PENERAAN, PENGUKURAN, PEWARNAAN GRAM BAKTERI

LAPORAN PRAKTIKUM

Disusun untuk Memenuhi Tugas Matakuliah Mikrobiologi

Yang dibina Oleh Sitoresmi Prabaningtyas, S.Si., M.Si. dan Mardiana Lelitawati,
S.Si., M.Si.

Oleh:

Kelompok 6, Offering H 2018

1. Aghits Laily Rizqiyah (180342618021)

2. Nadila Sekar Zahida (180342618074)
3. Wahyu Nengsih (180342618017)
4. Oktavia Sutarinda (180342618052)

UNIVERSITAS NEGERI MALANG

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
JURUSAN BIOLOGI
Januari 2020
A. Topik
Topik praktikum adalah peneraan, pengukuran, pewarnaan Gram bakteri.
B. Tanggal
Praktikum dilakukan pada 21 dan 28 Januari 2020
C. Tujuan Kegiatan
Tujuan praktikum ini agar mahasiswa dapat:
1. Memperoleh keterampilan pewarnaan sel bakteri secara Gram.
2. Menetukan sifat Gram dari bakteri.
3. Memperoleh ketrampilan menera skala micrometer okuler.
4. Mengukur sel bakteri.
D. Dasar Teori
Mikrobiologi adalah studi yang mempelajari mikroba atau organisme
yang sangat kecil dengan bantuan mikroskop. Sebagian dari mikroba terdiri
dari satu sel. Umumnya bakteri berbentuk bola, batang, atau spiral, tetapi
beberapa lagi ada juga yang berbentuk filamen. Bakteri dapat ditemukan di
air, tanah, udara dan pada zat atau bahan yang busuk dimana beberapa dari
bakteri tersebut dapat menyebabkan penyakit (Black, 2012).
Bakteri adalah organisme uniseluler, dimana ukurannya sangat kecil
dan bentuk tubuhnya hanya dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop
dengan pembesaran 1.000 X atau lebih (Waluyo, 2004). Sel bakteri memiliki
panjang yang beragam, mulai dari 0,1 sampai 0,3 µm. Bakteri lebih sering
diamati dalam gram yang telah diwarnai agar mudah diamati atau dilihat
dengan jelas dalam hal ukuran, bentuk, susunan dan keadaan struktur internal
dan butiran. Sel bakteri dapat berbentuk seperti bola/elips, batang atau spiral
(Pelczar & Chan, 2007).
Tujuan dari pewarnaan gram bakteri yaitu untuk memudahkan kita
dalam mengamati bakteri dengan mikroskop, melihat ukuran dan bentuk
bakteri, struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan
vakuola, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya.
Terdapat tiga macam teknik pewarnaan gram bakteri yaitu pengecatan
sederhana, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian
warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan
tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi,
dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan
perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut
teknik pewarnaan diferensial (Pelczar & Chan, 2007).
Proses pewarnaan gram memerlukan 4 jenis reagen. Reagen pertama
disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai
dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing
agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel,
bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan
tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat mengikat warna
dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding,
bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat sebagai hasil
akhirnya. Larutan yang biasa dipakai adalah ungu kristal, lartan iodium,
alkohol dan safranin (Tracy, 2005).
Penyebab terjadinya dua golongan bakteri yaitu Gram positif dan
Gram negatif berhubungan dengan struktur dan komposisi dinding selnya.
Dinding sel bakteri Gram negatif pada umumnnya lebih tipis daripada bakteri
Gram positif. Kandungan lipid bakteri Gram negatif lebih tinggi daripada
Gram positif. Dalam eksperimen pengecatan, perlakuan mengeskstrak lipid
dengan alkohol menyebabkan poisitas atau permeabilitas dinding sel
meningkat. Sehingga, kompleks karbol gentian violet dan lugol dapat disari
keluar dan bakteri Gram negatif terwarnakan. Hal ini menunjukkan bahwa
struktur dinding sel bakteri Gram positif itu yag menjadi tempat tertahannya
zat pewarna pertama yaitu karbol gentian violet. (Razali, 1987).
Teori Salton menjelaskan bahwa ada konsentrasi lipid yang tinggi
pada dinding sel bakteri Gram negatif. Sehingga jika lipid dilarutkan dalam
pemberian alcohol, maka pori‐pori akan membesar dan tidak mengikat
pewarna. Hal ini menyebabkan bakteri menjadi tidak berwarna. Sedangkan
bakteri Gram positif akan mengalami denaturasi selama pemberian alcohol.
Hal ini akan mengecilkan pori‐pori sehingga menghasilkan kompleks kristal
iodium. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang kuat dan lapisan
 peptidoglikan sebanyak 30 lapisan sehingga permeabilitas dinding selnya
menjadi berkurang. Sedangkan bakteri Gram negatif hanya memiliki 1‐2
lapisan peptidoglikan sehingga memiliki permeabilitas dinding sel yang lebih
besar. Pewarnaan Gram terdiri atas Gram A (violet) (Kristal violet, Aalkohol,
Ammonium oksalat, Aquades), Gram B (cokelat) (Iodium, Kalium iodide,
Aquades), Gram C (Aseton, Alcohol), Gram D (merah) (Safranin, Alcohol,
Aquades) (Madigan, 2003).
E. Prosedur Kerja
1. Peneraan Mikrometer Okuler

