S2 Herbal Medik.

Tugas Metode Uji Obat Herbal

Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013

METODE UJI ANTIMIKROBA OBAT HERBAL

I. PENGERTIAN
Antimikroba adalah senyawa yang dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme atau
membunuh mikroorganisme, khususnya mikroorganisme yang merugikan manusia.
Mikroorganisme adalah setiap organisme yang hanya dapat dilihat dengan mikroskop yaitu
protozoa, bakteri, jamur, dan virus adalah contoh dari mikroorganisme.
Berdasarkan sifat toksisitas selektif , ada anti mikroba yang bersifat menghambat pertumbuhan
mikroba , dikenal sebagai aktifitas bakteriostatik dan ada yang bersifat membunuh mikroba ,
dikenal sebagai aktivitas bakterisid.
Suatu zat antimikroba yang ideal memiliki toksisitas selektif. Istilah ini berarti bahwa suatu obat
berbahaya bagi parasit tetapi tidak membahayakan inang. Seringkali, toksisitas selektif lebih
bersifat relatif dan bukan absolut; ini berarti bahwa suatu obat yang pada konsentrasi tertentu
dapat ditoleransi oleh inang, dapat merusak parasit.
Antibiotika yang ideal sebagai obat harus memenuhi syarat-syarat berikut:
a. Mempunyai kemampuan untuk mematikan atau menghambat pertumbuhan
mikroorganisme yang luas (broad spectrum antibiotic)
b. Tidak menimbulkan terjadinya resistensi dari mikroorganisme pathogen
c. Tidak menimbulkan pengaruh samping (side effect) yang buruk pada host, seperti reaksi
alergi, kerusakan syaraf, iritasi lambung, dan sebagainya
d. Tidak mengganggu keseimbangan flora yang normal dari host seperti flora usus atau
flora kulit.

II. MEKANISME
Keefektifan penghambatan merupakan salah satu kriteria pemilihan suatu senyawa antimikroba
pada obat herbal. Semakin kuat penghambatannya semakin efektif digunakan. Kerusakan yang
ditimbulkan komponen antimikroba dapat bersifat mikrosidal (kerusakan tetap) atau mikrostatik

1 Amelia Febriani
NPM. 1206179170
 S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal
Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013

(kerusakan sementara yang dapat kembali). Suatu komponen akan bersifat mikrosidal atau
mikrostatik tergantung pada konsentrasi dan kultur yang digunakan.
Mekanisme penghambatan mikroorganisme oleh senyawa antimikroba dapat disebabkan oleh
beberapa faktor, antara lain:
1. Gangguan pada senyawa penyusun dinding sel,
2. Peningkatan permeabilitas membran sel yang dapat menyebabkan kehilangan
komponen penyusun sel,
3. Menginaktivasi enzim, dan
4. Destruksi atau kerusakan fungsi material genetik.
1. Menggangu pembentukan dinding sel
Mekanisme ini disebabkan karena adanya akumulasi komponen lipofilat yang terdapat pada
dinding atau membran sel sehingga menyebabkan perubahan komposisi penyusun dinding
sel. Terjadinya akumulasi senyawa antimikroba dipengaruhi oleh bentuk tak terdisosiasi.
Pada konsentrasi rendah molekul-molekul phenol yang terdapat pada minyak thyme
kebanyakan berbentuk tak terdisosiasi, lebih hidrofobik, dapat mengikat daerah hidrofobik
membran protein, dan dapat melarut baik pada fase lipid dari membran bakteri.
Beberapa laporan juga meyebutkan bahwa efek penghambatan senyawa antimikroba lebih
efektif terhadap bakteri Gram positif daripada dengan bakteri Gram negatif. Hal ini
disebabkan perbedaan komponen penyusun dinding sel kedua kelompok bakteri tersebut.
Pada bakteri Gram posiitif 90 persen dinding selnya terdiri atas lapisan peptidoglikan,
selebihnya adalah asam teikoat, sedangkan bakteri Gram negatif komponen dinding selnya
mengandung 5-20 persen peptidoglikan, selebihnya terdiri dari protein, lipopolisakarida, dan
lipoprotein.
2. Bereaksi dengan membran sel
Komponen bioaktif dapat mengganggu dan mempengaruhi integritas membran sitoplasma,
yang dapat mengakibatkan kebocoran materi intraseluler, seperti senyawa phenol dapat
mengakibatkan lisis sel dan meyebabkan deaturasi protein, menghambat pembentukan
protein sitoplasma dan asam nukleat, dan menghambat ikatan ATP-ase pada membran sel.

