LAPORAN PRAKTIKUM

ISOLASI PLASMID

Kelompok 3

Fadhiilatul Khairiyah (G34170015)

Dwi Ayu Octaviani (G34170030)

Inggit Wijayanti (G34170072)

Raka Adhitya (G34170083)

Jassuanto (G34170104)

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2019
 PENDAHULUAN

Plasmid merupakan molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di

luar kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri
(Indradewi 2007). Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya
tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup bakteri, tetapi
plasmid sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap
antibiotik. Plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen
tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang dalam rekayasa genetika.
Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan produk komersial
tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim (Kelanit et al. 2016).
Plasmid merupakan vektor yang digunakan untuk kloning gen, sehingga
plasmid harus dipisahkan dari DNA kromosom. Isolasi DNA plasmid
merupakan salah satu contoh dari teknik biologi molekuler (Pangastuti et al.
2002). Salah satu fungsi dari isolasi plasmid adalah untuk memisahkan
plasmid dari DNA kromosomal sehingga didapat plasmid yang murni. Plasmid
mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom, untuk
memisahkan plasmid diperlukan perlakuan yang sedikit berbeda dengan
prosedur isolasi DNA. Isolasi plasmid juga dilakukan untuk mengetahui
karakteristik dari beberapa bakteri (Stanfield, 1996). Isolasi plasmid memiliki
banyak manfaat atau aplikasi praktis yang menjadikannya penting untuk
dilakukan, diantaranya adalah untuk tujuan pemuliaan, evolusi, sistemik
maupun konservasi (Watson et al. 2008). Praktikum ini bertujuan mengetahui
dan dapat menghitung konsentrasi DNA/RNA, serta dapat menganalisa
kualitas DNA/RNA.
 METODE

a. Isolasi Plasmid
Sebanyak 1.5 mL Supernatan yang Suspensi
kultur Escherichia coli diperoleh dipisahkan ditambahkan 200
dipipet ke dalam tube dengan pelet. Pelet yang µL sol II dan
dan disentrifugasi terdiri dari endapan dibolak balik
dengan kecepatan bakteri kemudian kurang lebih 10x,
4000 rpm selama 5 disuspensikan dengan sol dibiarkan selama
menit. I. 5 menit.

Supernatan yang Suspensi

Sampel disentrifugasi
terbentuk dimasukkan ke ditambahkan 150
dengan kecepatan
dalam tube baru dan µL sol III, di
10000 rpm selama 10
ditambahkan PCI homogenkan, dan
menit dengan suhu
sebanyak 1 kali volume dibiarkan 10 menit
4°C.
supernatan. di dalam coolbox.

Supernatan kembali
Tube disentrifugasi disentrifugasi pada Selanjutnya
kembali dengan kecepatan 10000 rpm ditambahkan enzim
kecepatan 10000 rpm selama 15 menit RNAse, diinkubasi
selama 10 menit, lalu dengan suhu 4ºC, pada suhu 37ºC
ditambahkan EtOH dikeringkan dengan selama 10 menit
100% sebanyak 2 kali vacuum dryer, dan disimpan
volume dan difreezer ditambahkan 20 µL dalam freezer
selama 5 menit. sampai 50 µL dH2O overnight.
selama 30 menit.
b. Uji kualifikasi elektroforesis
Buffer TAE 1 dituang
Sisir pada alat Gel agarose ditempatkan
hingga mencapai
elektroforesis. hingga sisir terletak pada
tinggi 1 mm di atas
kutub (-).
gel.

Suspensi DNA 5 ml + ETBr di tambahkan

Sisir pencetak loading dye 1 μL, sebagai pewarna
sumur diambil. sebelum di elektroforesis. DNA.
.dengan hati-hati
Sumber arus
DNA yang telah Alat elektroforesis di disesuaikan dengan
tercampur dimasukkan hubungkan dengan besar DNA serta
ke dalam mikropipet. sumber arus. larutan penyangga
yang digunakan.

Arus listrik dimatikan

setelah bromofenol Gel diambil lalu DNA yang bermigrasi
biru mencapai ujung dibersihkan. diperiksa dengan sinar
gel. UV.

Hasil elektroforesis diamati

dan didokumentasikan.

c. Uji kuantitatif
Sampel DNA Sampel di letakkan
Sampel diambil sebanyak
disuspensikan pada lubang
0.5 μL menggunakan
menggunakan Nanophotometer
mikroliter.
mikropipet. secara perlahan.

Hasil Nanophotometer dapat

Tutup, kemudian
dilihat pada layar dan
tekan tombol on.
menunjukan konsentrasi DNA.
d. Pembuatan agarose
Larutan
konsentrasi agarose Agarose yang telah dipanaskan dalam
tergantung dari ditimbang dimasukkan ke microwave sampai
ukuran fragmen DNA. dalam erlenmeyer dan isi mendidih dan
Plasmid memiliki dengan sejumlah larutan larutkan agarose
ukuran 1-300 kb. 1x buffer TAE. kira-kira sampai
60° C.

larutan dituang kedalam cetakan dan pasang sisir,

tunggu kurang lebih dai 30 menit atau sampai gel
mengeras, lepaskan sisir secara perlahan-lahan dan gel
agarosa siap digunakan.