Dipasang mikrometer okuler pada lensa okuler mikroskop

Dipasang micrometer objektif pada meja benda mikroskop

Diatur posisi garis skala mikrometer okuler dan mikrometer objektif

sehingga titik nol berada pada satu garis lurus

Diamati garis skala dari mikrometer okuler yang berada pada satu
garis dengan skala micrometer objektif

2. Pengukuran Sel Bakteri

Dilepaskan micrometer objektif dari meja benda mikroskop

Dipasang sediaan bakteri

Diukur panjang sel atau diameter 3 sel dari masing-masing koloni

dalam millimeter (Bakteri kokus hanya dihitung diameter saja,
sedangkan bakteri basil dukur diameter dan panjang)

3. Pewarnaan secara Gram

Disediakan kaca benda yang bersih dan dilewatkan di atas nyala

api spiritus
 Diteteskan setetes aquades steril di atas kaca benda

Diambil inokulum bakteri dan diratakan perlahan-lahan pada tetesan

aquades steril. Ditunggu sampai kering.

Dilewatkan di atas nyala api spiritus

Diletakkan sediaan pada kawat penyangga yang berada di atas

mangkuk pewarna dan diteteskan larutan Ammonium Oksalat Kristal
Violet. Ditunggu 1 menit.

Dibuang kelebihan zat warna ke dalam mangkuk dan dibilas

dengan aquadest.

Diteteskan larutan iodium pada sediaan. Ditunggu 2 menit.

Diteteskan alkohol 95%. Dibiarkan 1 menit

Dibuang sisa alkohol ke dalam mangkuk dan dibilas dengan

aquadest.

Diteteskan larutan safranin. Dibiarkan selama 30 detik.

Dibuang kelebihan larutan safranin ke dalam mangkuk dan dibilas

dengan aquadest.

Dikeringkan sediaan dengan hati-hati menggunakan kertas penghisap

dan diperiksa di bawah mikroskop
 F. Data Pengamatan dan Analisis Data
1. Peneraan Mikroskop
Tabel 1. Peneraan mikroskop
Gambar Keterangan
Perbesaran 400x Mob = 0,01 mm
Mok = 4 mm

Perbesaran 1000x Mob = 0,01 mm

Mok = 10 mm

2. Pewarnaan Bakteri Secara Gram

Tabel 2. Pewarnaan Bakteri secara Gram
Kode Gambar Bentuk Sel Warna Sel Sifat Gram Bakteri
A Perbesaran 1000X Coccus Merah Negatif

Bakteri Coccus
 B Perbesaran 1000X Bassil Merah Negatif

Bakteri Bassil

3. Pengukuran Sel Bakteri

Tabel 3. Pengukuran Sel Bakteri
Kode Gambar Bentuk Skala pada Rata-Rata x Kalibrasi
Sel Mikrometer Okuler (MOk) µm
1 2 3
A Pengukuran 1: Coccus 2 2 2 2 x 0,5 µm = 1 µm
Perbesaran 1000X