2 Amelia Febriani
NPM. 1206179170
 S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal
Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013

3. Menginaktivasi enzim
Mekanisme yang terjadi menunjukkan bahwa kerja enzim akan terganggu dalam
mempertahankan kelangsungan aktivitas mikroba, sehingga mengakibatkan enzim akan
memerlukan energi dalam jumlah besar untuk mempertahankan kelangsungan aktivitasnya.
Akibatknya energi yang dibutuhkan untuk pertumbuhan menjadi berkurang sehingga
aktivitas mikroba menjadi terhambat atau jika kondisi ini berlangsung lama akan
mengakibatkan pertumbuhan mikroba terhenti (inaktif).
Efek senyawa antimikroba dapat menghambat kerja enzim jika mempunyai spesifitas yang
sama antara ikatan komplek yang menyusun struktur enzim dengan komponen senyawa
antimikroba.
4. Menginaktivasi fungsi material genetik
Komponen bioaktif dapat mengganggu pembentukan asam nukleat (RNA dan DNA),
menyebabkan terganggunya transfer informasi genetik yang selanjutnya akan menginaktivasi
atau merusak materi genetik sehingga terganggunya proses pembelahan sel untuk
pembiakan

III. KOMPONEN-KOMPONEN ANTIMIKROBA TUMBUHAN

Komponen antimikroba adalah suatu komponen yang bersifat dapat menghambat
pertumbuhan bakteri atau kapang (bakteristatik atau fungistatik) atau membunuh bakteri
atau kapang (bakterisidal atau fungisidal). Zat aktif yang terkandung dalam berbagai jenis
ekstrak tumbuhan diketahui dapat menghambat beberapa mikroba patogen maupun
perusak makanan. Zat aktif tersebut dapat berasal dari bagian tumbuhan seperti biji, buah,
rimpang, batang, daun, dan umbi.
Komponen aktif yang terdapat pada bawang putih mempunyai efek penghambatan
terhadap beberapa mikroba patogen seperti Staphylococcus aureus, E. coli, dan Bacillus
cereus dan menghambat produksi toksin dari Clostridium botulinum tipe A dengan
menurunkan produksi toksinnya sebanyak 3 log cycle.

3 Amelia Febriani
NPM. 1206179170
 S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal
Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013

