BAB I

PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah merupakan senyawa kimia yang paling
penting dalam makhluk hidup karena molekul berperan sebagai pembawa informasi
hereditas yang menentukan struktur protein dan proses metabolisme lain (Jamilah,
2005). DNA genom meliputi gen dan intergen. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama
yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida.
DNA dapat mengalami denaturasi dan renaturasi serta diisolasi untuk dipelajari (Suryo,
2004).
Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau
lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi atau buffer
lisis untuk mencegah DNA rusak (Yuwono, 2008). Pada sel eukariotik termasuk tanaman
dan hewan bagian terbesar dari DNA berada pada nukleus yaitu organel yang dipisahkan
dari sitoplasma dengan membran. Nukleus terdiri dari 90 % keseluruhan DNA seluler. Sisa
DNA adalah organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Karena DNA terdapat pada
nukleus, maka perlu adanya metode pelisisan sel sampai pemanenan sel. Dimana metode
tersebut merupakan bagian dari metode isolasi DNA (Elrod, 2007).
Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Hal ini bertujuan untuk
memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan. Proses ini harus dilakukan
dengan hati-hati, sehingga tidak menyebabkan kerusakan pada DNA. Proses untuk
mengeluarkan DNA dari sel dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran
plasma dan membran inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi. Cara mekanik bisa
dilakukan dengan menggunakan blender atau penggerusan menggunakan mortar dan pistil.
Sedangkan secara kimiawi dapat dengan pemberian yang dapat merusak membran sel dan
membran inti, salah satunya adalah pemberian deterjen (Muladno, 2002).
 BAB II
PEMBAHASAN

2.1 Ekstraksi DNA

Ekstraksi DNA merupakan teknik untuk mengeluarkan DNA dari sumber asal, inti
sel atau organel sel (DNA kloroplas, DNA mitokondria). DNA dapat diekstraksi dari
sampel jaringan yang masih segar, beku, dikeringkan atau disimpan dalam alkohol atau
buffer. Untuk mengurangi dampak studi populasi telah dikembangkan prosedur ekstraksi
DNA yang noninvasif, seperti dengan memanfaatkan rambut, tinja dan lainnya. Prosedur
ekstraksi mulai dengan penumbukan mekanik untuk memisahkan sel dan menghancurkan
membran sel dan atau dinding sel, sedangkan untuk inti penuh (budidaya dan jaringan sel
seperti darah tidak membutuhkan tumbukan mekanik). Jaringan lalu dimasukan di dalam
larutan yang mengandung detergen yang melilis membrane inti, juga proteinase yang
mendenaturasi protein lain, terutama nukelase, tetapi meninggalkan asam nukleat utuh.
Protein dipisahkan dari asam nukleat melalui ekstraksi dengan senyawa organic (biasanya
fenol dan kloroform), dan DNA dimurnikan dari reagen dalam buffer ekstraksi melalui
presipitasi alcohol atau dialysis.

Pemisahan mtDNA dan cpDNA dari DNA genom sangat ekstensif prosedurnya,
melibatkan lapisan larutan jaringan pengurai pada gradient sesium klorida adalah subjek
pada sentrifugasi kecepatan tinggi. Pemisahan DNA organel dan inti tidak membutuhkan
untuk banyak prosedur yang mendeteksi marker apakah inti atau organel melalui aplikasi
pelacak tepat atau primer untuk genom total DNA. Protokol ekstraksi rinci telah
dikembangkan untuk banyak jaringan dan jenis DNA spesies berbeda. Pencarian cepat
melalui literature seharunya mengungkap protocol tepat untuk organisme khusus.
Kebanyakan prosedur ekstraksi dilengkapi dalam volume kecil tabung mikrofuge (1.5 mL),
mengfasilitasi penelitian biologi populasi yang membutuhkan sampel dari jumlah besar
individu.

