Molecular Cloning of the Phospholipase D Gene from Streptomyces sp.

YU100
and Its Expression in Escherichia coli

Ji-Seon Lee, Munkhtsetseg Bat-Ochir, Atanas V. Demirev, and Doo Hyun Nam

Phospholipase D (PLD) adalah enzim yang mengkatalis dua reaksi yaitu:

- Hidrolisis lesitin (phosphatidylcholine,PC) menjadi phosphatidic acid dan choline
- Transphosphatidilasi dari lestitin menjadi fungsional fosfolipid dengan mengkonversi gugus polar dengan
serine, ethanolamine attau gliserol

Sumber : https://www.uniprot.org/uniprot/Q8KRU5
https://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?ec:3.1.4.4

Enzim PLD pada industri:

Produksi fungsional fosfolipid meliputi fosfatidilserin (PS), fosfattidiletanolamine, dan fosfattidilinositol
dari lesitin, produk samping dari produksi minyak kedelai.

Fungsi pada manusia:

Meningkatkan daya ingat pada manusia, meningkatkan mood karena factor stress akibat adanya
perubahan structural dan fungsional pada komposisi lipid di membrane neuron pada otak manusia.
Sehingga dapat digunakan pada pasien penderita Alzheimer, Parkinson, dementia, epilepsy, dan depresi
pada lansia.

Oleh karena itu, PLD berpotensi untuk dikembangkan. Streptomyces menghasilkan PLD dengan aktivitas
yang tinggi (transphosphatidylation) dibandingkan organisme lainnya.

PLD homolog:
S. antibioticus, S. cinnamoneus, S. halstedii. S. septatus, Streptomyces sp. strain PMF

Tujuan penelitian:
Streptomyces sp. YU100 telah diisolasi dari tanah Korea dan telah dibuktikan memiliki aktivitas PLD yang
tinggi. PLD gen dari Streptomyces sp. YU100 akan dikloning dan diekspresikan pada E. coli BL21(DE3).

Kloning ke bacteriofage Kloning propagasi Subkloning ekspresi

Gen target PLD Streptomyces sp. PLD Streptomyces sp. PLD Streptomyces sp. YU100
YU100 YU100
Vektor T&A pGEM_32f pET_32b
Inang E. coli ER1647 E. coli JM109 E. coli BL21 (DE3)
Medium Luria Bertani Luria Bertani Luria Bertani
pertumbuhan + amp + amp + amp
 + IPTG

Alur penelitian

Sumber : https://www.snapgene.com/resources/plasmid-
files/?set=ta_and_gc_cloning_vectors&plasmid=RBC_T%26A_Cloning_Vector_(linearized)

Sumber : http://si.secda.info/yb_md/?page_id=1949

Vektor T&A mengandung promotor bacteriophage T7 yang dapat menghasilkan ekspresi yang tinggi.
Mengandung yT4 DNA ligase yang dapat menyambungkan antara sekuens yeast dengan vektor.
Dapat digunakan pada PCR dengan thermostable YEAtag DNA polymerase. Ampicilin untuk seleksi
antibiotiknya. Dan mengandung C-terminal 6x His-tag untuk deteksi dan purifikasi. Mengandung
MCS, diantaranya adalah BamHI, NotI, dan SacII.
Serta dapat ditransformasi pada E. coli.

PLD pada Streptomyces memiliki 3686 bp. Karena ukurannya yang besar, maka dibuat primer
sintetiknya menggunakan 440 bp dan menggunakan menggunakan λ-bluestar (bacteriophage T&A).
serta menjadikannya probe. Setelah di transfeksi ke E. coli ER1647 selanjutnya di konfirmasi dengan
Re-PCR (southern hibidisasi menggunakan PLD probe) menggunakan enzim restriksi BamHI, NotI dan
SacII. λ-bluestar (bacteriofage) berat molekulnya kisaran 7-2,5kb.