C. Botulinum adalah bakteri berspora yang dapat memproduksi toksin pada kondisi yang
memungkinkan, dapat dihambat pertumbuhannya oleh minyak bunga dan biji pala, minyak
daun salam, minyak lada hitam dan lada putih dengan konsentrasi 125 ppm. Laporan lain
juga menyebutkan bahwa ekstrak minyak lada dapat menghambat pertumbuhan S. aureus,
E. coli, dan Candida albicans.
Komponen aktif yang terdapat pada minyak thyme diantaranya thymol, carvacrol, (ro)-
cymene, dan (gamma)-terpiene diketahui mempunyai efek sebangai senyawa antimikroba
terhadapa pertumbuhan bakteri. Bakteri-bakteri yang dapat dihambat pertumbuhannya
antara lain Salmonella sp., S. aureus, E. coli, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni,
dan B. cereus. Dari laporan tersebut dapat juga diperoleh informasi bahwa bakteri gram
positif lebih sensitif dibanding dengan bakteri gram negatif.
Efek penghambatan senyawa antimikroba dari rempah-rempah tidak hanya dapat
menghambat pertumbuhan bakteri, tetapi dapat juga menghambat pertumbuhan khamir
seperti Candida albican dan Sacharomyces cerevisiae. Komponen-komponen aktif pada
minyak thyme, minyak sage, minyak rosemary, minyak cumin, minyak caraway, dan minyak
cengkeh dapat menghambat khamir dengan konsentrasi 0,5-2.0 (mg/mL).
Bakteri dalam bentuk sel vegetatif lebih sensitif dibanding dalam bentuk sporanya, hal ini
dibuktikan oleh Ultee et al. (1998) yang meneliti efek penghambatan komponen carvacrol
yang terdapat pada minyak thyme dan oregano terhadap pertumbuhan bakteri B. cereus.
Pada konsentrasi 1,75 mmol/L bentuk sel vegetatif lebih sensitif dibanding bentuk sporanya.
Hal ini disebabkan struktur spora yang lebih komplek dibanding bentuk sel vegetatif, seperti
adanya komponen asam dipikolinat yang dapat melindungi spora terhadap gangguan faktor
lingkungan (suhu dan pH ekstrim). Lebih lanjut Ultee et al. (1998) menyebutkan bahwa
pada konsentrasi 1.75 mmol/L dapat mneghambat kecepatan pertumbuhan B. cereus
sehingga fase lag diperpanjang. Semakin lama fase lag maka aktivitas B. cereus sebagai
penyebab kerusakan bahan pangan dapat dicegah.
Komponen-komponen antimikroba yang terdapat pada minyak cengkeh, minyak kayu manis,
minyak oregano, minyak thyme, minyak bawang putih, dan bawang merah dapat

4 Amelia Febriani
NPM. 1206179170
 S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal
Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013

menghambat spesies kapang diantaranya adalah Aspergillus flavus, A. parasiticus, A.

versicolor, A. ochraceus, Candida sp., Crytococcus sp., Rhodotorulla sp., Torulopsis sp., dan
Tricosporon sp.
Kapang adalah mikroorganisme penyebab kerusakan bahan pangan terutama biji-bijian dan
produk tepung-tepungan dengan kadar air rendah. Beberapa spesies kapang dapat
menghasilkan toksin (mikotoksin) adalah Aspergillus sp., Penicllium sp., dan Fusarium sp.,
yang dapat menghasilkan aflatoksin, patulin, okratoksin, zearalenon, dan okratoksin. —
(bersambung).

IV. UJI AKTIVITAS dan POTENSI ANTIMIKROBA

Potensi antimikroba adalah kekuatan suatu antibiotika dalam menghambat atau
membunuh pertumbuhan mikroba. Satuannya dalam IU/mg (iu=international unit) atau µg/mg
Prinsipnya yaitu membandingkan respon mikroba uji yang peka terhadap percobaan dalam
kondisi yang sama terhadap zat baku pembanding (standar) atau zat uji. Baku standar yang
digunakan adalah zat/senyawa yg sudah diketahui kemurnian dan kekuatan / potensinya.
Uji aktivitas antimikroba dapat dilakukan dengan 2 cara, yaitu melalui metode turbidimetri
(dilusi) dan metode difusi agar. Caranya sama dengan penentuan potensi antibiotika, tetapi
hanya 1 dosis, umumnya 50%.
Perbedaannya :
 uji aktivitas bersifat kualitatif, hanya menentukan ada/tidaknya aktivitas atau mencari
aktivitas antimikroba terbaik dari suatu kelompok bahan
 Uji potensi antibiotika bersifat kuantitatif yang menghasilkan prosentase kekuatan suatu
antibiotika terhadap antibiotika pembanding dari jenis yang sama
Penentuan aktivitas antimikroba suatu ekstrak tanaman dapat dilakukan bila terpenuhi
tiga syarat, yaitu:
a) Ekstrak tanaman harus bisa kontak dengan dinding sel mikroorganisme,
b) Kondisi pengujian diatur sedemikian rupa sehingga mikroorganisme dapat tumbuh saat
tidak ada bahan antimikroba, dan

5 Amelia Febriani
NPM. 1206179170
 S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal
Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013

c) Ada parameter ukur tingkat pertumbuhan mikroorganisme (Hostettmann, 1991).

