BIOTECHNOLOGICAL PRODUCTION OF CITRIC ACID

Asam sitrat (asam 2-hidroksi-propana-1,2,3-trikarboksilat) namanya berasal dari kata

Latin citrus, pohon yang buahnya seperti lemon. Asam sitrat adalah asam tricarboxylic (Gambar
1) dengan berat molekul 210,14 g / mol, yang mengandung tiga gugus fungsi karboksilat dengan
tiga nilai pKa yang berbeda (3.1, 4.7, dan 6.4). Ini adalah produk metabolisme utama yang
terbentuk di siklus asam tricarboxylic (atau Krebs) dan ditemukan dalam jumlah kecil jumlah di
hampir semua tanaman dan hewan, terisolasi dari jus lemon pada tahun 1784.
Asam sitrat pertama kali diproduksi secara komersial di Inggris, sekitar 1826 dari lemon
impor Italia (lemon mengandung 7- 9% asam sitrat). Jus lemon tetap menjadi sumber komersial
asam sitrat sampai 1919, ketika proses industri pertama kali menggunakan Aspergillus niger
dimulai di Belgia. Saat ini, ekstraksi asam sitrat terbatas pada beberapa pabrik kecil di Meksiko
dan
Afrika.

Gambar 1. Struktur kimia asam sitrat

Asam sitrat disintesis dari gliserol oleh Grimoux dan Adams dan kemudian dari
dikloroaseton simetris. Lain rute telah diterbitkan dari berbagai bahan sintetis sejak itu, tetapi
metode kimia sejauh ini terbukti tidak kompetitif.

Wehmer adalah yang pertama menunjukkan itu Citromyces (sekarang Penicillium)

mengakumulasi asam sitrat dalam gula sedang dan garam anorganik. Sejak itu, banyak
organisme telah ditemukan menumpuk asam sitrat: A. niger, Aspergillus awamori, Aspergillus
nidulans, Aspergillus fonsecaeus, Aspergillus luchensis, Aspergillus phoenicus, Aspergillus
wentii, Aspergillus saitoi, Aspergillus flavus, Absidia sp., Acremonium sp., Botrytis sp.,
Eupenicillium sp., Mucor piriformis, Penicillium janthinellum, Penicillium pembatasan,
Talaromyces sp., Trichoderma viride dan Ustulina vulgaris.
 Currie menemukan bahwa beberapa strain A. niger mampu tumbuh di media yang
mengandung gula dan garam pada awalnya pH 2,5-3,5. Sepanjang pertumbuhan mereka, strain
ini diekskresikan sejumlah besar asam sitrat, yang membentuk dasar untuk produksi industri.

Selain jamur, diketahui bahwa beberapa ragi menghasilkan asam sitrat dari n-alkana dan
karbohidrat, terutama spesies milik genera Candida, Hansenula, Pichia, Debaromyces, Torula,
Torulopsis, Kloekera, Saccharomyces, Zygosaccharomyces dan Yarrowia. Selama 60-an dan 70-
an minyak murah, dan asam sitrat diproduksi secara industri dari ini sumber oleh Candida sp.,
termasuk C. tropicalis, C. catenula, C. guilliermondii dan C. intermediate. Hari ini, produksi ini
tidak ekonomis. Sebagai kerugian, fermentasi oleh ragi menyebabkan pembentukan sejumlah
besar asam isocitric sebagai produk sampingan yang tidak diinginkan, jadi strain mutan dengan
aconitas rendah aktivitas harus digunakan.

Meskipun banyak mikroorganisme dapat digunakan untuk itu menghasilkan asam sitrat,
A. niger masih merupakan industri utama produsen. Bahkan, strain spesifik yang mampu
memproduksi berlebih asam sitrat dalam berbagai jenis proses fermentasi miliki telah
dikembangkan. Hasil teoritisnya adalah 112 g anhidrat asam sitrat per 100 g sukrosa. Namun,
dalam prakteknya, karena kehilangan selama trofofase, hasil asam sitrat dari ini strain sering
tidak melebihi 70% dari hasil teoritis sumber karbon. Meskipun sejarah panjang dan sukses
memproduksi asam sitrat, tidak ada penjelasan bulat dari dasar biokimia dari proses.

