ELISA Test for Analyzing of Incidence of Type 1 Diabetes Autoantibodies

(GAD and IA2) in Children and Adolescents

BAHAN DAN METODE

Sampel pasien yang diduga menderita diabetes tipe 1 dikirim dari departemen
Endokrinologi klinik Pediatrik CCUS ke Institute of Clinical Immunology CCUS, dalam periode
satu tahun untuk analisis antibodi Glutamic Acid Decarboxylase (GAD) dan Islet tyrosine
phosphatase 2 (IA2).

ELISA kit memungkinkan EUROIMMUN Anti GAD ELISA (IgG) uji in vitro kuantitatif
untuk auto-antibodi GAD manusia dalam serum atau plasma dengan EDTA. Dalam langkah
pertama melakukan metode ELISA, sampel pasien diinkubasi, di dalam well. Jika positif, akan
terdapat pengikatan spesifik dari antibodi pada GAD. Antibodi terikat membentuk penghubung
antara GAD di well dan pereaksi GAD yang terikat biotin, yang ditambahkan pada langkah
selanjutnya. Untuk mendeteksi biotin yang terikat, inkubasi ketiga dilakukan penambahan avidin
yang terikat enzim yang mengkatalisasi reaksi berwarna. Intensitas warna sebanding dengan
konsentrasi antibodi terhadap GAD.

Metode ini dilakukan dengan 25μl kalibrator, kontrol negatif dan positif dan sampel
serum pasien dimuat ke dalam well mikro titer individu, menurut protokol pipetting. Setelah itu,
inkubasi berlangsung selama satu jam, pada suhu kamar dan pada shaker diatur ke 50 putaran per
menit (rpm). Setelah inkubasi, langkah selanjutnya adalah mencuci dengan mesin cuci otomatis
dengan micro-titer plate tiga kali dengan 450 μl masing-masingnya, dimana buffer pencuci harus
dibiarkan pada setiap well selama 30 hingga 60 detik, selama setiap langkah mencuci, dan
setelah itu well dikosongkan. Setelah dicuci, di setiap well micro titer, 100 μl antibodi anti GAD
yang terikat biotin disatukan. Diinkubasi selama satu jam pada suhu kamar pada shaker yang
disetel hingga 500 rpm. Setelah inkubasi, langkah mencuci sebelumnya diulangi. 100 μl enzim
peroksidase konjugat berlabel avidin disalurkan ke setiap well micro titer. Diinkubasi selama 20
menit, pada suhu kamar pada shaker diatur ke 500 rpm. Setelah inkubasi, langkah yang sama
dengan mencuci micro-titer plate diulangi. Kemudian, 100 μl dari kromogen / substrat dipipet di
setiap well dan diinkubasi selama 20 menit pada suhu kamar sambil dilindungi dari sinar
matahari langsung. Berikan 100 μl stop solution di setiap well dengan urutan kromogen / substrat
yang sama.

Pengukuran fotometrik intensitas warna dilakukan pada panjang gelombang 450 nm dan
sesudahnya pada 405 nm, menggunakan micro-titer plate reader, dalam waktu 5 menit setelah
menambahkan stop solution. Sebelum mengukur, micro-titer plate harus dikocok perlahan, untuk
memastikan distribusi larutan yang homogen. IA2 ELISA (IgG) adalah esai in vitro untuk
autoantibodi manusia terhadap tirosin fosfatase (IA2) dalam serum atau plasma dengan EDTA.
50 μl kalibrator ditambahkan pada micro-titer plate, dengan menggunakan kontrol positif atau
negatif, serta sampel serum pasien, sambil juga menuangkan 25 μl sampel buffer, di setiap well.
Campuran kemudian ditutup dan dibiarkan selama 5 detik dengan shaker pada 500 rpm.
Diinkubasi selama 16 - 20 jam pada + 4 ° - + 8 ° C. Setelah inkubasi, cuci dengan buffer pencuci
dilakukan tiga kali dengan volume 450 μl pada mesin cuci otomatis. 100 μl IA2 (mis. Biotin
berlaber IA2) dipipet di setiap well dan diinkubasi selama satu jam di + 4 ° - + 8 ° C. Setelah
inkubasi, sumur dikosongkan dan langkah pencucian otomatis yang dijelaskan sebelumnya
diulang. Semua langkah-langkah lain sama, seperti dengan GAD ELISA essay.

METODE

Dalam jangka waktu satu tahun, di Departemen Imunologi Klinis, Pusat Klinis
Universitas Sarajevo (CCUS), 80 sampel pasien dengan antibodi anti GAD dan IA2 dianalisis.
Dari seluruh jumlah sampel, 41 adalah pasien pria atau 51% dan 39 wanita, atau 49%. Pasien
termuda lahir pada tahun 2012, dan yang tertua pada tahun 1993. Usia rata-rata kelahiran pasien
pada tahun 2011. Nilai rata-rata hasil IA2 adalah 293,47 dan nilai rata-rata untuk hasil GA adalah
319,10. Median untuk semua hasil antibodi GAD adalah 48,36, sedangkan median untuk
antibodi IA2 adalah 179, 1. Modus untuk IA2 adalah 0, dan untuk GAD adalah 7,47. Menurut
protokol EUROIMMUNE nilai hasil yang disarankan adalah: negatif apabila <10 IU / ml, dan
positif apabila > 10 IU / ml.

Menurut protokol itu, proporsi hasil positif untuk antibodi IA2 dan antibodi GAD adalah
37% untuk antibodi IA2 dan 63% untuk antibodi GAD (Diagram 1). Nilai rata-rata untuk tanggal
lahir pasien untuk antibodi IA2 positif adalah 2002 dan untuk antibodi IA2 negatif adalah 2001.
Nilai rata-rata untuk tanggal lahir pasien terdiri dari mereka yang lahir pada tahun 2001,
Antibodi anti-GAD, untuk nilai positif dan negative, yang selanjutnya dapat dijelaskan oleh
kelompok fokus pasien yang dipantau di Klinik Anak, CCUS. Dalam kelompok yang terdiri dari
80 pasien ini, yang dianalisis dengan antibodi anti-GAD dan IA2, 15 pasien lahir, pada 2005,
atau lebih muda (Diagram 2).

Menurut protokol EUROIMMUNE yang kami gunakan, batas deteksi anti IA2 ELISA
(IgG) yang lebih rendah didefinisikan sebagai kepunahan rata-rata ditambah tiga kali standar
deviasi sampel bebas analit dan merupakan titer antibodi terkecil yang dapat dideteksi dengan
jelas. Batas deteksi ELISA ditemukan 0,7 IU / ml. Dalam hasil kami, kami mendapatkan
tambahan, 0,7 IU / ml. Untuk ELISA anti-GAD, batas deteksi antibodi yang lebih rendah seperti
yang direkomendasikan oleh protokol EUROIMMUNE adalah 0,2 IU / ml, sedangkan nilai
terendah dalam evaluasi GAD kami juga 0,2 IU / ml.