasio Peluang; CI: Interval
Keyakinan; SD: Deviasi Standar

7
 Analisis genetik CYP4F2 G1347A terdeteksi dalam semua kasus dan
kontrol. Tabel 2 dan 3 menunjukkan distribusi frekuensi genotipik dan alel antara
pasien IS dan kontrol. Distribusi frekuensi sesuai dengan HWE di kedua
kelompok. Hubungan yang signifikan terdeteksi pada subjek yang membawa variasi
pada 1347 lokasi CY P450gen dan risiko IS (Odds ratio, 1,7 dengan CI 95%, 1,19-
2,53; P = 0,004) di bawah model dominan warisan dan (Odds rasio, 1,45 dengan CI%
95, 1,12-1,87; P = 0,003) di bawah alelik model. Hubungan yang signifikan tetap ada
bahkan setelah penyesuaian variabel pengganggu kunci (Odds ratio, 2,05 dengan 95%
CI, 1,18-3,56; P = 0,01) dalam model dominan. Analisis subkelompok kami
berdasarkan klasifikasi TOAST menunjukkan bahwa peningkatan risiko Penyakit
Kapal Besar (LVD) untuk pembawa CYP4F2polimorfisme gen tidak disesuaikan
(Odds rasio 2,5 dengan 95% CI, 1,49-4,20; P <0,001) dan disesuaikan (Odds rasio
3,32 dengan 95% CI, analisis 1,72-6,43: P <0,001) di bawah model dominan dan juga
di bawah model alelik (Odds rasio 1,69 dengan 95% CI, 1,22-2,34; P
<0,001). Analisis multivariabel juga menunjukkan hubungan yang signifikan secara
statistik dari varian CYP4F2 dengan risiko Small Vessel Disease (SVD) (Odds ratio,
2,43 dengan 95% CI, 1,14-5,16; P = 0,02) di bawah model resesif.

8
 Tabel 2: Genotipe dan frekuensi alelik dari Cytochrome P450 (CYP4F2)
G1347A polimorfisme gen pada pasien dan kontrol stroke iskemik.

Kelomp Genotipe n (%) HWE p Allele n (%) Allele G vs A

ok Tidak. GG GA AA value G A OR 95% CI Nilai P
CON 250 105 111 34 0,58 321 179
IS 250 73 130 47 0,41 276 224 1.45 1.12-1.87 0,003
LVD 107 24 62 21 0,09 110 104 1.69 1.22-2.34 0,001
SVD 83 30 35 18 0,20 95 71 1.34 0.93-1.91 0,10
CE 26 6 17 3 0,09 29 23 1.42 0.79-2.53 0,23
Lainnya 34 13 16 5 0,98 42 26 1.11 0.65-1.87 0,69
Singkatan: Con: Kontrol; CI: Interval Keyakinan; G: Guanine; GG: Guanine
Guanine; A: Adenine; GA: Guanine Adenine; AA: Adenine Adenine; IS:
Stroke Iskemik; LVD: Penyakit Kapal Besar; SVD: Penyakit Kapal
Kecil; CE: Cardio Embolic; ATAU: Rasio Peluang; HWE: Hardy Weinberg
Equilibrium
* P <0,05 dianggap signifikan secara statistik.

9
Tabel 3: Hubungan antara polimorfisme gen Cytochrome P450 (CYP4F2) G1347A
dan risiko stroke iskemik.

Model
Model Model Resesif AA
Dominan GA Dominan GA vs. GA + Model Resesif AA vs.
+ AA vs. GG + AA vs. GG GG GA + GG
** Mentah
Mentah Disesuaikan ATAU ** Disesuaikan
Varian n ATAU [95% ATAU [95% Varian n [95% CI], ATAU [95% CI],
Sampel N (%) CI], nilai p CI], nilai p (%) nilai p nilai p
CON 250 145 34
IS 250 177 1,74 (1,19- 2.05 (1.18- 47 1.5 (0.91- 1.72 (0.84-3.49), 0.13
2,53), 0,004 3.56), 0,01 2.46), 0.10
LVD 107 83 2.50 (1.49- 3.32 (1.72- 21 1,55 (0,85- 1.51 (0.72-3.16), 0.26
4.20), 0.001 6.43), <0.001 2,82), 0,15
SVD 83 53 1.27 (0.76- 1.28 (0.69- 18 1,75 (0,93- 2.43 (1.14-5.16), 0,02
2.13), 0.34 2.37), 0.42 3,31), 0,08
CE 26 20 2.41 (0.93- 2.05 (0.68- 3 0,82 (0,23- 1.04 (0.25-4.26), 0.95
6.21), 0.06 6.13), 0.19 2,91), 0,76
Lainnya 34 21 1.16 (0.56- 1.94 (0.76- 5 1.09 (0.39- 1.34 (0.40-4.47), 0.62
2.44), 0.67 4.93), 0.16 3.02), 0.86
Singkatan: Con: Kontrol; CI: Interval Keyakinan; G: Guanine; GG: Guanine
Guanine; A: Adenine; GA: Guanine Adenine; AA: Adenine Adenine; IS: Stroke
Iskemik; LVD: Penyakit Kapal Besar; SVD: Penyakit Kapal Kecil; CE: Cardio
Embolic; ATAU: Rasio Peluang; HWE: Hardy Weinberg Equilibrium.
* P <0,05 dianggap signifikan secara statistik
** Analisis yang disesuaikan dilakukan dengan menyesuaikan hipertensi, diabetes,
dislipidemia, merokok, riwayat stroke keluarga, alkohol, gaya hidup menetap, variabel
status ekonomi rendah.