Aktivitas antibakteri ditentukan oleh spektrum kerja, cara kerja dan ditentukan pula oleh
konsentrasi hambat minimum (KHM). Konsentrasi Hambat minimum (KHM) adalah konsentrasi
minimum dari suatu zat yang mempunyai efek daya hambat pertumbuhan mikroorganisme.

Penetapan KHM dapat dilakukan dengan dua cara yaitu

a) Cara cair

Pada cara ini digunakan media cair yang telah ditambahkan zat yang dapat menghambat
pertumbuhan bakteri atau jamur dengan pengenceran tertentu kemudian diinokulasikan biakan
bakteri atau jamur dalam jumlah yang sama. Respon zat uji ditandai dengan kejernihan atau
kekeruhan pada tabung setelah diinkubasi.

b) Cara padat

Pada cara ini digunakan media padat yang telah dicampur dengan larutan zat uji dengan
berbagai konsentrasi. Dengan cara ini satu cawan petri dapat digores lebih dari satu jenis
mikroba untuk memperoleh nilai KHM.

Banyak metode yang dapat diterapkan untuk menentukan aktivitas antimikroba dimana
masing-masing metode memiliki kelebihan dan kekurangan. Metode-metode yang digunakan
antara lain metode difusi, metode pengenceran, metode bioautografi, dan lain-lain. Namun,
perlu diperhatikan dahulu cara preparasi bahan uji (ekstrak) agar terpenuhi syarat pertama
dalam penentuan aktivitas antijamur seperti tersebut sebelumnya. Preparasi sampel uji
(ekstrak) yang bersifat tidak larut air (lipofilik) seperti minyak atsiri atau ekstrak non-polar dapat
dilakukan dengan menggunakan pelarut selain-air atau membuat dispersi air atau emulsi
dengan bahan surfaktan. Pada prinsipnya tidak disyaratkan dispersi yang homogen pada metode
difusi dan pengenceran agar, kecuali pada metode pengenceran cair (dalam tabung). Dispersi air
yang mengandung pendispersi dengan berat molekul (BM) yang tinggi (>100.000) harus
dihindari dalam metode difusi karena bahan tersebut tidak dapat berdifusi ke dalam media agar
1% (Hostettmann, 1991).
6 Amelia Febriani
NPM. 1206179170
 S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal
Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013

V. METODE UJI ANTIMIKROBA

Kegunaan uji antimikroba adalah diperolehnya suatu sistem pengobatan yang efektif dan
efisien. Terdapat macam–macam metode uji antimikroba seperti berikut:

1. Metode Penyebaran/Difusi (Diffusion Methods)

Prinsip metode difusi uji potensi yang berdasarkan pengamatan luas daerah hambatan
pertumbuhan bakteri karena berdifusinya antibakteri dari titik awal pemberian kedaerah
difusi. Metode difusi-agar cakram kertas merupakan teknik yang paling sering digunakan
untuk menentukan kepekaan bahan antimikroba sampai senyawa kemoterapi. Dalam
metode ini, ada beberapa cara yaitu cara Kirby Bauer, cara sumuran dan cara pour plate.
1) Metode Kirby-Bauer
Untuk menentukan aktivitas agen antimikroba. Piringan yang berisi agen antimikroba
diletakkan pada media agar yang telah ditanami mikroorganisme yang akan berdifusi
pada media agar tersebut. Area jernih mengindikasikan adanya hambatan
pertumbuhan mikroorganisme oleh agen antimikroba pada permukaan media agar.

7 Amelia Febriani
NPM. 1206179170
 S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal
Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013

Cara kerja pengujian antimikroba dengan metode Kirby-Bauer :

1. Tanam mikroba dalam media agar padat yang sesuai. Celupkan cotton bud
(cotton swab) dalam biakan bakteri kemudian tekan kapas ke sisi tabung agar
air tiris. Bakteri ditumbuhkan pada media agar miring dan diinkubasi pada
suhu 370C. Kemudian pembuatan suspensi bakteri dengan menumbuhkan
bakteri pada media cair Natrium Klorida fisiologis dan diinkubasi pada suhu
370C

2. Ulaskan pada seluruh permukaan cawan Mueller-Hinton Agar secara merata

Biarkan cawan selama 5 menit.

