TEKNIK PENGGUNAAN ALAT

SPEKTROFOTOMETER

Spektrofotometri adalah teknik eksperimen yang digunakan untuk mengukur konsentrasi

zat terlarut dalam larutan tertentu dengan menghitung jumlah cahaya yang diserap oleh zat
tersebut. Teknik ini sangat bermanfaat karena senyawa tertentu juga akan menyerap
panjang gelombang cahaya berbeda pada intensitas yang berbeda. Dengan menganalisis
cahaya yang melalui larutan, Anda dapat mengidentifikasi senyawa terlarut dalam larutan
serta konsentrasinya. Alat yang digunakan untuk menganalisis larutan dengan teknik ini di
laboratorium adalah spektrofotometer.

Spektrofotometer adalah alat yang digunakan untuk mengukur absorbansi dengan cara
melewatkan cahaya dengan panjang gelombang tertentu pada suatu obyek kaca atau kuarsa
yang disebut kuvet. Sebagian dari cahaya akan diserap dan sisanya akan dilewatkan. Alat
atau instrument yang satu ini dilengkapi dengan sumber cahaya (gelombang
elektromagnetik), baik cahaya UV (ultra violet) dengan panjang gelombang dibawah 400
nano meter (nm) ataupun cahaya tampak (visible) dengan panjang gelombang 400 - 700 nm.
Masing-masing cahaya pada alat ini berguna untuk menangkap objek dengan panjang
gelombang yang berbeda.

Pada prinsipnya, alat ini adalah hasil penggabungan dari alat spektrometer dan fotometer.
Spektrometer adalah alat yang menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang
gelombang tertentu. Spektrometer memiliki alat pengurai seperti prisma yang dapat
menyeleksi panjang gelombang dari sinar putih, sedangkan fotometer adalah alat pengukur
intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsikan. Pada fotometer terdapat filter
dari berbagai warna yang memiliki spesifikasi melewatkan trayek panjang gelombang
tertentu.
 Bagian 1
Menyiapkan Sampel
1
Nyalakan spektrofotometer. Sebagian besar alat spektrofotometer harus
dihangatkan terlebih dahulu sebelum dapat memberikan hasil pengukuran yang
akurat. Jadi, nyalakan mesin ini kemudian biarkan selama paling tidak 15 menit
sebelum mengukur sampel.
 Gunakan waktu ini untuk menyiapkan sampel.
 2
Bersikan kuvet atau tabung reaksi. Di laboratorium sekolah, mungkin tersedia
tabung reaksi sekali pakai yang tidak harus dibersihkan terlebih dahulu. Namun, jika
Anda menggunakan kuvet atau tabung reaksi biasa, pastikan untuk membersihkan
peralatan ini secara menyeluruh sebelum digunakan. Bilas semua kuvet dengan air
deion.
 Berhati-hatilah menggunakan kuvet karena harganya cukup mahal.
 Selama menggunakan kuvet, jangan pegang sisi yang dilewati cahaya (biasanya sisi
yang bening pada wadah).
3
Tuang sampel secukupnya ke dalam kuvet. Volume maksimum sebagian kuvet
adalah 1 ml, sementara volume maksimum tabung reaksi adalah 5 ml. Hasil
pengukuran Anda seharusnya akurat asalkan cahaya spektrofotometer masih bisa
melalui sampel dan bukan bagian kosong dalam wadah.
Jika Anda menggunakan pipet untuk memasukkan sampel, gunakan tip yang baru
untuk masing-masing sampel. Dengan begitu, kontaminasi silang dapat dihindari.
4
Siapkan larutan kontrol. Larutan yang juga dikenal sebagai blank atau blanko ini
hanya mengandung pelarut dalam larutan yang dianalisis. Sebagai contoh, jika Anda
punya sampel garam yang terlarut dalam air, larutan blank Anda butuhkan adalah
air. Jika air yang Anda gunakan berwarna merah, Anda juga harus menggunakan
larutan blank berwarna merah. Gunakan wadah sejenis untuk menampung
larutan blank dalam volume yang sama dengan sampel.