BIOCHEMISTRY OF CITRIC ACID PRODUCTION

Untuk meninjau biokimia pembentukan asam sitrat adalah suatu tugas besar. Singkatnya,
dapat dikatakan bahwa kelebihan produksi asam sitrat membutuhkan kombinasi unik nutrisi
yang tidak biasa kondisi (kelebihan sumber karbon, ion hidrogen dan oksigen terlarut, dan
konsentrasi suboptimal dari logam dan fosfat tertentu), yang secara sinergis memengaruhi kinerja
fermentasi.

Menurut Habison et al. dan Rohr dan Kubicek , defisiensi mangan, atau fosfat dan
nitrogen keterbatasan, menghambat anabolisme A. niger, dan hasilnya degradasi protein
menyebabkan peningkatan ion amonium konsentrasi. Peningkatan ini mampu mengimbangi
penghambatan yang diberikan oleh asam sitrat pada fosfofruktokinase , menjadi efektor akhir
yang positif. Konsentrasi tinggi NH4 + dan glukosa juga menekan sintesis –ketoglutarate
dehydrogenase, menghambat katabolisme asam sitrat melalui Siklus Krebs, yang mengarah ke
akumulasi. Karena itu, salah satunya alasan akumulasi asam sitrat adalah akibat dari aliran
pendapatan kecepatan tinggi dan pengurangan kecepatan aliran keluar (Gambar 2). Namun,
pengamatan lain tampaknya bertentangan dengan ini asumsi.
 Gambar 2. Representasi skematis dari metabolisme utama reaksi yang terlibat dalam
produksi asam sitrat oleh A. niger (Manzoni, 2006). PFK = fosfofruktokinase, PC = piruvat
carboxylase, ACO = aconitase.

Masalah kecil lainnya menarik bagi enzim lain: invertase hexokinase, glukosa oksidase
fosfofruktokinase lainnya enzim jalur pentosa fosfat, piruvat kinase sitrat sintase. Aspek penting
menyangkut kebutuhan bahwa Krebs siklus dapat diselesaikan untuk mendukung produksi
berkelanjutan asam sitrat. Untuk mengatasi kurangnya intermediet siklus akibat disfungsi
metabolik yang bertanggung jawab untuk akumulasi asam sitrat, asam piruvat yang dihasilkan
dari glukosa tidak hanya didekarboksilasi menjadi asetil-KoA oleh kompleks piruvat
dehidrogenase, tetapi juga sebagian karboksilasi menjadi asam oksaloasetat selama idiofasa oleh
aksi piruvat karboksilase Ini Reaksi, yang membutuhkan ATP dan tergantung pada K + dan Mg2
+, bukan satu-satunya reaksi anaplerotik yang digunakan untuk mengisi ulang Siklus Krebs.
Tergantung pada organisme, lebih banyak oksaloasetat asam dapat diproduksi dari asam
phosphoenolpyruvic dan CO2 oleh phosphoenolpyruvate carboxykinase, phosphoenolpyruvate
carboxytransphosphorylase, dan phosphoenolpyruvate karboksilase, dan dari asam piruvat oleh
NADPH-dependent enzim malat.

Akhirnya, harus diingat bahwa melanggar isocitric asam oleh isocitrate lyase adalah
reaksi pertama asam glioksilat siklus, jalur yang mengarah ke sintesis asam L-malat dari asam
isocitric dan asetil-CoA, melalui asam oksalat, merupakan racun produk sampingan yang dapat
terakumulasi di bawah optimal kondisi. Kubicek et al. menunjukkan bahwa jalur ini, yang
membantu memulihkan intermediet siklus Krebs, buruk aktif dari gula, sementara itu lyoc israteit
dan malat synthase, enzim kedua dari siklus asam glikoksilat, adalah diinduksi ketika asetat atau
n-alkana digunakan sebagai sumber karbon.

INDUSTRIAL PRODUCTION OF CITRIC ACID

Sekitar 99 % dari produksi asam sitrat dunia terjadi melalui proses mikroba, yang dapat
dilakukan menggunakan permukaan atau budaya terendam. Produk ini dijual sebagai anhidrat
atau asam monohidrat, dan sekitar 70% dari total produksi 1,5 juta ton per tahun digunakan
dalam industri makanan dan minuman sebagai acidifier atau antioksidan untuk menjaga atau
meningkatkan rasa dan aroma jus buah, es krim, dan selai jeruk. 20% adalah digunakan, dengan
demikian, dalam industri farmasi sebagai antioksidan mempertahankan vitamin, efervesen,
pengoreksi pH, darah pengawet, atau dalam bentuk besi sitrat sebagai sumber zat besi untuk
tubuh serta tablet, salep dan kosmetik persiapan. Di industri kimia, yang menggunakan sisa 10%,
digunakan sebagai agen berbusa untuk pelunakan dan perawatan tekstil. Dalam metalurgi, pasti
logam digunakan dalam bentuk sitrat. Asam sitrat juga digunakan dalam industri deterjen
sebagai pengganti fosfat, karena kurang efek eutrofik, dan pada semen yang memperlambat
pengerasan semen. Meskipun banyak strain bakteri menghasilkan asam sitrat, hanya beberapa
mutan A. niger dan A. wentii, yang merupakan spesies yang terkait erat, digunakan untuk
produksi industri.