8 Amelia Febriani
NPM. 1206179170
 S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal
Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013

3. Kertas cakram dicelupkan dalam larutan obat herbal dengan konsentrasi

tertentu. Angkat, biarkan sejenak agar tiris, selanjutnya letakkan kertas cakram
pada permukaan agar. Kertas cakram ditekan menggunakan pinset supaya
menempel sempurna di permukaan agar.

4. Inkubasi pada suhu 36- 37 0C selama 24-48 jam.

9 Amelia Febriani
NPM. 1206179170
 S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal
Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013

5. Aktivitas antimikroba dilihat dengan mengukur daerah di sekitar cakram,

lubang, atau cangkir agar yang tidak ditumbuhi miroba.

6. Ukur diameter zona hambat (mm) dengan jangka sorong, kemudian

bandingkan dengan tabel sensitivitas antibiotik. Makin besar diameter

10 Amelia Febriani
NPM. 1206179170
 S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal
Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013

hambatan pertumbuhan tersebut berarti aktivitas bahan yang diuji (obat

herbal) terhadap mikroba makin baik.

Tabel 1. Tabel Standar Sensitifitas Antibiotik

Faktor yang mempengaruhi metode difusi agar (Kirby-Bauer):
a. Ingredien / komposisi medium pertumbuhan
-Komposisi ingredien yg umum tdp pada komposisi pertumbuhan mo
adalah ; pepton, tripton, ekstrak ragi, agar, dan mineral (Ca, Mg, Fe, NaCl,
KH)
-NaCl mengurangi aktivitas antibiotik gol aminoglikosida dan menahan
aktivitas ferosidin

11 Amelia Febriani
NPM. 1206179170
 S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal
Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013

-KH pada uji difusi dapat mempertinggi aktivitas nitrofurantoin atau

ampisilin

b. Pemilihan medium pertumbuhan

- Pemilihan medium pertumbuhan; dimana diperlukan persiapan medium
yg cocok bagi pertumbuhan mo demikian pula ketebalan dan konstituen
harus merata pada medium agar
- Pengaruh pH terhadap luas daerah hambatan disebabkan oleh aktivitas
antibiotik yg tergantung pada pH medium. Misalnya aktivitas
aminoglikosida diperkuat dalam suasana asam sedangkan tetrasiklin
dalam suasana basa
- Jika dalam melarutkan media ; pH yg tinggi diturunkan dgn
menambahkan HCl 0,1N, pH yg rendah dinaikkan dgn penambahan NaOH
0,1N

c. Pengaruh pH
Perbedaan pH media yang digunakan dapat menyebabkan perbedaan jumlah
zat uji yang berdifusi, pH juga menentukan jumlah molekul zat uji yang
mengion. Selain itu pH berpengaruh terhadap pertumbuhan bakteri.

d. Ukuran inokulum
- Inokulum adalah campuran antara suspensi dan media.
- Luas daerah hambatan akan semakin kecil jika inokulum semakin besar
kandungan mikroorganismenya.
- Suatu inokulum dikatakan ideal apabila kandungan mikroorganismenya
homogen, misal 1-10%

12 Amelia Febriani
NPM. 1206179170
 S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal
Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013