Hasil hibridisasi dengan southern blot menunjukkan hanya band yang terikat dengan PLD probe (a
positive phage plaque), yang tidak terikat akan luruh.
Hasil restriksi dengan BamHI : 3,8 kb selanjutnya dipurifikasi dan disubkoning ke pGEM_32 untuk
propagasi dan analisa sekuens.
Kloning Propagasi
Sumber : https://worldwide.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-
bulletins/0/pgem-3zf-vector-protocol-2.pdf?la=en
The pGEM®-3Zf(+) Vector mengandung origin of replication (ori) filamentous phage f1 (untuk
reproduksi). The pGEM®-3Zf(+) Vector mengandung promotor SP6 dan T7 RNA polymerase, multiple
cloning region diantaranya adalah BamHI, dan α-peptide coding region of β-galactosidase.
Cocok digunakan untuk induksi ssDNA, dan transformasi pada bakteri dengan F´ episome (misal
JM109, XL-1 Blue, DH5α™) dengan bantuan helper phage.
PCR Primer
PLD-F; 5’-AAGGA CGACTAC CTCGACAC-3’
PLD-R; 5’-TTGTTGG AGATCTG GATGTG-3’

Hasil analisa Sekuens = 3686 bp (FASTA pada Blast )

>EU369918.1 Streptomyces sp. YU100 phospholipase D gene, complete cds
GGATCCTTCCGGGTCTTCGATGTCTCCATCAAACCCGGGGCGGTTCACTCACGGCGTTCGATCTCGACCG
GTCCGGACCGGGACAGCCATTGCTGCTGCGGTTCCGATCGGCGAGCGATCAGCCGCGACCGCTTGATCTT
CACGATCGGGTGACATGCGAACTTCGAGGCTAGTTCGCGCGTTCACACGGCACGCAATCTGGCCAGCCAG
CAGCGGCAGATCAGCCAAAAGTCCGCCAAGCGGCCTGCCTGAATAGGGCCGCAAACGGAACTCATCGGGT
GACATTCGCATGGAAGGCTGGCCCCCGGTTCCTAAGCCCGGCGGGGGTCTGAACGCTCGTGCCANGAGAA
CAGGCGCGGTAGTTCAGTGTCNATTCCCCGCCGAGTTCGAANATCAGAACGCGTCATGTCCCCGCCCCGC
ACGTTCCTATGTTGCCCCCTGATCAAACTAGGGCAAGCGGGCACATCTGCAGGACGGAGTTATCCATGAA
GCTCTCNAAGACGCTGGCNATGACGGCAGTGATGCTGGTGCTCGGTGCGGCCGCAGGACCCGCGTACGCA
GCGACGTCGGCATCGCAGACGCCCTCNCTCACGGCCCGTTCCTCGTCCCTCTCTCCGTTCAATGTCCTGA
TCGAGCAGTCCGACAACGGGAAGACCATCAGGATACCCAGAGGGACCGGTGTCTTCCTCAACCTGAAATC
CGCATCAGGATACCCAGAGGGACCGGTGTCTTCCTCAACCTGAAATCCGATGGCCGGCTCGGCCGCTGGA
GCATCCCCACCGCTTCGGACGCCGCGGTCCTGCGTCTGACCGGCAGTACTCTTGACTCGGACGGCTACAT
GCGGACGTACTTCGATTCCGGGGTACCGGGGACAAGCACGATCAAGGCCGTCGAAAGCTTCAGCCCGTCC
ATGGCCATCGTGCCTTTCGAGGTCACCATCGTCGTCGGTGCCTGATCCTCATACTCCTGCCCCGTACCAC
AGCCGGACTTGGGCGTTCCTCCGGGGCTACTGCGGCAGTCGAAGGCTCAACCGCCTGACTGCACACCGGA
AACGGCTGGCTGTGCATTGCCGACCAGCGCCGGGGCCGCTGCCTTCCACGCCTCGGACGGCGGTTGGCTG
ACGTCGTCCACGGAAGTCCGGCTGTACCGGAATGAGCCGGCAGCTTCCGCGAGTTGGTCTTGCCGGTCGC
CCGGACTGGGCGGCCCGCGTAACCTCCGAAAAGGAATCCCGAATTGGCTCGTCACCCGCGCAAGCGCCGG
TCCGCTCTCGTCCCGCGCACCGCTGTCCCCGCCCTCGTGGCCGTCCTGCTGCCCGTGGCCCCCGCATCGG