10
Diskusi
Dalam penelitian ini polimorfisme gen Cytochrome P450 dikaitkan dengan
risiko stroke iskemik terutama untuk LVD. Beberapa laporan telah menunjukkan
hubungan signifikan polimorfisme CYP4F2 dengan peningkatan risiko IS
[ 16 , 17 ]. Sebuah meta-analisis yang diterbitkan oleh Meng et al. yang termasuk
enam studi dengan total 2.187 kasus dan 7556 kontrol, juga menunjukkan hubungan
yang signifikan dengan varian CY P450 dan meningkatkan risiko IS di bawah model
resesif (OR 1,37; 95% CI, 1,21-1,54; p <0,001) [ 10 ]. Namun, dalam
kasus hipertensi, meta-analisis gagal untuk mengamati hubungan signifikan
polimorfisme G1347A dan risiko IS [ 18] Sebuah studi yang dilaporkan sebelumnya
oleh Ward et al. [ 19 ] mendeteksi korelasi positif antara polimorfisme CYP4F2 GA /
AA dan tekanan darah sistolik dan peningkatan ekskresi 20-HETE yang mendukung
peran 29-HETE dalam pengaturan tekanan darah. Fava et al. juga menunjukkan
hubungan antara alel A 1347G / A SNP dengan risiko IS [ 16 ].
Temuan penelitian ini konsisten dengan hasil penelitian yang dilaporkan dari
populasi India Selatan [ 20 ] yang juga menunjukkan bahwa
alel 1347A dari polimorfisme gen CYP4F2 merupakan faktor risiko IS yang
signifikan. Karena etiologi IS heterogen, faktor genetik dapat bervariasi berdasarkan
subtipe etiologi stroke. Bukti dari literatur telah mengkonfirmasi hubungan varian
genetik dalam subtipe spesifik stroke [ 21 ]. Dalam penelitian ini, analisis
subkelompok berdasarkan klasifikasi TOAST menunjukkan bahwa genotipe alel dan
AA gen CY P450 ( G1347A) dikaitkan secara signifikan dengan subtipe LVD IS di
bawah model dominan dan dengan subtipe SVD IS di bawah model resesif
warisan. Dalam analisis subkelompok menurut klasifikasi TOAST, Munshi et
al. telah menunjukkan hubungan signifikan batas (P = 0,07) antara 1347 A
polimorfisme CYP4F2 dan risiko stroke arteri besar intrakranial [ 20 ]. Temuan ini
memperkuat peran Cytochrome P450 (1347 G / A) dalam mekanisme subtipe LVD
dari stroke iskemik. Dalam penelitian ini ukuran sampel kecil untuk menyingkirkan
kesalahan tipe-II yang terkait dengan hasil penelitian ini. Penelitian kohort prospektif

11
yang dirancang dengan baik diperlukan untuk menguatkan temuan yang diamati
dalam penelitian ini.

Kesimpulan
Studi ini mengungkapkan bahwa varian gen CYP4F2 ( G1347A ) mungkin
menjadi faktor risiko yang signifikan untuk IS terutama untuk subtipe LVD stroke
pada populasi India Utara. Ini dapat digunakan sebagai penanda genetik potensial
untuk menyaring subjek dengan risiko memiliki IS terutama subtipe LVD dari
IS. Kami menyarankan studi prospektif yang lebih komprehensif yang melibatkan
banyak pusat dengan jumlah sampel yang besar untuk memvalidasi temuan ini.

12