- Apabila pertumbuhan yg rapat, dapat menyebabkan terjadinya

penumpukan pada tempat tertentu

e. Stabilitas mikroba uji

Resistensi mikroba uji terhadap suatu antibiotik dapat terjadi dalam kondisi
pertumbuhan tertentu. Oleh sebab itu regenerasi mikroba perlu dilakukan
secara periodik dan sewaktu-waktu diuji kemurnian dan kepekaannya.
f. Aktivitas antibiotika
Untuk mendapatkan daerah hambatan yang baik pada suatu penetapan,
terlebih dahulu perlu ditentukan kadar hambat minimum (KHM) dari
antibiotik yang diuji. Pengaruh predifusi larutan antibiotik yangg terjadi
sebelum inkubasi harus dihilangkan atau dikurangi dengan cara pengisian
larutan antibiotik ke dalam medium agar
g. Waktu inkubasi
Inkubasi inokulum dilakukan dalam waktu yang optimal, sehingga
keseimbangan antara aktivitas antibiotik dengan daya tumbuh mikroba dapat
menghasilkan daerah hambatan yang baik untuk pengukuran zona bening
yang muncul sebagai daerah penghambatan pertumbuhan mikroba, biasanya
antara 18-24 jam

Metode Kirby-Bauer tidak bisa digunakan untuk mengukur derajat antimikroba suatu
zat sehingga metode ini tidak menjamin diidentifikasinya bahan pembunuh
antimikroba yang efektif untuk terapi (bakterisida atau fungisida). Hal ini disebabkan
adanya perbedaan kecepatan difusi dari senyawa antimikroba yang dipengaruhi berat
molekulnya. Ukuran zona untuk suatu zat dapat dibandingkan dengan standar,
asalkan perbenihan, ukuran inokulum, dan keadaan lain diatur secara seksama. Hal ini

13 Amelia Febriani
NPM. 1206179170
 S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal
Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013

memungkinkan ditetapkannya suatu diameter zona penghambat minimum yang

menunjukkan kepekaan dari suatu zat antimikroba. Pada pengukuran standar seperti
konsentrasi antimikroba berkorelasi dengan diameter zona hambat sehingga bisa
digunakan untuk menentukan tingkat kepekaan, yaitu peka (sensitive, susceptible),
cukup peka (moderately sensitive, intermediate), dan resisten (resistant.) Nilai kadar
hambat minimum (KHM) berbanding terbalik secara proporsional (linear) dengan
diameter zona hambat (Bauer et al., 1966)

2). Metode E- test

Black (2004) mengemukakan adanya versi terbaru metode difusi yang disebut E-test
(Epsilo Test). Pada E-test digunakan strip plastik yang mengandung gradien
konsentrasi antibiotik. Pada strip tercetak nilai konsentrasi yang memungkinkan
secara langsung membaca konsentrasi minimum yang dibutuhkan untuk
menghambat pertumbuhan. Titik dimana mulai terjadi hambatan pertumbuhan
menunjukkan KHM untuk obat herbal yang memliki potensi antibiotik yang diujikan.

Gambar 1. Cawan Petri dan kertas reagan metode E-Test

14 Amelia Febriani
NPM. 1206179170
 S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal
Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013

Jamur yang bertipe koloni ragi atau tidak berfilamen (yeast-like growth, non-mycelial
growth) biasanya ditanam secara usapan atau gores-coret (agar surface streak)
Penanaman jamur berfilamen yang tumbuh tidak merata pada media menggunakan
teknik gores silang

3). Metode Ditch – plate technique

Pada metode ini sampel uji berupa agen antmikroba (obat herbal) yang diletakkan
pada parit yang dibuat dengan cara memotong pada media agar dalam cawan petri
pada bagian tengah secara membujur dan mikroba uji (maksimum 6 macam)
digoreskan kea rah parit yang berisi agen antimikroba

4). Metode Cup – plate technique (Metode sumuran)

Metode ini serupa dengan metode disc diffusion, di mana dibuat sumur pada media
agar yang telah ditanami dengan mikroorganisme dan pada sumur tersebut diberi
agen antimikroba (obat herbal) yang akan diuji