Bakteri Coccus

Pengukuran 2:
Perbesaran 1000X

Bakteri Coccus
 Pengukuran 3:
Perbesaran 1000X

Bakteri Coccus

B Pengukuran 1: d=2 d=4 d=2 d = 2,67 x 0,5 µm = 1,34 µm

Perbesaran 1000X Bassil p=4 p=6 p=3 p = 4,3 x 0,5 µm = 2,17 µm

Bakteri Bassil

Pengukuran 2:
Perbesaran 1000X

Bakteri Bassil

Pengukuran 3:
Perbesaran 1000X

Bakteri Bassil
 Langkah pertama yang harus dilakukan dalam pengukuran sel bakteri
yaitu melakukan peneraan pada mikrometer okuler. Hal ini disebabkan harga
skala pada setiap mikroskop berbeda-beda.
a. Perbesaran 400x
Mob = 0,01 mm
Mok = 4 mm
𝑀𝑜𝑏 0,01
= = 0,0025 𝑚𝑚 = 2,5 µ𝑚
𝑀𝑜𝑘 4
b. Perbesaran 1000x
Mob = 0,01 mm
Mok = 10 mm
𝑀𝑜𝑏 0,01
= = 0,001 𝑚𝑚 = 1 µ𝑚
𝑀𝑜𝑘 10
Pada perbesaran 400x dari peneraan mikrometer okuler didapatan skala
2,5 µm dengan objektif sebesar 0,01 mm dan okuler 4 mm. Sedangkan, pada
perbesaran 1000x dari peneraan mikrometer okuler didapatkan skala 1 µm
dengan objektif sebesar 0,01 mm dan okuler 10 mm.
Pada pewarnaan Gram bakteri koloni A dan B memiliki warna merah yang
menandakan memiliki sifat negatif. Bakteri A memiliki bentuk coccus
(bulat), sedangkan bakteri memiliki bentuk basil (batang).
Pada pengukuran sel bakteri dilakukan 3 kali pengulangan. Ukuran sel
bakteri A (coccus) memiliki ukuran 2, 2, 2 yang memiliki rata-rata 2
dikalikan dengan 0,5 µm, sehingga sel bakteri A memiliki ukuran 1 µm.
Sedangkan, pada sel bakteri B (bassil) memiliki ukuran:
d=2 d=4 d=2
p=4 p=6 p=3
Ukuran rata-rata bakteri memiliki diameter 2,67 dan panjang 4,3. Hasil rata-
rata diameter dan panjang bakteri dikalikan dengan 0,5 µm, sehingga sel
bakteri B memiliki ukuran diameter 1,34 µm dan panjang 2,17 µm.
G. Pembahasan
Pada praktikum ini, kami melakukan pengamatan pengukuran sel
bakteri dengan melakukan peneraan mikrometer okuler dan pewarnaan gram
bakteri terlebih dahulu.
1. Peneraan Mikrometer Okuler
Peneraan mikrometer okuler berfungsi untuk menetapkan nilai
skala berdasarkan skala standar yang sudah ada pada mikrometer meja.
Mikrometer meja memiliki nilai skala yang pasti, nilai satu skala
mikrometer meja adalah 0.01 mm. Dimensi sel umumnya dinyatakan
1
dalam satuan mikrometer (µm), yaitu mm. Peneraan mikrometer
1000

