Hasil penyelidikan replikasi DNA dengan autoradiography dan mikroskop electron

menunjukkan bahwa hasil dua untai yang disintesis pada setiap percabangan replikasi,
mengalami perpanjangan dengan arah yang sama pada level makromolekul. Karena untaian
complementer doble helix memiliki polaritas berlawanan, Sintesis terjadi pada akhir 5’ dalam
satu untai (perpanjangan 3’ 5), dan akhir ujung 3’ untai lain (perpanjangan 5’ 3’). DNA
polimerase memiliki kewajiban dari 3'-hidroxyl bebas hanya membawa sintesis 5’ 3’ (Gambar
1). Ternyata hasil bertentangan dengan asasnya, dalam beberapa tahun penelitian biokimia untuk
polimerase baru bisa mengkatalisis sintesis 3’ 5’. Tetapi penelitian menunjukkan bukti semua
sintesis DNA terjadi dengan arah 5’ 3’. Pertimbangan dan petunjuk lain replikasi DNA lebih
rumit dari pada saat Waston dan Crick mengusulkan mekanisme replikasi semikonservatif
tahun1953.

Gambar 1. Mekanisme kerja DNA polymerase: perpanjangan untai primer DNA dari arah 5’ 3. Akhir rangkaian
yaitu 3’ dengan nucleotide deoxyguanylate (deoxyguanosine-5’-phosphate). Menunjukkan DNA
polymerase-catalyzed dari tambahan deoxythymidine monophosphate dari prekursor deoxythymidine
triphosphate, dTTP untuk ujung rantai 3’ dengan mebebaskan pyrophosphate (P2O7)

Sistesis satu untai terus menerus, untai yang lain sistesis terputus
Dua untai DNA disintesis pada setiap percabangan replikasi yang diperluas dalam
beberapa arah pada level makromolekul. Karena untai dobel helix DNA komplementer memilki
muatan polaritas berlawanan, satu untai deperluas dari arah 5’ 3’ dan untai lain deiperluas dari
arah 3’ 5’(Gambar 2.a). DNA polimerase hanya bisa mengkatalis sintesis dari arah 5’ 3’.
Dimana ketika sintesis satu untai DNA berlangsung, maka sintesis untai yang lain tidak
berlangsung. Pada level molekuler, sintesis untai komplementer terjadi pada arah fisik yang
belawanan (Gambr 2.b). Tetapi kedua untai baru dimulai dari arah 5’ 3’yang disebut leading
strand terus menerus. Permulaan untai dari arah 3’ 5’disebut lagging strand terjadi mekanisme
ketidak berlanjutan, tumbuh oleh sintesis fragmen pendek (disintesis 5’ 3’), dan selanjutnya
berikatan kovalen dengan fragmen pendek. Bukti pertama untuk discontinuous mode replikasi
DNA berasal dari penyelidikan sintesis DNA dengan pelabelan radioaktif pada penumbuhan E.
coli dan T4 dalam medium dengan waktu pendek yang mengandung 3H-thymidine (pulse-
labeling experiments). DNAs kemudian diisolasi, di pisahkan untuk fragmentnya dengan melalui
endapan gradient sukrosa pada saat sentrifugasi berkecepatan tinggi. Ditemukan fragmen
pendek DNA dengan panjang nukleotida antara 1000-2000 (gambar 2.c). pada eukariyot,
fragmen Okazaki hanyalah 100-200 nucleotida panjangnya. hasil eksperiman menunjukkan
bahwa fragmen Okazaki pemula replikasi DNA dan bukan hasil dari metabolik.

( (
b) c)

Gambar 2. Bukti untuk sintesis tidak berlanjut pada lagging strand. (a) meskipun 2 untai mulai mensintesis DNA
pada cabang replikasi tampak perluasan pada arah yang sama, (b) pada level molekuler sintesis terjadi
pada arah yang berlawanan. (c) hasil eksperimen pulse-labelingReiji dan Tuneko Okazaki serta yang
lain menunjukkan permulaan DNA di E. coli ada dalam fragmen pendek dengan pancang nukleotida
antara 1000-2000. Panah merah menunjukkan posisi gradien Fragmen Okazaki.

