Kuliah 5 - Bioteknologi (FA 1506)

Polymerase Chain Reaction

Nur Asni Setiani
Sekolah Tinggi Farmasi Indonesia
 PCR (Polymerase Chain Reaction)

• Teknik perbanyakan (amplifikasi) urutan DNA tertentu secara in vitro

dengan cara pemanjangan primer sebagai prekursor menggunakan
DNA polimerase.
• Prinsip : Thermocycler  berdasarkan siklus suhu pada waktu tertentu
• 1 pg DNA dapat diamplifikasi menjadi 0,5 - 1 g DNA
• Urutan basa DNA yang akan diamplifikasi perlu diketahui
 Komponen PCR

• Template / DNA target

• Sepasang primer, forward dan reverse
• DNA polimerase termostabil
• Kofaktor Mg2+
• Empat macam deoksinukleosida trifosfat (dNTP)
• Buffer
Template PCR

• Fragmen DNA yang akan diamplifikasi (diperbanyak) ada pada templat

• Urutan DNA yang akan diamplifikasi sudah diketahui
• Sumber:
– Darah, sperma & jaringan lain (yang segar maupun yang sudah lama)
– Koloni bakteri, plaque
– DNA murni
Primer

• Oligonukleotida pendek yang berkomplemen dengan DNA template

• Menentukan fragmen mana yang akan teramplifikasi
• Tm = suhu dimana separuh dari rantai DNA sudah terpisah
Tm harus sama.
Untuk primer < 20 nt: Tm = 2(A+T) + 4(G+C)
• Dapat ditambahkan sisi pengenalan enzim restriksi pada ujung 5’ dari
primer
 Desain Primer

• Panjang sekitar 17 hingga 30 nukleotida

• Persen GC sekitar 50 %
• Temperatur annealing antara primer forward dan reverse diusahakan serupa (tidak jauh
berbeda)
• Diusahakan tidak mengandung basa berulang lebih dari tiga basa, terutama basa G (seperti
GGGG)
• Diusahakan primer tidak saling komplemen baik antara ujung-ujung dalam satu primer atau
antara primer forward dan reverse.
• Diusahakan tidak menempatkan lebih dari dua basa G atau C pada 5 basa terakhir
• Hindari nilai ΔG Hairpin yang lebih rendah dari -0,5 Kcal / mol
• Hindari nilai ΔG Dimer yang lebih rendah dari -4,0 Kcal / mol
Design Primer PCR Standard
(www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi
copy/pasta DNA sequence
1

copy/pasta DNA sequence

Rubah setting kondisi primer atau default Gunakan simbol [ dan ] untuk target
setting 7
Output design primer PCR