5
Lap sisi luar kuvet. Sebelum kuvet dimasukkan ke dalam spektrofotometer, Anda
harus memastikan kebersihannya terlebih dahulu untuk menghindari interferensi
pengukuran akibat partikel debu atau pengotor. Gunakan lap bebas serat untuk
membersihkan tetesan air atau debu yang menempel pada sisi luar kuvet.

Bagian 2
Melakukan Eksperimen
 1
Tentukan dan atur panjang gelombang cahaya untuk menganalisis
sampel. Gunakan panjang gelombang cahaya tunggal (sinar monokromatik) untuk
meningkatkan efektivitas pengukuran. Pilihlah warna cahaya yang dapat diserap
oleh kandungan bahan kimia yang diduga terlarut dalam sampel uji. Atur panjang
gelombang sesuai spesifikasi spektrofotometer yang Anda gunakan.
 Di laboratorium sekolah, panjang gelombang ini biasanya akan diberikan dalam
petunjuk eksperimen.
 Oleh karena sampel akan merefleksikan seluruh cahaya yang tampak, panjang
gelombang warna cahaya eksperimen biasanya selalu berbeda dengan warna
sampel.
 Suatu objek tampak berwarna tertentu karena merefleksikan panjang gelombang
tertentu dan menyerap seluruh warna lainnya. Rumput tampak berwarna hijau
karena klorofil di dalamnya merefleksikan warna hijau dan menyerap warna lainnya.
 2
Kalibrasi spektrofotometer dengan larutan blank. Letakkan larutan blank ke
dalam tempat kuvet dan tutup spektrofotometer. Pada layar spektrofotometer
analog, ada jarum yang akan bergerak berdasarkan intensitas deteksi cahaya.
Setelah larutan blank dimasukkan, jarum ini seharusnya akan bergerak ke kanan.
Catat nilai ini untuk berjaga-jaga jika dibutuhkan nanti.
Biarkan larutan blank tetap berada di dalam spektrofotometer, kemudian geser
jarum ke angka nol menggunakan kenop pengatur.
 Spektrofotometer digital juga dapat dikalibrasi dengan cara yang sama. Hanya saja,
alat ini dilengkapi layar digital. Atur hasil pembacaan larutan blank ke angka 0
dengan kenop pengatur.
 Meskipun larutan blank dikeluarkan dari spektrofotometer, kalibrasinya akan tetap
berlaku. Jadi, saat Anda mengukur seluruh
sampel, absorbansi (serapan) blank akan secara otomatis dikurangi.
 3
Keluarkan blank dan uji hasil kalibrasi spektrofotometer. Setelah
larutan blank dikeluarkan dari dalam spektrofotometer pun, jarum atau angka pada
layar seharusnya akan tetap terbaca 0.
Letakkan larutan blank kembali ke spektrofotometer dan pastikan hasil
pembacaannya tidak berubah. Jika spektrofotometer berhasil dikalibrasi dengan baik
menggunakan larutan blank, hasil pada layar seharusnya akan tetap 0.
 Jika jarum atau angka pada layar tidak terbaca 0, ulangi langkah kalibrasi dengan
larutan blank.
 Jika masalah masih terus terjadi, carilah bantuan atau mintalah seseorang
memeriksa spektrofotometer.
 4
Ukur absorbansi sampel. Keluarkan larutan blank dan masukkan sampel ke dalam
spektrofotometer. Tunggulah sekitar 10 detik hingga jarum tampak stabil atau angka
pada layar digital berhenti berubah. Catat
persentase transmitan dan/atau absorbansi sampel.
 Semakin banyak cahaya yang dilewatkan, semakin sedikit cahaya yang diserap.
Biasanya, Anda perlu mencatat nilai absorbansi sampel yang umumnya dinyatakan
dalam bilangan desimal, misalnya 0,43.
 Ulangi pengukuran masing-masing sampel paling tidak tiga kali kemudian hitung
rata-ratanya. Dengan begitu, hasil yang Anda peroleh akan lebih akurat.
5
Ulangi eksperimen dengan panjang gelombang cahaya berbeda. Sampel Anda
mungkin mengandung beberapa senyawa yang memiliki absorbansi berbeda
tergantung panjang gelombang cahayanya. Untuk mengurangi ketidakpastian, ulangi
pengukuran sampel dengan interval panjang gelombang 25 nm pada seluruh
spektrum cahaya. Dengan demikian, Anda dapat mendeteksi bahan kimia terlarut
lainnya di dalam sampel.