okuler pada pengamatan ini dilakukan pada perbesaran 400x dan 1000x.
Perbesaran yang digunakan dapat mempengaruhi perbesaran sel yang akan
kita ukur. Mikroskop dan mikrometer okuler yang berbeda juga dapat
mempengaruhi perbesaran sel, karena setiap mikroskop memiliki resolusi
yang berbeda-beda walaupun hanya sedikit. Hadioetomo (2010),
menyatakan bahwa mikrometer okuler terlebih dahulu harus ditera
terhadap mikrometer meja yang sudah memiliki skala yang pasti sebelum
digunakan untuk mengukur sel.
2. Pewarnaan gram bakteri
Pewarnaan Gram bakteri merupakan teknik pewarnaan diferensial
yang penting untuk membedakan bakteri. Dalam proses ini dibutuhkan
larutan Ammonium Oksalat Kristal Violet, larutan iodium, larutan safranin
dan alkohol 95%. Bakteri yang sudah dilakukan pewarnaan dengan
menggunakan metode pewarnaan ini dapat dibedakan menjadi dua
kelompok yaitu gram positif dan gram negatif. Pada praktikum ini, kami
mengambil biakan bakteri pada bak sampah kolam trapesium.
Berdasarkan praktikum yang telah kami lakukan diketahui bahwa
dua koloni dari media lempeng tersebut merupakan bakteri gram negatif,
karena pada hasil akhir pewarnaan yang menghasilkan bakteri berwarna
merah. Hal ini dapat terjadi karenakan zat pewarna lembayung dan iodine
membentuk senyawa kompleks. Pada beberapa jenis marga, bakteri dapat
melepaskan zat pewarna dengan mudah apabila dicuci menggunakan
alkohol, sedangkan pada bakteri yang lain zat pewarna akan tetap
bertahan, Volk (2006). Hal ini dikarenakan antara gram positif dan gram
negatif memiliki perbedaan dalam hal ketebalan dinding selnya. Pada
bakteri gram positif memiliki struktur dinding sel yang tebal sehingga
 bakteri bewarna ungu pada akhir pewarnaan. Sebaliknya, pada bakteri
gram negatif dinding selnya memiliki struktur yang tipis sehingga
warnanya dapat memudar ketika dicuci dengan alkohol dan menyebabkan
warna bakteri berubah menjadi merah (Pelczar, 2007).
Larutan safranin berfungsi sebagai pewarna pada pengamatan
bakteri ini. Terdapat keterkaitan yang berhubungan antara bakteri dan zat
pewarna basa yang disebabkan asam nukleat dalam jumlah besar dalam
protoplasma sel bakteri. (Pelczar, 2007) menyatakan bahwa, jika bakteri
diberi zat pewarna asam akan ditolak oleh muatan negatif bakteri secara
keseluruhan. Sebaliknya, jika bakteri diberi warna muatan negatif dalam
asam nukleat bakteri akan bereaksi dengan ion positif yang terdapat dalam
zat pewarna basa. Jadi, dapat simpulkan bahwa ketika bakteri diolesi
dengan zat pewarna safranin, asam akan menghasilkan pewarnaan pada
daerah latar belakang bakteri saja.
3. Pengukuran sel bakteri
Berdasarkan hasil praktikum yang kita lakukan, terdapat beberapa
koloni bakteri yang memiliki bentuk dan ukuran yang berbeda. Akan
tetapi pada praktikum ini hanya diamati dua koloni saja. Koloni pertama
merupakan bakteri kokus yang memiliki bentuk bulat. Koloni kedua
merupakan bakteri basil yang memiliki bentuk seperti batang. Pelczar
(2007) menyatakan bahwa sel bakteri bentuk batang berukuran rata-rata
seperti bakteri tifoiddan disentri mempunyai lebar 0,5 sampai 1 µm dan
panjang 2 sampai 3 µm. Terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi
berbagai ukuran bakteri, seperti umur dari biakan dan keadaan medium
pertumbuhan bakteri. Ketika akan membandingkan bentuk dan ukuran sel
bakteri, ada beberapa hal yang harus diperhatikan, yaitu: kondisi bakteri,
temperatur disimpannya bakteri, penyinaran oleh sumber cahaya, usia
piaraan bakteri harus sama.
H. Kesimpulan
- Pewarnaan sel bakteri secara gram harus dilakukan dengan sabar serta