CGGACACGGGGGCCACCCCGGCCACCCCGCATCTGGACGCCGTCGAGCAGACGCTCCGTCAGGTCTCGCC
GGGCCTCGAAGGGCGGGTATGGGAACGCACCGCGGGAAACACCCTCGACGCATCGACACCAGGCGGCGCC
GACTGGCTGCTCCAGACTCCTGGGTGCTGGGGTGACGCCACCTGCGCCGACCGGCCTGGAACCCGGCAGC
TCCTCGTCAAGATGACGGAGAACGTCTCCCGAGCCACCGAAAGCGTCGACATATCAACCCTGGCCCCGTT
CCCCAACGGAGCCTTCCAGGACGCCGTGGTGAGCGGCCTCAAGGCTTCCGTCGCGTCCGGCCACCAGCCC
AAGGTGCGCATCCTGGTGGGCGCCGCACCGATCTACCATCTCAACGTCGTGCCGTCGAAGTACCGCGACG
AACTCGTCGAGAAGCTGGGCAAGGACGCCGCGAAGGTCACCTTGAACGTCGCCTCGATGACGACCTCGAA
GACCGCGTTCTCCTGGAACCACTCCAAACTCCTCGTGGTCGACGGCCGTTCGGCCATCACCGGCGGCATC
AACGGCTGGAAGGACGACTACCTCGACACCACCCACCCGGTCAGCGATGTCGACCTGGCCCTGAGCGGTC
CGGCCGCCGCCTCGGCCGGCAAGTACCTGAACGAGCTGTGGTCCTGGACCTGCCGGAACAAGAACAACAT
CGCCAGTGTCTGGTTCGCCTCCTCCAACGGCGCAGGCTGCATGCCGACCCTGGAACCGGCGGCCTCGGCC
GAGGCGCCCCGGGGCGATGTGCCGGTGATCGCCGTCGGCGGGCTCGGCGTCGGCATCCAACGCGACGATC
CCGCCTCGCGGTTCCGCCCCACGCTGCCCACCGCGCCGGACACGAAGTGTGTCGTCGCACTGCACGACAA
CACCAACGCCGACCGCGACTACGACACGGTCAACCCGGAGGAGAGCGCACTGCGGGCACTGATCTCCAGC
GCGGACCGGCACATCGAGATCTCCCAGCAGGACCTCAACGCGACCTGCCCGCCACTGCCGCGGTACGACA
TCCGCGTGTACGACGCCCTCGCCGCCAAGATGGCCGCCGGTGTCAAGGTCCGCATCGTCGTCAGCGACCC
CGCCAACCGCGGTGCCGTCGGCAGCGGCGGATACTCGCAGATCAAGTCCCTAACCGAGATCAGCGACACC
CTCCGTGACCGGCTCGCCCTGCGCACCGGCGACCAGGCATCGGCGCGGACCGCGATGTGCTCGAACCTCC
AACTGGCGACGGCACGGAGCTCGACGAGCCCGAAGTGGGCCGACGAACACCCCTATGCCCAGCACCACAA
GCTGATCTCCGTGGACGGCTCGGCGTTCTACATCGGATCGAAGAACCTCTACCCCGCCTGGCTCCAGGAC
TTCGGATACGTGGTCGAGAGCCCCGCGGCCGCCAAGCAGCTCGACACCCACCTCCTGGCGCCCCAGTGGC
AGTTCTCGCGCGACACCGCAACCGTCGACTACGAACGCGGAATCTGCCAGGACTGACAGTGATGATTGCT
GTGGCTCCGCCCGGGGACCTGACTCCAGGACTGAGGGTCTATCATGAATTAGGTGTGGTTCGTCTGTTTG
GCCTACAGGTTTTTTGTTGAGCTGTCCGGCCTATACCTGATTGGCGGTAAGGCGGCCGTCGAAGAGGACG
TCGAATTCGTTCAGGGCCGCCTTCCATCGGTTGTTCCAGCGCCGGCGGCCGCGGCCGGTGGGGTCGAGGG
CGAGGGTGGCGAGATGGAGCCGCTTGAGGGCCGCGGTCTCGTTCGGGAAATGCCCGCAGGCCTGCGCTGC
GCGCCGGTAGCGCGCGTTAAGGCTCTCGATCGCGTTGGTCGTGTAGACGACCTGGCGGATGGCCGGCGGC
AGGGAGAGGAACGGGACGAACTCGTTCCAGGCCCTTTCCCGGACCGCGCTGACCGAGGGACACCGGCTGT
CCCATTTCTCGCTGAATTCCGTGAGCCGGCACCGGGCCTGGGATTCATCGGCCGCGGTGTAAACAGGCTT
GAGGTCCCGGGAGATTTCCGCGGCGTCACGCCGTGAGGCGTAGCGCATGCTGCTGCGGATCAGGTGGACC
ACACACGTCTGCACGACGGTCTGGGGCCAGATTGAATTCACCGCCTCCGGCAGTGCGGTCAGGCCGTCAC
ACACGAGCATGAGGACGTCTTTCACGCCGCGGTTGCGGATTTCCGTCAGGACACTCTGCCAGTACGTGGC
GCCCTCGCCGCCCTGTCCGGTCCACAGTCCGAGGATTTCCCGGTAGCCGTAACGCGGTGACCGCGATCGC
CACATGGACCGGCCGGTTGGCCACCTGCCCTCCCGATCCCCGACAT