5). Metode Gradient – plate technique

Pada metode ini kosentrasi agen antimikroba pada media agar secara teoritis
bervariasi dari 0 hingga maksimal. Media agar dicairkan dan larutan uji ditambahkan.
Campuran kemudian dituang ke dalam cawan petri dan di letakkan dalam posisi
miring. Nutrisi kedua selanjutnya ditung di atasnya.
Plate diinkubasi selama 24 jam untuk memungkinkan agen antimikroba berdifusi dan
permukaan media mengering. Mikroba uji (maksimal 6 macam) digoreskan pada arah
mulai dari kosentrasi tinggi ke rendah. Hasil diperhitungkan sebagai panjang total
pertumbuhan mikroorganisme maksimum yang mungkin di bandingkan dengan
panjang pertumbuhan hasil goresan

15 Amelia Febriani
NPM. 1206179170
 S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal
Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013

2. Metode Pengenceran/Dilusi (Dilution Methods)

Metode pengenceran/dilusi dapat digunakan untuk menguji beberapa zat antimikroba
secara simultan, tetapi memakan waktu dan mahal. Metode ini memungkinkan
dilakukannya uji kedua untuk menilai daya antimikroba suatu zat . Kegunaan dari metode
dilusi ini adalah untuk mencari KHM (Kadar Hambat Minimum) yaitu kadar obat terendah
yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri. Kadar terkecil yang menunjukkan
hambatan terhadap pertumbuhan bakteri ditandai oleh kejernihan media merupakan
KHM. Data sifat kimia fisika dan data aktivitas antibakteri (KHM) dianalisis secara statistik
dengan uji regresi liner dan non linier .Uji ini mampu dengan tepat mengukur konsentrasi
antimikroba yang diperlukan untuk menghambat pertumbuhan suatu inokulum
terstandarisasi di bawah kondisi yang ditentukan
Metode dilusi dibedakan menjadi dua yaitu dilusi cair (broth dilution) dan dilusi padat
(solid dilution).
1). Metode dilusi cair (broth dilution) test (serial dilution)
Metode ini mengukur MIC (minimum inhibitory concentration atau kadar hambat
minimum, KHM) dan MBC (minimum bactericidal concentration atau kadar bunuh
minimum, KBM).
Cara kerja metode dilusi cair:
1. Buat seri pengenceran agen antimikroba (obat herbal) pada medium cair yang di
tambahkan dengan mikroba uji. Cara pengenceran dilakukan dalam tabung dengan
mengencerkan bahan uji (obat herbal) dengan media cair menjadi kelipatan dua
secara bertahap sehingga didapatkan konsentrasi dengan kelipatan setengahnya
2. Inokulasi dengan suspensi bakteri dan diinkubasi selama 24 jam pada temperatur
36-37oC dan kemudian diamati hambatan pertumbuhan mikroba dengan
membandingkan kekeruhan atau pertumbuhannya dengan kontrol yang
mengandung media.
3. Larutan uji agen antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya
pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai KHM.

16 Amelia Febriani
NPM. 1206179170
 S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal
Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013

4. Larutan yang ditetapkan sebagai KHM tersebut selanjutnya dikultur ulang pada
media cair tanpa penambahan pada mikroba uji ataupun agen antimikroba, dan
diinkubasi selama 18–24 jam.
5. Media cair yang tetap terlihat jernih setelah inkubasi ditetapkan sebagai KBM

2). Metode dilusi padat (solid dilution tes )

Metode ini serupa dengan metode dilusi cair namun menggunakan media padat (solid).
Keuntungan metode ini adalah satu kosentrasi agen antimikroba yang diuji dapat
digunakan untuk menguji beberapa mikroba uji.

Pengujian terhadap jamur menggunakan media cair kurang bagus karena sebagian besar jamur
tidak tumbuh dan terdispersi dengan baik kecuali beberapa jamur dengan pertumbuhan seperti
ragi (yeast-like growth). Jamur yang tumbuh seperti ragi antara lain Candida spp. (Bauer et al.,
1966).