dimulai dari tahap pertama hingga tahap terakhir agar mendapatkan hasil
yang maksimal dan dapat diamati dengan jelas dibawah mikroskop.
 - Pewarnaan sel bakteri secara gram dapat menentukan sifat gram bakteri
yaitu ditandai dengan perubahan warna akhir, pada gram postif warna
akhirnya adalah ungu karena dinding selnya tersusun dari peptidoglikan,
sedangkan gram negatif warna akhirnya adalah merah karen didnding sel
banyak mengandung lipid.
- Peneraan skala mikrometer okuler harus dilakukan dengan teliti dan nilai
harus akurat karena nantinya hasil tersebut akan digunakan pada saat
pengukuran sel bakteri, sel bakteri yang diukur juga memiliki dua macam
bentuk yaitu coccus dan basil, pada coccus diukur diameternya saja,
sedangkan pada basil diukur panjang dan lebarnya. Hasil peneraan juga
akan digunakan pada pengamatan selanjutnya setelah pengukuran sel
bakteri.
I. Diskusi
Pewarnaan Secara Gram
1. Mengapa terjadi perbedaan reaksi dan hasil pewarnaan antara bakteri gram
positif dan gram negatif? Jelaskan proses kimiawi yang terjadi dalam
proses pewarnaan gram!
Jawab: Terjadi perbedaan reaksi dan hasil pewarnaan antara bakteri gram
positif dan gram negatif adalah dikarenakan adanya perbdaan susunan
kimia pada dinding sel pada kedua gram tersebut. Pada gram positif
muncul warna akhir ungu dikarenakan terdapat lapisan peptidoglikan yang
tebal pada dinding sel, sedangkan pada gram negatif warna akhirnya
adalah merah hal ini dikarenakan pada dinding sel lapisan yang paling
tebal adalah lipid. Perbedaan kimia pada dinding sel gram positif terdiri
atas peptidoglikan yang banyak, asam teikoat, protein dan lipid yang
sedikit serta tidak adanya lipopolisakarida. Sedangkan pada gram negatif
mengandung sedikit peptidoglikan, tidak ada asam teikoat, mengandung
lipopolisakarida, serta banyakprotein dan lipid.
Pengukuran Sel
1. Tulislah hasil perhitungan peneraan harga skala mikrometer okuler
pada pembesaran 400 X dan 1000 X. mengapa perlu dilakukan
peneraan pada kedua macam pembesaran tersebut?
 Jawab: Hasil perhitungan peneraan dengan perbesaran 400 x adalah
2.5 μm dan pebesaran 1000 x adalah 1 μm
perlu dilakukan peneraan karena setiap mikroskop mempunyai harga
skala yang berbeda-beda, peneraan mikroskop juga berfungsi agar
dapat mempermudah dalam pengukuran sel bakteri yang memiliki
Panjang ataupun diameter, hasil peneraan juga akan digunakan pada
pengamatan selanjutnya.
2. Tulislah hasil pengukuran sel bakteri yang diamati dalam 3 ulangan,
lalu hitunglah nilai reratanya. Mengapa sel bakteri yang berbentuk
bacil harus diukur panjang dan diameter selnya, sedangkan sel bakteri
yang berbentuk coccus hanya diukur diameter sel saja?
Jawab: pada koloni yang berbentuk coccus didapatkan rata-rata sebesar
1 μm dan pada bakteri yang berbentuk bacil didapat kan rata-rata
Panjang sebesar 1.34 μm dan lebar 2.17 μm. Pada sel bakteri yang
berbentuk bacil harus diukur panjang dan diameter selnya karena sel
yang berbentuk bacil mempunyai panjang serta lebar yang berbeda,
sedangkan sel bakteri yang berbentuk coccus bentuknya bulat dan
memiliki diameter yang sama sehingga yang diukur hanya diameternya
saja.
J. Daftar Pustaka
Hadioetomo, Ratna Siri. 2010. Mikrobiologi Dasar dalam Praktikum:
Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium Mikrobiologi. Jakarta:
PT Gramedia.
Pelczar, M. J., Chan, E.C.S. 2007, Elements of Microbiology. Mc Graw
Hill Book Company: New York.
Volk,Wesley, Adisoemarto, S(editor). 2006. Mikrobiologi Dasar. Jakarta:
Gelora Aksara Pratama Erlangga.
K. Lampiran

Pengukuran bakteri bassil A Pengukuran bakteri bassil A

Peneraan perbesaran 400x Peneraan perbesaran 1000x