LAPORAN AKHIR

HIBAH KOMPETITIF PENELITIAN FMIPA

Produksi -Amilase Rekombinan dalam Inang Pichia pastoris Defisien

Protease

Tahun ke 1 dari rencana 1 tahun

Nama Peneliti Utama:

Dr. Shabarni Gaffar, M.Si (0025047105)

Nama Anggota:

Dian Siti Kamara, M.Si (0006126603)

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS PADJADJARAN
NOVEMBER 2014
 HALAMAN PENGESAHAN

Judul: Produksi -amilase rekombinan dalam inang Pichia pastoris defisien protease.

Peneliti/Pelaksana
Nama Lengkap : Dr. Shabarni Gaffar, M.Si.
NIDN : 0025047105
Jabatan Fungsional : Lektor
Program Studi : Kimia
Nomor HP : 081573019025
Alamat surel (e-mail) : era2504@yahoo.com

Anggota (1)
Nama Lengkap : Dian Siti Kamara, M.Si
NIDN : 0006126603
Perguruan Tinggi : Universitas Padjadjaran

Institusi Mitra (jika ada)

Nama Institusi Mitra : -
Alamat :-
Penanggung Jawab :-
Tahun Pelaksanaan : Tahun ke 1 dari rencana 1 tahun
Biaya Tahun Berjalan : Rp. 25.000.000
Biaya Keseluruhan : Rp. 25.000.000
Mahasiswa yang terlibat penelitian : S1 : 1 orang
S2 -
S3 -

Jatinangor, November 2014

Mengetahui,
Kepala Departemen Kimia Ketua,

(Dr. Iwan Hastiawan) (Dr. Shabarni Gaffar, M.Si)

NIP. 19550111 198701 1 001) NIP. 19710425 200501 2 001

Menyetujui
Dekan FMIPA Unpad

(Prof. Dr. Budi Nurani Ruchjana, MS)

NIP. 19631223 198803 2 001
 DAFTAR ISI

LEMBAR PENGESAHAN .......................................................................................... ii

DAFTAR ISI ............................................................................................................... iii
DAFTAR GAMBAR.................................................................................................... iv

RINGKASAN ................................................................................................................ 1
PRAKATA .................................................................................................................... 2
BAB I. PENDAHULUAN............................................................................................. 3
1.1. Latar Belakang ......................................................................................................... 3
1.2. Tujuan Penelitian ..................................................................................................... 4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA .................................................................................. 5
2.1. Sistem ekspresi Pichia pastoris ............................................................................... 5
2.2. Enzim α-amilase Saccharomycopsis fibuligera ....................................................... 7
2.3. Penelitian yang telah dilakukan ............................................................................... 7
2.4. Penelitian yang akan dikerjakan .............................................................................. 8
BAB III TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN .............................................. 15
3.1. Tujuan .................................................................................................................... 15
3.2. Manfaat penelitian ................................................................................................. 15
BAB IV METODE PENELITIAN ............................................................................ 20
4.1. Alat dan Bahan....................................................................................................... 20
4.1.1. Alat...................................................................................................................... 22
4.1.2. Objek Penelitian .................................................................................................. 23
4.1.3. Bahan Penelitian ................................................................................................. 24
4.2. Metode Penelitian .................................................................................................. 24
4.2.1. Isolasi plasmid rekombinan yang membawa gen pengode a-amilase ................ 25
4.2.2. Peremajaan inang P. pastoris.............................................................................. 26
4.2.3. Pembuatan sel kompeten dan transformasi P. pastoris ...................................... 28
4.2.4. Penetuan fenotipe P. pastoris ............................................................................. 29
4.2.5. Ekspresi α-amilase .............................................................................................. 30
4.2.6. Karakterisasi α-amilase dengan SDS PAGE ...................................................... 31
4.2.7. Penentuan aktivitas α-amilase............................................................................. 32
4.2.8. Penentuan kadar protein...................................................................................... 33
BAB V. HASIL YANG DICAPAI ............................................................................. 34
5.1. Isolasi plasmid rekombinan yang membawa gen pengode α-amilase ................... 35
5.2. Peremajaan inang P. pastoris SMD 1165 .............................................................. 35
5.3. Transformasi P pastoris SMD 1165 dengan metoda elektroporasi ....................... 36
5.4. Ekspresi α-amilase oleh P. pastoris rekombinan ................................................... 37
5.5. Aktifitas α-amilase rekombinan ............................................................................. 38
5.6. Karakterisasi α-amilase rekombinan ...................................................................... 39
5.7. Penentuan kadar protein......................................................................................... 40
BAB VI. KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................... 41
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................. 21
 DAFTAR GAMBAR