Bagian 3
Menganalisis Data Absorbansi
 1
Hitung transmitan dan absorbansi sampel. Transmitan adalah berapa banyak
cahaya yang dapat melewati sampel dan mencapai spektrofotometer. Sementara
itu, absorbansi adalah berapa banyak cahaya yang diserap oleh salah satu bahan
kimia terlarut dalam sampel. Ada banyak spektrofotometer modern memberikan
keluaran dalam bentuk transmitan dan absorbansi. Namun, jika Anda mendapatkan
nilai intensitas cahaya, Anda juga dapat menghitung kedua nilai ini sendiri.
 Transmitan (T) dapat diketahui dengan membagi intensitas cahaya yang melewati
larutan sampel dengan jumlah cahaya yang melewati larutan blank.

Nilai ini biasanya dinyatakan dalam bilangan desimal atau persentase. T = I/I 0,
dengan I adalah intensitas sampel dan I0 adalah intensitas blank.
 Absorbansi (A) dinyatakan sebagai negatif logaritma basis 10
(eksponen) transmitan: A = -log10T.[11] Jadi, jika T = 0,1, A = 1 (0,1 adalah 10
pangkat -1). Hal ini berarti, cahaya yang dilewatkan adalah 10%, sementara 90%-
nya diserap. Sementara itu, jika T= 0,01, A = 2 (0,01 adalah 10 pangkat -2). Hal ini
berarti, cahaya yang dilewatkan adalah 0,1%.
 2
Buat grafik nilai absorbansi vs panjang gelombang. Nyatakan
nilai absorbansi sebagai sumbu y dan panjang gelombang sebagai sumbu x. Dari
titik-titik seluruh hasil absorbansi dalam setiap panjang gelombang,
Anda akan mendapatkan spektrum absorbansi sampel, dan mengidentifikasi
kandungan senyawa serta perbandingannya dalam sampel.
 Spektrum absorbansi biasanya memiliki puncak pada panjang gelombang tertentu.
Panjang gelombang puncak ini memungkinkan Anda mengidentifikasi senyawa
tertentu.
 3
Bandingkan spektrum absorbansi Anda dengan grafik senyawa tertentu yang
telah diketahui. Setiap senyawa memiliki spektrum absorbansi yang unik dan selalu
memiliki panjang gelombang puncak yang sama dalam setiap pengukuran. Dengan
membandingkan grafik yang Anda dapatkan dengan grafik senyawa tertentu yang
telah diketahui, Anda dapat mengidentifikasi kandungan zat terlarut dalam larutan
sampel.

 Anda juga bisa menggunakan metode ini untuk mengidentifikasi zat kontaminan
dalam sampel. Jika sampel Anda seharusnya menghasilkan satu panjang
gelombang puncak yang jelas, tetapi justru memberikan dua puncak pada panjang
gelombang berbeda, berarti ada masalah dalam sampel Anda.

Hal yang Anda Butuhkan

 Spektrofotometer
 Senyawa dalam larutan yang akan dianalisis
 Pelarut tambahan (untuk larutan blank)
 Wadah untuk larutan sampel dan blank (kuvet, tabung reaksi, dll.)