3. Metode Bioautografi (Bioautography Methods) (Hostettmann, 1991)

Metode ini sangat berguna untuk mengetahui senyawa baru atau senyawa yang belum
diketahui aktivitas antimikrobanya. Bioautografi kontak menggunakan prinsip difusi
senyawa yang terpisah dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) atau Kromatografi Kertas (KK).
Lempeng kromatografi ditempatkan pada permukaan agar yang telah diinokulasi dengan
mikroba. Setelah kira-kira 30 menit, lempeng dipindahkan, diinkubasi dan diamati, senyawa
antimikroba akan berdifusi ke dalam lapisan agar dan menghambat pertumbuhan mikroba.
Pada bioautografi langsung, zona hambatan diamati secara langsung pada lempeng
kromatografi yang sebelumnya telah disemprot dengan suatu suspensi mikroba dalam
media agar cair dan diinkubasi pada temperatur dan waktu yang sesuai. Sedangkan metode
bioautografi pencelupan dilakukan dengan mencelupkan lempeng kromatografi ke dalam
media dan media dibiarkan mengeras. Lempeng kromatografi kemudian diinkubasi dan
daerah hambatannya diamati.

17 Amelia Febriani
NPM. 1206179170
 S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal
Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013

4. Metode metode lain

Metode-metode lain yang dapat digunakan terutama untuk menentukan efektivitas

senyawa kemoterapi yaitu:

a. Metode daya bunuh serum (serum killing power method)

Pada metode daya bunuh serum digunakan sampel darah pasien yang sedang
menerima terapi antibiotik. Suspensi mikroba (bakteri) kemudian ditambahkan
pada serum pasien. Pertumbuhan (turbiditas) dalam serum setelah inkubasi
mengartikan bahwa antibiotik yang diberikan tidak efektif.
b. Metode otomatis (automated method).
Metode otomatis menggunakan sistem otomatis (instrumen) yang dapat
mengidentifikasi mikroorganisme dan menentukan kepekaannya terhadap
berbagai senyawa antimikroba.

5. Metode Gores Silang (Uji Antifungi)

Metode gores silang (Cross Scratching Method) merupakan metode baku untuk menguji
aktivitas penghambatan suatu bahan uji terhadap jamur T. mentagrophytes (Anonim,
1993).
Cara kerja metode gores silang:
1. Celupkan kertas saring ke dalam larutan yang diuji lalu diletakkan di atas lempeng
agar yang telah digores dengan inokulum jamur.
2. Media agar kemudian diinkubasi selama 3-7 hari pada 24-25 oC.
3. Pertumbuhan jamur diamati, jarak yang tidak ditumbuhi jamur diukur sebagai zona
hambat.
4. Cara yang sama juga dilakukan pada waktu yang bersamaan untuk antijamur
pembanding.

18 Amelia Febriani
NPM. 1206179170
 S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal
Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013

DAFTAR PUSTAKA

Ultee A, Gorris LGM, Smid EJ. 1998. Bacterial activity of carvacrol toward the food-borne
pathogen Bacillus cereus. J. Appl. Microbiol: 213-218
Corner, DE. 1995. Naturally occuring compounds in Antimicrobial in Food. Eds., by Davidson PM
& Branen AL, Eds. Marcell Dekker, Inc., New York, pp. 441-468.
Palmer, SA., Stewart J., Fyfe, L. 1998. Antimikrobial properties of plant essential oils and
essences againts five important food-borne pathogen. Letters Appl. Microbiol. 26: 118-
122.
Ting, EWT & Deibel, KE. 1992. Sensitivity of Listeria monocytogenes to spices at two
temperature. J. Food Safety 12: 19-137.
Hostettmann K. 1991. Methods in Plant Biochemistry: Assays for Bioactivity v. 6 - Methods in
Plant Biochemistry Vol 6
Bauer AW, Kirby WM, Sherris JC, Turck M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized
single disk method. Am J Clin Pathol. 1966 Apr;45(4):493-6.
Rostinawati T, 2009. Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Bunga Rosella (Hibiscus Sabdariffa L.)
terhadap Escherichia coli, Salmonella typhi dan Staphylococcus aureus dengan Metode
Difusi Agar. Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran , Jatinangor

19 Amelia Febriani
NPM. 1206179170
 S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal
Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013

20 Amelia Febriani
NPM. 1206179170