Urutan oligo DNA- Forward

Urutan oligo DNA- reversed

1

Klik Check dan BLAST

Klik primer Manager - Hasil ditunjukan

9
point 2
 CHECK
1

10
BLAST
1

Gunakan simbol { dan }untuk included

12
 Output design primer PCR (
PERHATIKAN HASIL YG DIPEROLEH
DARI SEBELUMNYA
General Parameter
• Primer size : Panjang primer yang ingin didapatkan (umumnya sekitar 17 – 30 bp). Primer 3 memberi batasan untuk nilai min ≥ 1 bp dan
nilai mak ≤ 36 bp.
• Primer Tm : Melting temperature dari primer (Celcius)
• Max Tm Difference : Perbedaan melting temp. yang diterima antara primer forward (left primer) dengan primer reverse (right primer).
• Product Tm : Melting temp. yang diinginkan dari hasil amplifikasi (amplicon).
• Primer GC% : Persen jumlah nukleotida G dan C yang terkandung dalam primer. Semakin tinggi %GC akan meningkatkan melting temp.
• Max Self Complementary : Nilai maksimum local alignment (penjajaran) yang dapat diterima antara sesama primer atau antara primer
forward (left primer) dengan reverse (right primer). Parameter ini digunakan untuk memprediksi kemungkinan primer menempel dengan
sesamanya atau dengan pasangannya. Penilaian mengacu pada peraturan berikut: basa yang saling komplemen diberi nilai 1 ; basa yang
komplemen dengan N diberi nilai -0,25 ; sedangkan yang tidak komplemen diberi nilai -1 ; dan setiap penambahan gap diberi nilai -2 (
hanya 1 panjang gap yang diperbolehkan dalam setiap penambahannya).
• Max 3’ Self Complementary : Nilai maksimum global alignment (penjajaran) yang dapat diterima antara ujung 3’ sesama primer atau
antara primer forward (left primer) dengan reverse (right primer). Parameter ini digunakan untuk memprediksi kemungkinan primer
menempel dengan sesamanya atau dengan pasangannya pada ujung 3’ sehingga membentuk primer dimer.
• Max Poly-X : Nilai maksimum basa berulang yang masih diterima, contoh: nilai (4) untuk GGGG
• start (Start Position) : Posisi awal mula primer. Posisi ini menunjukkan letak basa pertama pada ujung 5’ primer.
• len (Oligo Length) : Panjang primer yang merupakan jumlah seluruh nukleotida dari primer tersebut.
• tm (Melting Temperature)
Suhu melting primer. Suhu yang menjadi ukuran primer untuk melakukan proses annealing (penempelan) ketika amplifikasi PCR
berlangsung.
• gc% : Persen GC pada primer yang menunjukkan jumlah GC yang terkandung pada primer
• any (Self Complementarity) : Nilai Self-Complementary dari Primer ( merupakan ukuran kemungkinan bagian primer untuk
menempel dengan bagian primer lain dalam satu primer, sehingga membentuk struktur sekunder ).
• 3' (Self Complementarity) : Nilai 3' self-complementarity dari primer ( merupakan ukuran kemungkinan bagian 3’ dari satu primer
untuk menempel dengan bagian 3’ dari primer itu sendiri , sehingga membentuk primer-dimer antara primer itu sendiri).
• rep (Mispriming or Mishyb Library Similarity) : Kemngkinan kesamaan sekuen primer dengan daerah lain pada template (diluar
daerah yang diinginkan), sehingga memungkinkan terjadinya mispriming atau kesalahan penempelan.
• seq (Primer Sequence, 5'3') : Sekuen primer yang dipilih. Sekuen selalu ditulis dari ujung 5’ ke 3’. Sehingga primer reverse (Right
primer) ditulis terbalik dengan rancangan pada sekuen template.
• Product size : Ukuran daerah dari template yang akan teramplifikasi pada saat proses PCR
• Target (start, len)* : Daerah target yang diinginkan. Ditunjukkan dengan letak awal nukleotida dan panjangnya. Pada peta
ditunjukkan dengan tanda bintang (*)
• PAIR ANY COMPL : Nilai Self-Complementary dari sepasang primer ( merupakan ukuran kemungkinan bagian primer forward (left
primer) untuk menempel dengan bagian primer reverse (right primer).
• PAIR 3’ COMPL : Nilai 3' self-complementarity dari sepasang primer ( merupakan ukuran kemungkinan bagian 3’ dari primer forward
untuk menempel dengan bagian 3’ dari primer reverse, sehingga membentuk primer-dimer antara dua primer tersebut).
• >>>>>>>>>>>>>>>>
Menunjukkan letak primer forward (Left primer) pada template
• <<<<<<<<<<<<<<<<
Menunjukkan letak primer reverse (Right primer) pada template
DNA Polimerase termostabil

• Enzim Taq DNA polimerase

– Berasal dari Thermus aquaticus
– Pada 95oC, t1/2 = 2 jam
– Tidak mempunyai aktivitas exonuklease 3’  5’
(“proofreading”)
• akibatnya tingkat kesalahan replikasi DNA relatif tinggi
– Pada ujung 3’ ditambahkan dA
• Enzim Pfu DNA polimerase
– Berasal dari Pyrococcus furiosus
– Pada 95oC selama 90 menit, aktivitas masih 90%
– Mempunyai aktivitas exonuklease 3’  5’ (“proofreading”)
– Menghasilkan DNA ujung tumpul
 Siklus PCR

95oC, 3 menit Denaturasi awal 1x

95oC, 1 menit Denaturasi
40-65oC, 1 menit Penempelan primer 25-35 x
(annealing)
72oC, 1-3 menit Elongasi /Ekstensi
72oC, 3 menit Elongasi akhir 1x
 Siklus PCR

• Penambahan
jumlah fragmen
DNA terjadi secara
logaritmik
 Elektroforesis Gel Agarosa
Elektroforesis adalah teknik pemisahan molekul bermuatan berdasarkan perbedaan
tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik.

Prinsip kerja
Sifat partikel bermuatan
•Bergerak ke kutub yang berlawanan dengan muatannya (partikel/ion positif bergerak ke
katoda dan sebaliknya)
•Perbedaan muatan dan ukuran partikel mengakibatkan laju bergerak berbeda terjadi
pemisahan
 Elektroforesis Gel Agarosa

Elektroforesis gel
•Matriks berupa polimer berpori
•Ukuran pori (konsentrasi materi polimer) menentukan nilai koefisien
gesekan (f) semakin besar prosentase gel semakin kecil ukuran pori
•Matriks yang biasa digunakan:
Poliakrilamida  Analisis Protein (SDS-PAGE)
Agarose (polisakarida)  Analisis DNA
Elektroforesis Gel Agarosa
Elektroforesis Gel Agarosa
Elektroforesis Gel Agarosa
Ladder
1kb 1

Ag85B-Rv2660c (K1) 1131bp