HASIL

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Gambar 1 Hasil elektroforesis isolasi plasmid setiap kelompok. Sumur 1:

Lambda 1 µm, 2: Lambda 2 µm, 3: Kelompok 1, 4 : Kelompok 2, 5:
Kelompok 3, 6 : Kelompok 4, 7 : Kelompok 5, 8: Kelompok 6, 9:
Kelompok 7, 10: Kelompok 8, 11: Kelompok 9, 12: Kelompok 10
Tabel 1 hasil uji kuantifikasi DNA plasmid
Nomor Λ 260 Λ 280 Konsentrasi Kemurnian
Kelompok
1 40.81 6.003 2040.604 6.79
2 42.254 18.914 2112.706 2.23
3 6.975 8.213 348.794 0.84
4 39.914 - 0.625 1995.729 -63.86
5 41.475 6.418 2034.885 6.46
6 41.475 10.416 2073.770 3.40
7 41.118 5.294 2055.936 7.70
8 19.223 2.999 961.172 6.40
9 40.514 4.226 2025.740 9.50
10 40.209 - 0. 319 2010.491 - 126.04

PEMBAHASAN

Salah satu faktor keberhasilan proses kloning adalah konsentrasi dan

kemurnian plasmid yang diperoleh dari hasil isolasi. Penentuan konsentrasi
plasmid diukur pada panjang gelombang 260 nm, sedangkan kemurnian
plasmid ditentukan dengan membandingkan serapan pada panjang
gelombang 260/280 nm. Berdasarkan gambar hasil elektroforesis, sumur 1
merupakan lamda 1 µL dengan panjang gelombang 260 dan sumur 2
merupakan lamda 3 µL dengan panjang gelombang 280. Hasil elektrofesis
isolasi plasmid gen α pada gambar 1 sumur ke-3 menunjukan hasil pita
plasmid yang tidak jelas. Hal tersebut menunjukan pada plasmid yang
diisolasi masih terdapat kontaminan berupa protein atau bahan lainnya.
Menurut Khusnuryani et al. (2016) bahwa hasil pita yang tipis pada
elektroforesis dapat dipengaruhi banyak faktor, diantaranya adalah
konsentrasi DNA yang digunakan pada elektroforesis, kualitas pewarna DNA,
serta buffer yang digunakan sebagai fase geraknya elektroforesis.
Secara kuantitatif hasil uji nanophotometer pada tabel 1 menunjukan
konsentrasi DNA pada plasmid sumur ke-3 sebesar 348,794 ng/µL. Nilai
konsentrasi DNA dalam plasmid yang kecil menyebabkan pita hasil
elektroforesis tidak jelas terlihat. Kemurnian DNA plasmid pada sumur ke-3
memiliki rasio sebesar 0.84, hal tersebut menunjukan DNA yang diisolasi dari
plasmid tidak murni karena berada di bawah rentang rasio 1,8-2,0. Menurut
Hardiyanto et al. (2015), hasil isolasi DNA dikatakan murni jika nilai rasio
panjang gelombang 260/280 nm adalah 1,8-2,0. Jika nilai rasio A 260/280 nm
kurang dari 1,8 maka isolat DNA yang dihasilkan masih mengandung
kontaminan berupa fenol dan pelarut yang digunakan dalam proses isolasi
plasmid, sedangkan jika nilai rasio A 260/280 nm lebih dari 2,0 maka isolat
DNA yang dihasilkan masih mengandung kontaminan berupa protein dan
senyawa lainnya.

SIMPULAN

Uji kualitatif Isolasi plasmid dapat dilakukan dengan menggunakan

elektroforesis dan uji kuantitatif isolasi plasmid dapat dilakukan menggunakan
nanophotometer. Uji kuantitafif isolasi plasmid menggunakan
nanophotometer menunjukan hasil kemurnian yang tinggi dan menandakan
bahwa DNA yang diisolasi dari plasmid tidak murni karena berada di bawah
rentang rasio 1,8-2,0. Uji kualitatif isolasi plasmid menghasilkan pita DNA
yang tidak jelas atau tipis jika di bandingkan dengan lamda 1 µL dan 3 µL.

DAFTAR PUSTAKA

Hardianto D, Indarto A, Sasangko ND. 2015. Optimasi metode lisis alkali untuk
meningkatkan konsentrasi plasmid. Bioteknologi Biosains. 2(2) : 60-64.

Khusnuryani A, Solohah J, Muallifah AY. 2016. Isolasi dan analisis kualitas DNA
plasmid (p-GEM-3Zf (+) sebagai sediaan. Integrated Lab Journal. 4(1) : 63-
70.

Indradewi AF.2007. Deteksi DNA plasmid pada Lactobacillus sp. dengan metode
elektroforesis gel agarosa. Warta Wiptek. 14(2): 67–69.

Kelanit RS, Runtuboi DYP, Gunaedi T.2016. Uji resistensi antibiotik dan deteksi gen
plasmid IncHI1 Salmonella typhi isolate Jayapura. Jurnal Biologi Papua.
8(1): 48-56.

Pangastuti A, Wahjuningrum D, Suwanto A.2002. Isolasi, karakterisasi, dan kloning

gen penyandi α-amilase bakteri halofil moderat asal Bledug Kuwu. Hayati.
9(1): 10-14.

Stanfield WD, Jaime SC, Raul JC. 1996. Molecular and Cell Biology. New York (US):
Mc Graw-Hill.

Watson JD, Baker TA, Bell SP, Gann A, Levine M, Losick R. 2008. Molecular
Biology of the Gene. San Francisco: Pearson Education, Inc.