Semua enzim diekspresikan selama idiofase, kecuali - ketoglutarate dehydrogenase.

Aktivitas sitrat sintase meningkat sebesar 10 kali, sedangkan aconitase dan isocitrate
dehydrogenase berkurang sedikit dibandingkan dengan trofofase. Selama trofofase, glukosa
terutama digunakan untuk produksi biomassa dan teroksidasi menjadi CO2 melalui respirasi,
sedangkan selama idiofase, kehilangan nafas minimal dan substrat hampir seluruhnya dikonversi
menjadi asam organik.

Sumber karbon digunakan dalam fermentasi industri adalah gula dalam larutan dengan
konsentrasi mulai dari 15 hingga 25 %. Karena mikroorganisme yang digunakan secara industri
miliki amilase dan invertase, yang membuatnya mampu menghidrolisis polisakarida dan sukrosa,
secara simultan proses sakarifikasi dan fermentasi dapat dilakukan menggunakan sebagai
substrat pati kentang, tebu dan tebu molase, di antara residu lainnya. Jika hidrolisat glukidik
adalah digunakan sebagai media kultur, pretreatment dengan endapan agen atau resin penukar
ion diperlukan untuk menghilangkan kation dan kemudian mempromosikan disfungsi
metabolisme yang bertanggung jawab akumulasi asam sitrat. Atau, molase sering diobati dengan
kalsium hexacyanoferrate untuk mengendapkan berat logam.

Strain dipilih sesuai dengan sumber karbon. Untuk mengevaluasi kondisi budidaya yang
optimal untuk molase, no metode analisis umum telah dikembangkan; karenanya, apapun siklus
kerja harus didahului dengan tes pendahuluan fermentasi. Perusahaan yang menggunakan molase
sering kali mengoptimalkan kondisi fermentasi pada pilot plant 30 m3 sebelum pindah ke
produksi.

Hasil panen dapat dimaksimalkan menggunakan Cu2 +, Mg2 +, Mn2 +, Fe2 +, Ion Zn2 +
dan Mo2 + dalam konsentrasi dalam urutan ppm, di atas mana prosesnya dipengaruhi secara
negatif. Contohnya, besi, salah satu kofaktor aconitase, memainkan peran penting,
mendukung pertumbuhan biomassa pada konsentrasi lebih tinggi dari 2 ppm, atau kelebihan
asam sitrat pada konsentrasi hanya 0,05-0,5 ppm tergantung pada substrat. Menariknya, Cu
membalikkan efek dari Fe. Bagaimanapun, sensitivitas mikroorganisme menurun dengan
penurunan suhu.
pH adalah parameter penting lainnya, yang ditetapkan sekitar 5 pada awal trofofase, turun
menjadi 3 dalam 48 pertama h trofofase sebagai hasil dari metabolisme nitrogen, dan kemudian
disimpan pada nilai ini selama idiophase untuk menghambat pembentukan asam oksalat dan
glukonat.

BIOPRODUCTION OF CITRIC ACID FROM INDUSTRIAL BY-PRODUCTS

Biayanya rendah, kandungan karbohidratnya tinggi dan tinggi kerentanan terhadap

fermentasi membuat pengolahan produk samping jeruk menjadi alternatif yang menarik, ramah
lingkungan cara untuk produksi bioteknologi bahan kimia.

Strain rekombinan Escherichia coli ditunjukkan untuk fermentasi arabinose dan asam
galakturonat diperoleh dari hidrolisat enzimatik dari kulit jeruk menjadi asam asetat, etanol,
karbon dioksida dan sejumlah kecil asam laktat. Karena adanya inhibitor seperti limonene,
fermentasi dari hidrolisat ini oleh ragi Saccharomyces cerevisiae tidak memberikan hasil yang
menarik. Setelah dihilangkan dengan filtrasi, ragi hanya menunjukkan fermentasi dengan baik
heksosa seperti glukosa, fruktosa dan galaktosa dilepaskan oleh hidrolisis enzimatik dari
polisakarida yang terkandung dalam kulit, tetapi tidak pentosa (arabinosa dan xilosa) atau asam
galakturonat.