Kovalen Penutup Dalam Dna Oleh Dna Ligase

Apabila lagging strand DNA tidak melanjutkan sintesis membutuhkan Fragmen Okazaki
untuk menghasilkan untai DNA panjang pada kromosom dewasa. Mekanisme tersebut
membutuhkan DNA ligase. DNA ligase dikatalisis covalent closure of nicks dalam molekul
DNA dengan menggunakan energi dari NAD atau ATP. DNA ligase E. coli menggunakan NAD
sebagai kofaktor, tetapi beberapa DNA ligase menggunakan ATP. Reaksi katalisis ditunjukkan
pada gambar 3. Pertama AMP ligase membentuk ikatan phosphoester dengan 5’-phosphate pada
nick, dan kemudian nucleophilic ditarik oleh 3’-OH pada nick dalam atom DNA-proximal
phosphorus menghasilkan ikatan phosphodiester antara nukleotida yang berdekatan pada tempat
nick. DNA ligase sendiri tidak memiliki aktivitas memutuskan DNA dimana satu atau lebih
nukleotida hilang disebut gap. gap akan hilang disegel oleh kombinasi aksi DNA polimerase dan
DNA ligase. DNA ligase tidak hanya berperan dalam replikasi tapi juga dalam perbaikan dan
rekombinasi.

Gambar 3. DNA ligase mengkatalisis covalent closure of nicks pada DNA. Energi dibutuhkan untuk membentuk
ester linkage disediakan oleh ATP atau NAD tergantung spesies.

Inisiasi Replikasi DNA

Replikasi kromosom E. coli dimulai dari oriC, sequence khusus yang memulai replikasi
dengan bentukan wilayah pemisah untai disebut gelembung replikasi, yang dibentuk oleh
interaksi prepriming proteins dan oriC (Gambar 4). Langkah pertama tampak prepriming
berikatan dengan 4 molekul gen dnaA, DnaA protein untuk empat 9-base-pair (bp) pengulangan
dalam oriC. Selanjutnya DnaA protein berikatan untuk membentuk inti Proline 20-40 dengan
oriC DNA ditemukan pada permukaan protein complex. Pemisahan untai dimulai dalam 3
tendem 13-bp pengulangan dalam oriC disebar sampai gelembung replikasi terbentuk. Complex
protein DnaB (hexameric DNA helicase) dan protein DnaC (6 molekul) bergabung dengan
complex penyisipan dan berkontribusi untuk membentuk dua bidirectional percabangan
replikasi. DnaT protein juga hadir dalam prepriming protein complex, tetapi fungsinya tidak
diketahui. Protein lainnya yang terkait dengan inisiasi kompleks oriC yang DnaJ protein, DnaK
protein, PriA protein, PriB protein, PriC protein, Mengikat DNA protein HU, DNA gyrase, dan
DNAbinding tunggal-strand Protein (SSB). DnaA protein tampak bertanggung jawab besar
untuk tempat pemisahan untai oriC selama proses inisiasi.

Gambar 4. Prepriming pada replikasi DNA dalam oriC di kromosom E. Coli

Inisiasi Rantai DNA Dengan RNA primer

Polimerase DNA tidak diketahui dapat memulai sintesis Baru untai DNA. Dengan
demikian, beberapa mekanisme khusus harus ada untuk memulai atau Perdana sintesis baru
DNA rantai sekali replikasi gelembung telah terbentuk. RNA polimerase, kompleks enzim yang
mengkatalisis sintesis RNA molekul dari template DNA, telah lama dikenal mampu memulai
sintesis rantai RNA baru di situs tertentu dalam DNA. Ketika ini terjadi, hibrida RNA DNA
terbentuk di mana RNA baru lahir hidrogen yang terikat ke DNA template. Karena DNA
polymerases mampu memperluas rantai DNA atau RNA yang mengandung 3-OH bebas,
ilmuwan mulai menguji gagasan bahwa DNA sintesis mungkin diprakarsai oleh menggunakan
RNA primers.