Gambar 5.1. Hasil isolasi plasmid pPICZA-Sfamy ................................... 21

Gambar 5.2. Peta plasmid pPICZA-Sfamy ............................................... 22
Gambar 5.3. Peremajaan kultur P. pastoris SMD 1165 ........................... 23
 RINGKASAN

Sistem ekspresi Pichia pastoris banyak digunakan untuk memproduksi protein

heterolog karena tingkat ekspresinya yang tinggi, mudah dilakukan peningkatan skala
produksi, adanya modifikasi pasca translasi, serta mampu mensekresikan protein
heterolog dengan ukuran lebih besar dari 50 kDa. Namun level sekresi pada beberapa
protein rekombinan tertentu masih rendah, yang diantaranya disebabkan terjadinya
proteolisis dari protein yang diekspresikan. Penelitian ini dilakukan dengan hipotesis
bahwa penggunaan inang P. pastoris defisien protease akan meningkatkan produksi
-amilase oleh P. pastoris. Penggunaan inang P. pastoris sudah kami pelajari
sebelumnya untuk produksi -amilase S. fibuligera. Namun hasil yang diperoleh
dirasa tidak terlalu besar dibanding dengan tipe natif, padahal beberapa hal lain yang
mempengaruhi hasil ekspresi telah diperhatikan. Oleh karena itu pada penelitian ini
kami bermaksud untuk mempelajari penggunaan inang P. pastoris defisien protease
untuk produksi -amilase. Penelitian ini dilaksanakan selama satu tahun dan
melibatkan satu orang mahasiswa S1. Vektor ekspresi untuk P. pastoris yang telah
mengandung gen pengode -amilase digunakan untuk mentransformasi P. pastoris
SMD 1165 defisien protease. Transformasi dilakukan dengan metoda elektroporasi.
Ekspresi -amilase oleh inang P. pastoris defisien protease dilakukan dengan
menambahkan penginduksi metanol. Karakterisasi dilakukan dengan metoda SDS-
PAGE. -Amilase yang dihasilkan diuji aktifitasnya dan ditentukan kadar proteinnya.
Hasil penelitian ini menujukkan telah diperoleh transforman P. pastoris defisien
protease yang membawa gen Sfamy. Hasil analisis kualitatif menunjukan transforman
P. pastoris[pPICZA-Sfamy] mensekresikan α-amilase. Hasil ini juga dikonfirmasi
dengan ekspresi α-amilase rekombinan dan analisis aktivitas α-amilase, dimana
diperoleh aktivitas α-amilase yang disekresikan oleh P. pastoris defisien protease,
tertingi pada jam ke 48 dengan aktivitas 300 U/mL dan kadar protein 25 ug/mL.
Analisis dengan SDS-PAGE menunjukkan berat mulekul α-amilase sekitar 60 kDa,
hasil ini sedikit lebih besar dibanding α-amilase natif (57 kDa), yang kemungkinan
disebabkan oleh adanya glikosilasi pada P. pastoris.