Minuman keras yang diekstrak dari kulit jeruk telah digunakan sebagai substrat untuk
produksi asam sitrat oleh jamur. Aravantinos-Zafiris et al. digunakan untuk tujuan ini tiga strain
A. niger yang tersedia secara komersial dan berbeda, khususnya NRRL 599, 364 dan 567,
menjadi yang pertama penghasil asam sitrat terbaik. Kondisi yang paling menguntungkan untuk
produksi asam sitrat oleh A niger NRRL 599 menghasilkan pH 5,8 dengan adanya 40 ml / kg
metanol, tanpa tambahan nutrisi. Dalam kondisi seperti ini, konsentrasi sitrat asam setelah 12
hari adalah 30 g asam sitrat per kg cairan dari mencuci kulit jeruk, sesuai dengan hasil 630 g / kg
berdasarkan total gula yang dikonsumsi. Hasil panen meningkat hingga 730 g / kg saat minuman
keras sebelumnya mengalami termal pra-perawatan.
 Hasil yang diperoleh dengan substrat ini sebanding atau bahkan lebih tinggi dari yang
diperoleh dengan menggunakan bahan baku lain tersebut sebagai minyak, pati dan molas. Para
penulis ini melaporkan sebuah sitrat konsentrasi asam 27 g / l dengan hasil 45% saat
menggunakan kayu hemiselulosa hidrolisat, sedangkan Adham mencapai konsentrasi maksimum
8,6 g / l (konversi 9,8%) menggunakan molase bit.

Zhang menggunakan limbah padat dari pabrik yang memproduksi jus jeruk sebagai
substrat untuk produksi asam sitrat oleh A. niger 999. Perlu ditambahkan lagi 2% metanol ke
dalam kaldu kultur, dan fermentasi berlangsung 4 hari pada 30 ºC. Kang et al. menghasilkan
asam sitrat dari kulit jeruk keprok menggunakan A. niger, menemukan produksi tertinggi di
negara semi-padat budaya. Selanjutnya, produksi asam sitrat adalah ditingkatkan dengan
penambahan 0,2% NH4NO3, 0,1% dari MgSO4.7H2O, 2,5% metanol atau 1,5% etanol.
Dibawah kondisi optimal, hasil maksimum asam sitrat adalah 80,4% dari nilai teoritis

Kumagai et al. , yang mempelajari faktor-faktor yang mempengaruhi produksi asam sitrat
semipadat oleh A. niger dari bahan kering dan limbah cair jeruk keprok, menemukan bahwa
fermentasi dari residu bekas membutuhkan penambahan jus molase untuk menghadapi efek
negatif dari sejumlah besar pengotor. Dengan demikian, konsentrasi maksimum asam sitrat
adalah dicapai dalam media yang terdiri dari 6 g kulit jeruk keprok dan 11 ml jus molase (kadar
gula 14%) yang dipastikan hasil fermentasi dalam kisaran 55-65 % pada 30 ºC setelah 3 hari.
Hang et al. , menggunakan kulit kiwi dan A. niger NRRL 567, menghasilkan sekitar 100 gram
asam sitrat / kg dengan adanya 2 % metanol pada 30 ° C setelah fermentasi 4 hari, dengan hasil
lebih tinggi dari 60% berdasarkan gula yang dikonsumsi.

Vandenberghe et al. , yang dievaluasi tiga berbeda limbah agroindustri, khususnya ampas
tebu, kopi sekam dan singkong ampas tebu, untuk menghasilkan asam sitrat oleh budaya
Aspergillus niger, menemukan hasil CA tertinggi (88 g / kg kering) soal) saat fermentasi
dilakukan dengan singkong bagasse sebagai substrat. Akhirnya, Flores et al. , setelah 5 hari
keadaan fermentasi kulit pir berduri kering oleh A. niger, mencapai produksi maksimum 380 g
monohydrate CA per kg pada 30°C dan kelembaban 86 %, sesuai dengan hasil panen gula awal
68 % dan volumetrik maksimum produktivitas 0,539 g / lh