Sumber : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/EU369918.1?report=fasta
Hasil multiple alignment (asam amino) dengan Clustal W
Makin besar presentase homologinya menunjukkan makin mirip susunan asam aminonyapaling
homolog dengan S. septatus.
PLD superfamily mengandung satu atau dua salinan conserved HxKxxxxD (HKD) motif, yang bertujuan
untuk memediasi katalisis. Motif tersebut terdapat pada sekeliling sequence yang juga terdapat pada
sekuens PLD homolog. Meliputi enzim pensintesa phospholipid yaitu cardiolipin synthase dan
phosphatidylserine synthase. Pada hasil cloning ini ditemukan motif tersebut.

PLD merupakan ekstraselular, sinyal peptide dianalisa dengan SignalP 3.0 menunjukkan adanya
tunnel membrane sekresi di 33rd dan 34th amino acids (ASA-DT). Keragaman asam amino pada N
termibal tergantung pada pengenalan pada membrane sekresi. PLD terdiri dari 507 asam amino
dengan berat molecular 54 kDa dan pI 5.8.

Amplifikasi untuk ekspresi PLD

forward primers PLD-S; 5’-CCGCATCCATGGACACGGGGGCCACCCCGGC-3’
having NcoI site
Reverse primer PLD-A; 5’-CAATCACTCGAGGTCCTGGCAGATTCCGCGTT-3’
having XhoI site.
Hasil amplifikasi di cloning ke pET_32b

Sumber : https://www.snapgene.com/resources/plasmid-
files/?set=pet_and_duet_vectors_(novagen)&plasmid=pET-32b(%2B)
pET_32b(+) :
T7 expression system yang merupakan system yang dirancang untuk ekspresi cloning dari hasil rekombinan
protein pada E. coli. T7 promoter akan tidak dikenali oleh E. coli RNA polymerase. sehingga protein rekombinan
tidak didegradasi sehingga menghasilkan ekspresi sebanyak mungkin.
Penambahan IPTG untuk menginduksi DNA polymerase yang digunakan agar dapat menghasilkan protein yield
yang lebih tinggi, dan akan menstabilkan ekspresi pada saat template amplifikasi yang panjang.
Mengandung MCS diantaranya NcoI dan XhoI.
NcoI mengandung ATG start codon.
E. coli BL21 (DE3)
Merupakan host yang dikembangkan untuk over ekspresi. Ekspreksi (protein yields) akan meningkat dengan
mensuplai asam amino pada kultur medium atau dengan mensisipi rare codon-tRNA. Rare codons tRNA akan
disisipi pada vector ekspresi atau pada plasmid. tRNA juga akan membantu menghindari codon bias pada E. coli
dan meningkatkan ekspresi protein heterolog. Contohnya adalah peningkatan argU atau dnaY, yang dikode
argU tRNA, yang mengenali situs kodon AGG/AGA, yang berfungsi pada expression yield, plasmid stability dan
cell viability.
E. coli dapat bereplikasi dengan cepat dan jumlahnya banyak (generation timenya kecil)
Hasil elektroforesis Re-PCR dengan enzim restriksi NcoI, NcoI+XhoI, dan BgIII