Berdasarkan cara pemotongannya Enzim retriksi digolongkan menjadi dua :

a. Endonuklease, memtotong nukleotida dari arah dalam

b. Eksonuklease memotong nukleotida hanya pada ujung atau dari arah luar
 Endonuklease dapat mengenal urutan atau sekuen nukleotida pendek, antara 4-8
nuklotida, yang sering dikenal dengan restrictionsite atau sisi pemotongan, atau situs
pemotongan yang spesifik dan berbeda-beda. Secara umum berdasarkan hasil pemotongan
DNA double strain dengan enzim endonuklease memilik dua bentuk yaitu hasil
pemotongan sticky

Kemampuan memotong DNA pada sisi spesifik menjadi tonggak penting dalam
pengembangan metode manipulasi DNA sekarang ini. Endonuklease restriksi merupakan
enzim bakteri yang memotong DNA dupleks pada urutan target spesifik. Enzim ini dapat
diperoleh secara komersial dari perusahaan-perusahaan produk bioteknologi. Penamaan
enzim restriksi didasarkan pada sistem sederhana yang diusulkan oleh Smith and Nathans.
Nama enzim (seperti BamHI, EcoRI) menunjukkan bahwa asal enzim, tetapi tidak
menunjukkan informasi spesifisitas pemotongan. Sisi pengenalan enzim restriksi pada
umumnya adalah urutan palindromik dengan panjang 4, 5, atau 6 pasang basa (pb) seperti
AGCT (untuk AluI), GAATTC (untuk EcoRI), dan lain sebagainya.

Masing-masing enzim restriksi memotong urutan palindrom pada sisi spesifik, dan
dua enzim berbeda dapat mempunya urutan pengenalan yang sama, tetapi memotong DNA
pada titik berbeda di dalam urutan basa tersebut. Ujung DNA hasil pemotongan enzim
restriksi dapat dikelompokkan menjadi tiga ketergori: (1) ujung tumpul, (2) ujung lengkaet
5’ dan (3) ujung lengket 3’.

Agarose gel elektroforesis atau southern analisis digunakan untuk memisahkan

fragmen DNA berdasarkan berat molekulnya. Metode ini ditemukan oleh Ed sourthern
pada tahun 1975. Metode ini digunakan untuuk mengidentifikasi fragmen DNA yang
secara menyeluruh untuk mengetahui DNA sekuen. Sourthern hibridisasi juga disebut
sourthern blotting digunakan untuk mengetahui perbandinagn antara genome dari suatu
particular organisme dan dengan gen penanda atau gen fragmen (probe). Ini dapat
menjelaskan apakah suatu organisme berisi pertikel gen dan mengandung informasi
tentang pengorganisasian dan restriction map dari suatu gen.

Langkah-langkah dalam analisis sourthern gen DNA pada organisme dipotong

dengan enzim retriksi (endonuklease) menjadi fragmen-framen DNA lalu fragmen DNA
tersebut dimasukkan pada gel agarose lalu dilakukan elektroforesis dengan mengalirkan
arus listrik dari kutub negative ke positif kemudian hasil pemisahan DNA tersebut
didenaturasi dalam suatu alkali dan ditransferkan pada membran nitroselulosa. Pada
membrane fragmen DNA telah menjadi single stranded lalu dimasukkan kedalam larutan
yang mengandungDNA probe, proses ini disebut DNA hibridisasi dengan kata lain DNA
target danDNA probe membentuk suatu ” hybdrid” karena keduanya saling melengkapi
sekuen dan juga dapat membentuk ikatan satu sama lain. DNA probe biasanya
mengandung pelabelan radioaktif dengan γ- [32P] dan polynucleotide kinase sering dengan
pemindahan 5′ phosphate dari probe dengan menggunakan alkaline phosphatase. Setalah
itu membrane dicuci untuk menghilangkan ikatan probe yang non spesifik, kemudian
dengan memajangkannya pada film sinar X akan terbentuk warna hitam apabila positif
terbentuk ikatan antara DNA dan probe. Proses ini disebut autoradiography. Hal ini dapat
digunakan untuk mengidentifikasi ukuran DNA dan sejumlah fragmen gen kromosom
dengan kekuatan yang sama dengan fragmen gen yang digunakan oleh probe.
 DAFTAR PUSTAKA

Corkill, G., Rapley, R. 2008. The Manipulation of Nucleic Acids: Basic Tools and
Techiques in Molecular Biomethods Handbook Second Edition. Ed: Walker, J.M., Rapley,
R. Humana Press, NJ,USA.

Elrod, S. 2007. Genetika Edisi Keempat. Erlangga. Jakarta.

Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Deterjen, Penambahan Garam dan Ekstrak
Nanas(Ananas Comusus) terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah
sebagai Topik Praktikum Mata Kuliah Genetika. Skripsi Program Sarjana Biologi.
Malang.
Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka Wirausaha Muda.
Suryo. 2004. Genetika Strata 1. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.
Surzycky, R. 2000. Molecular and Cellular Biology. Wadsworth Inc., Belmon

Yuwono, T., 2008. Biologi Molekuler. Erlangga. Jakarta.