KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

Definisi

 Merupakan bentuk dari kromatografi planar yang fase diamnya berupa lapisan
seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca,
plat aluminium, atau plat plastik (Gandjar dan Rohman, 2007).

Prinsip Kerja

KLT merupakan salah satu metode isolasi yang terjadi berdasarkan perbedaan daya serap
(adsorpsi) dan daya partisi serta kelarutan dari komponen-komponen kimia yang akan
bergerak mengikuti kepolaran eluen. Oleh karena daya serap adsorben terhadap
komponen kimia tidak sama, maka komponen bergerak dengan kecepatan yang berbeda
sehingga hal inilah yang menyebabkan pemisahan pada KLT (Hostettmann et al, 1995).

Fase diam dan fase gerak

 Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan diameter
partikel antara 10-30 µm (Gandjar dan Rohman, 2007).
 Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase
diam, maka semakin baik kinerja KLT dalam hal efisiensi dan resolusinya.

Fasa Diam Mekanisme Sorpsi Penggunaan

Silika gel Adsorpsi Asam amino, hidrokarbon, vitamin, alkaloid
Serbuk selulosa Partisi Asam amino, nukleotida, karbohidrat
Selulosa penukar Asam nukleat, nukleotida, halida dan ion-ion
Pertukaran ion
ion logam
Gel sephadex Eksklusi Polimer, protein, kompleks logam
Interaksi adsorpsi
Β-siklodekstrin Campuran enansiomer
stereospesifik

 Fase gerak yang biasa digunakan adalah pelarut organik seperti asetonitril, kloroform,
heksana, metanol, dll
 Semakin dekat kepolaran antara senyawa dengan eluen maka senyawa akan semakin terbawa
oleh fase gerak tersebut. Hal ini berdasarkan prinsip “like dissolved like” (Watson, 2010).

Pembuatan Lapis Tipis

 Bahan penyerap dicampur dengan air sampai menjadi bubur, biasanya dengan perbandingan x
gram penyerap dan 2x ml air.
 Bubur diaduk sampai rata dan dituangkan diatas plat dengan berbagai cara. Tebal lapisan
merupakan faktor yang paling penting dalam kromatografi lapisan tipis. Tebal standard adalah
250 mikron.
 Penyerap dituangkan diatas permukaan plat yang kondisi bentuknya baik, biasanya digunakan
plat kaca / aluminium. (NOTE : Permukaan plat harus rata.)
 Plat -plat kaca / aluminium sebelum dipakai, dicuci dengan air dan detergent kemudian
dikeringkan. (NOTE : jangan menyentuh permukaan dari plat yang bersih dengan jari tangan
karena bekas jari tangan yang menempel akan merubah tebal dari permukaan penyerap pada
plat.)

Prosedur Kerja dengan KLT

 Sebuah garis pensil digambar dekat bagian bawah fasa diam dan setetes larutan sampel
ditempatkan di atasnya.
 Sampel ditotol biasanya dengan menggunakan syringe.
 Garis pada fasa diam berguna untuk menunjukkan posisi asli sampel. Pembuatan garis harus
menggunakan pensil karena jika semua ini dilakukan dengan tinta, pewarna dari tinta juga
akan bergerak sebagai kromatogram berkembang.
 Ketika titik campuran kering, fasa diam diletakkan berdiri dalam gelas tertutup yang telah
berisi fasa gerak dengan posisi fasa gerak di bawah garis.
 Digunakan gelas tertutup (chamber) untuk memastikan bahwa suasana dalam gelas jenuh
dengan uap pelarut.
 Pelarut (fasa gerak) perlahan-lahan bergerak naik. Komponen-komponen yang berbeda dari
campuran berjalanan pada tingkat yang berbeda dan campuran dipisahkan memiliki warna
yang berbeda.
 Identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah pada lapisan tipis dapat dilakukan dengan
menggunakan sinar UV atau dengan pereaksi kimia sehingga dihasilkan bercak berwarna.
Aplikasi

 Pangan
Analisis kualitatif zat warna pada sampel makanan dan minuman.
 Farmasi
Analisis kualitatif bahan aktif pada sediaan obat, analisis kualitatif zat warna pada sediaan
obat sirup, analisis kualitatif dekomposisi bahan aktif pada sediaan obat.

Aspek kritis

 Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap

Pada prakteknya tebal lapisan tidak dapat dilihat pengaruhnya, tetapi perlu diusahakan tebal
lapisan yang rata. Ketidakrataan akan menyebabkan aliran pelarut menjadi tak rata pula dalam
daerah yang kecil dari plat.
 Kemurnian dan perbandingan campuran fase gerak
Kemurnian dari pelarut yang digunakan sebagai fase bergerak dalam kromatografi lapisan tipis
sangat penting dan bila campuran pelarut digunakan maka perbandingan yang dipakai harus
betul-betul diperhatikan.
 Tingkat kejenuhan dan uap dalam chamber yang digunakan
bila atmosfer dalam bejana tidak jenuh dengan uap pelarut, bila digunakan pelarut campuran,
akan terjadi pengembangan dengan permukaan pelarut yang berbentuk cekung dan fase
bergerak lebih cepat pada bagian tepi-tepi.
 Jumlah sampel yang digunakan
 Penetesan sampel dalam jumlah yang berlebihan memberikan hasil penyebaran noda-noda
dengan kemungkinan terbentuknya ekor dan efek tak kesetimbangan lainnya, hingga akan
mengakibatkan kesalahan-kesalahan pada harga-harga Rf.
 Suhu
Pemisahan-pemisahan sebaiknya dikerjakan pada suhu tetap, hal ini terutama untuk mencegah
perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut yang disebabkan oleh penguapan atau
perubahan-perubahan fase.