Hasil restriksi dengan NcoI + XhoI (lane 4) menunjukkan berat yang sama dengan marker PLD (lane 2).
Selanjutnya gen dipurifikasi dan ditambahkan His-tag untuk afinitas kromatografi dengan kolom Ni-
NTA.

Penggunaan his-tag menunjukkan hasil yang lebih jelas pada western blot hibridisasi. Western blot
memungkinkan elektroforesis dengan pengikatan His-tag pada gel elektroforesis yang digunakan. dan
saat di basuh dengan buffer, bagian yang tidak terikat dengan his-tag/Ni atau IMIDA akan luruh.
IPTG merupakan induksi yang bertujuan untuk meningkatkan ekspresi gen.

Hasil pemecahan sel selanjutnya dianalisa dengan afinitas kromatografi Ni.

Metodenya berdasarkan interaksi antara gugus samping asam amino (khususnya histidin) pada permukaan
protein (polyhistidine domains sebagai fusi untuk purifikasi protein) dengan ion logam yang diimobilisasi, atau
immobilized metalion affinity chromatography (IMAC).
Protein dengan histidin tag dapat dipisahkan pada agarose beads yang mengandung iminodiacetic acid (IDA)
ligands (metal chelating groups) charged dengan divalent metal ions. Histidin akan berikatan dengan IDA-
immobilized metal ions, seperti nickel, cobalt and copper. Penelitian Dabrowsky et al. (1999) menunjukkan
bahwa His tagged SSB protein dapat disintesis secara overexpression oleh E. coli dan hasilnya dapat dipurifikasi
menggunakan Ni21-TED–Sepharose single-step chromatography. His-tagged SSB protein juga dapat
meningkatkan efesiensi amplifikasi pada template yang beragam.
Kromatgram yang mengandung immidazole akan berikatan dengan His tag pada plasmid, lalu dilakukan
pembasuhan dengan buffer. Saat komponen lain selain yang berikatan dengan Histag telah turun, maka
selanjutnya dibasuh dengan immidazole yang kepekatannya melebihi immidazol di kromatogram, sehingga
plasmid akan turun. Pada kolom tersebut menunjukkan bahwa diperlukan 150 mM imidazole untuk
meluruhkan gen pET_PLD.
Aktivitas enzim
Analisa Transphosphatidylation activity dilakukan dengan
PLD + PC + L-serine diinkubasi 35 C selama 24 jam dan dianalisa dengan HPLC (deteksi UV 205 nm)
Hasil Transphosphatidylation activity yaitu PS pada retention time 20 menit.
a phosphatidylcholine (PC) + H2O = choline + a phosphatidate (PS)
Analisa hydrolitic activity bedasarkan choline yang dihasilkan
a phosphatidylcholine (PC) + H2O = choline + a phosphatidate (PS)
Kinetika enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu konsentrasi enzim, suhu, pH, dan waktu.
Pada grafik A, membandingkan PLD hasil rekombinan dengan wild type, bedasarkan konsentrasi
enzim yang digunakan. Hasil menunjukkan bahwa rekombinan PLD berhasil, dengan konsentrasi yang
sama dengan wild typenya menghasilkan performa aktivitas yang sama.
Pada grafik B, dengan konsentrasi 30 mikrogram / ml, menghasilkan peak aktivitas pada menit ke 70,
sama dengan wild type nya.

Kesimpulan:
Rekombinasi PLD pada E. coli BL21 (DE3) berhasil mengekspresikan PLD yang menyerupai dengan
wild typenya.