Pada E. coli DNA primase dihasilkan oleh gen dnaG. Pada prokariot, RNA primer berjumlah
antara 10 sampai 60 nukleotida panjang, sedangkan pada eukariot memiliki rantai lebih pendek,
hanya sekitar 10 nukleotida panjang. RNA primer memiliki ujung rantai 3' - OHS bebas yang
diperlukan untuk perpanjangan rantai polinukleotida. Pada E. coli, enzim yang mengkatalisis
replikasi kromosom semikonservatif adalah polimerase yang disebut DNA polymerase III. DNA
polimerase III mengkatalisis penambahan deoksiribonukleotida untuk RNA primer pada untai
awal (leading strand) atau terputus oleh sintesis fragmen Okazaki pada untai selanjutnya
(leaging strand) yang bersifat semikontinyu. DNA polymerase III berakhir pada fragmen
Okazaki ketika menabrak RNA primer dari fragmen Okazaki sebelumnya.

Gambar 5. The initiation of DNA strands with RNA primers

RNA Primer selanjutnya akan dipotong dan diganti dengan rantai DNA. Pada E. coli Langkah ini
dilakukan oleh DNA polimerase I, memiliki aktivitas dan peran utama memastikan keakuratan
relikasi melalui repair dari kerusakan dan mismatch DNA (ketidaksesuaian DNA). Selain 5 ' → 3
' aktivitas polymerase, DNA polimerase I memiliki 2 aktivitas exo nuklease: 5 → 3 exonuclease
aktivitas, yang memotong kembali DNA buah mulai 5’, dan 3 → 5 exonuclease aktivitas, yang
bersatu off nukleotida dari 3’ untai DNA. Oleh karena itu , DNA polimerase I memiliki 3
aktivitas enzim yang berbeda, dan ketiga kegiatan memainkan peran penting dalam replikasi
kromosom E. Coli.

Kegiatan 5 ' → 3 ' exonuclease dari DNA polimerase I memotong RNA primer, dan pada
saat yang sama, aktivitas enzim polimerase 5' → 3' menggantikan RNA dengan rantai DNA
dengan menggunakan fragmen Okazaki yang berdekatan dengan ujung 3' - OH bebas sebagai
primer. Berdasarkan mekanisme ini penggantian primer, E. coli mutan PolA yang tidak memiliki
aktivitas exonuclease 5 ' → 3', DNA polimerase I rusak pada kemampuan eksisi RNA primer
dan bergabung dengan fragmen Okazaki. Setelah DNA polimerase I telah menggantikan RNA
primer dengan rantai DNA , 3' - OH dari satu fragmen Okazaki sebelah gugus 5' - fosfat dari
fragmen Okazaki sebelumnya. Produk ini merupakan substrat yang sesuai untuk ligase DNA,
yang mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara fragmen Okazaki yang berdekatan
(gambar 6).

Gambar 7. Sintesis & penggantian replikasi RNA primer dari lagging strand DNA
DNA Unwinding dengan Helicase, Dna-Mengikat Protein, dan Topoisomerase

Replikasi semikonservatif memerlukan dua untai molekul DNA template dipisahkan

selama sintesis untai komplementer baru. Pemisahan rantai heliks ganda DNA dalam replikasi
membutuhkan mekanisme unwinding (membuka), memberikan giliran untuk setiap panjang 10
pasang nukleotida dari sebuah molekul DNA harus berputar 360 kali setiap melakukan replikasi
untuk setiap 10 pasang nukleotida. Proses pembukaan rantai DNA double helix melibatkan
enzim yang disebut DNA helikase. Prinsip replikasi DNA helikase utama dalam E. coli
merupakan produk dari gen dnaB. DNA helikase membuka molekul DNA menggunakan energi
yang berasal dari ATP. Untai DNA tunggal hasil pemisahan oleh helikase selanjutnya
diselubungi oleh protein pengikat untai tunggal atau single-stranded binding protein (SSB) untuk
melindungi DNA untai tunggal dari kerusakan fisik dan mencegah renaturasi.