Metanol dapat merangsang fermentasi asam sitrat. Limbah dari cangkang nanas juga
digunakan untuk menghasilkan asam sitrat oleh A. niger ATCC 1015 . Produksi tertinggi (132 g
/ kg residu) dicapai setelah 6 hari fermentasi pada 29 ºC di media yang mengandung 4 %
metanol. Residu ini juga dipekerjakan oleh Tran et al. dengan tiga strain A. niger dan Aspergillus
foetidus. Di antaranya, A. niger ACM 4992 memastikan produksi asam sitrat tertinggi (194 g /
kg), sesuai dengan hasil 0,74 g asam sitrat / g gula yang dikonsumsi. Kondisi optimal adalah
kelembaban awal 65 %, 3 % metanol, 30°C, pH awal tidak disesuaikan 3,4, ukuran partikel
2 mm dan 5 ppm Fe2 +. Produksi asam sitrat telah dilakukan lebih efektif dengan menggunakan
labu Erlenmeyer dalam batch fermentasi, sementara hasil panen menurun ketika nampan atau
drum bioreaktor berputar digunakan. Efek stimulasi yang sama metanol diamati oleh Kumar et
al. menggunakan campuran berbagai limbah buah dan ampas tebu untuk A. niger DS1 fermentasi
kondisi padat. Penggunaan metanol 4 % (v / w) adalah juga dilaporkan untuk fermentasi kulit
jeruk yang terendam hidrolisat dan fermentasi tebu dalam keadaan padat molase, yang
menyebabkan produksi asam sitrat sebesar 9,2 g / l dan 445,4 g / kg, masing-masing. Roukas
mengamati peningkatan produksi sitrat dari 176 hingga 264 g / kg saat konsentrasi metanol
meningkat hingga 6 % (b / b) dalam keadaan padat pod kering fermentasi. Meskipun peran
stimulasi metanol adalah tidak sepenuhnya diketahui, itu terkait dengan a) penghapusan efek
samping dari trace metal, b) perubahan miselium morfologi akibat variasi dalam fosfolipid
komposisi, c) peningkatan permeabilitas membran sel, dengan demikian membuat ekskresi asam
sitrat lebih mudah, atau d) beberapa pengaruh pada pertumbuhan dan sporulasi.

Sebaliknya, beberapa penulis mengamati efek yang merugikan ketika metanol

ditambahkan, karena mikroorganisme tidak mampu untuk mengasimilasi itu. Misalnya, produksi
CA oleh solid-state fermentasi kulit buah Kiwi oleh A. niger ATCC 9142 menurun secara
signifikan setelah suplementasi dengan 0,74 mmol methanol / l, dan Tsay and To melaporkan
metanol itu menghambat pertumbuhan A. niger TMB 2022 dan produksi CA. Temuan serupa
dilaporkan oleh penulis lain.

CITRIC ACID RECOVERY

Langkah pertama pemulihan asam sitrat melibatkan pengendapan asam oksalat, mungkin
dalam bentuk kalsium oksalat pada pH rendah, dan pemisahan selanjutnya dari medium
mengandung miselium melalui filter berputar atau sentrifugal. Asam sitrat kemudian diendapkan
pada pH 7,2 dan 70-90 ° C dan pulih dengan penyaringan dan pengeringan. Jika produk yang
lebih murni diinginkan, dilarutkan dengan asam sulfat, diolah dengan arang atau resin penukar
ion, dan sekali lagi dikristalisasi sebagai anhidrat asam sitrat (di atas 40°C) atau sebagai
monohidrat (di bawah 36,5°C) Dalam proses permukaan, miselium kadang-kadang diperas untuk
meningkatkan hasil pemulihan.

Pinacci dan Radaelli telah mengusulkan proses elektrodialisis dengan membran bipolar
untuk pemulihan asam sitrat dari media fermentasi, sedangkan Kılıç et al. fermentasi ekstraktif,
di mana langkah-langkah asam sitrat produksi oleh A. niger dan pemisahan terjadi secara
bersamaan, menggunakan minyak jagung dan Hostarex A327 dalam alkohol oleat. Dalam
prosesnya dilakukan dengan Y. lipolytica, pemulihan asam sitrat setelah penyaringan termasuk
media habis pengendapan asam oksalat pada pH rendah dalam bentuk kalsium garam diikuti oleh
pengendapan asam sitrat pada pH 7,2 dan 70-90 ° C.