2
 PRAKATA

Puji syukur kami panjatkan kehadirat Allah Subhanahu wa Ta’ala, karena

hanya dengan izin-Nya penulis bisa menyelesaikan laporan kemajuan penelitian ini.
Shalawat serta salam semoga tercurah kepada Rasulullah SAW beserta keluarga,
sahabat dan seluruh pengikut setia Beliau sampai akhir zaman. Alhamdulillah, penulis
akhirnya dapat menyelesaikan laporan kemajuan hibah kompetitif penelitian FMIPA
dengan judul “Produksi -amilase rekombinan dalam inang Pichia pastoris defisien
protease”
Penyusun ingin mengucapkan terima kasih kepada:
1. Prof. Dr. Budi Nurani R, MS, selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam Universitas Padjadjaran.
2. Dr. Iwan Hastiawan, selaku Kepala Departemen Kimia, Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Padjadjaran.
3. Dr Toto Subroto, selaku kepala Laboratorium Kesehatan dan Pangan
Departemen Kimia FMIPA Unpad dan seluruh staf dosen Biokimia atas
bantuan dan dorongannya.
Semoga Allah memberikan balasan yang berlipat ganda atas segala bantuan
dan dorongan selama ini.
Penyusun menyadari bahwa dalam penyusunan laporan ini masih terdapat
kekurangan. Oleh karena itu, penyusun menerima kritik dan saran yang bersifat
membangun dari berbagai pihak sebagai perbaikan supaya penyusunan laporan ini
dapat berkembang dan tentunya bermanfaat bagi peneliti pada khususnya dan
masyarakat pada umumnya.
Akhir kata, semoga penyusunan laporan ini dapat bermanfaat bagi semua
pihak dan bisa memberikan ilmu bagi yang membacanya.

Jatinangor, November 2014

Penyusun

3
 BAB I. PENDAHULUAN

1.1.Latar Belakang
-Amilase telah dipakai pada bidang industri seperti makanan, alkohol, gula, dan
tekstil. Sampai saat ini, Indonesia masih mengimpor enzim ini dari beberapa negara,
karena belum adanya industri yang memproduksi enzim ini. Padahal Indonesia
memiliki biodiversitas mikroba yang tinggi, yang potensial untuk menghasilkan -
amilase. Salah satu mikroba penghasil -amilase yang telah dipelajari adalah
Saccharomycopsis fibuligera (Soemitro et al, 1996)
-Amilase S. fibuligera merupakan salah suatu enzim ekstraseluler yang mampu
memecah pati mentah sehingga dapat menghemat energi dalam pemrosesan pati,
dengan demikian memiliki potensi untuk dapat dikembangkan dan diaplikasikan
dalam industri (Hostinova, 2002; Hasan et al., 2006). Optimasi produksi -amilase S.
fibuligera perlu dilakukan untuk mempermudah pengembangan produksi -amilase
dalam skala komersial, dengan harga yang bersaing dengan enzim impor. Penelitian-
penelitian tentang -amilase S. fibuligera telah dilakukan oleh kelompok kami sejak
tahun 1993. Penelitian ini telah menghasilkan publikasi internasional tentang
proteolisis -amilase S. fibuligera (Hasan et al., 2008), Karakterisasi biokimia
glukoamilase (Natalia et al., 2011) dan peningkatan aktivitas -amilase S. fibuligera
melalui modifikasi kovalen (Ismaya et al., 2013). Selanjutnya -amilase S. fibuligera
di produksi dalam P. pastoris pada penelitian RUT XII (Puspasari et al, 2006), dan
dimodifikasi peptida signalnya untuk peningkatan sekresi dalam P. pastoris (Gaffar et
al, 2007). Hasil yang diperoleh dari penelitian-penelitian ini telah berhasil
meningkatkan produksi -amilase dalam P. pastoris, namun masih lebih rendah
dibandingkan yang dipublikasikan oleh Paifer et al. (1994) yang melaporkan ekspresi
-amilase suatu bakteri dalam P. pastoris. Beberapa faktor yang mempengaruhi
tingkat sekresi juga sudah dipelajari, yaitu: penambahan faktor pelipatan protein dan
faktor sekresi (Gaffar et al., 2010). Pada penelitian ini akan dilakukan ekspresi -
amilase S. fibuligera menggunakan inang P. pastoris defisien protease. Penggunakan
galur ini berhasil meningkatkan produksi endostatin murin dan manusia
(Cereghino&Cregg, 2000).

4
 Dari hasil penelitian RUT XII (Puspasari et al. 2006) dengan topik ”Produksi -
amilase dengan kestabilan tinggi dalam P. pastoris”, diperoleh aktivitas -amilase S.
fibuligera R64 tertinggi dengan sistem batch sebesar 5000 U/mL. Sementara itu Paifer
et al. (1994) melaporkan bahwa tingkat ekspresi -amilase bakteri dalam P. pastoris
mencapai 22.000 U/mL. Berdasarkan hal tersebut di atas, disimpulkan bahwa ternyata
tingkat ekspresi -amilase S. fibuligera R64 dalam P. pastoris masih relatif rendah.
Pengaruh penambahan faktor pelipatan protein dan faktor sekresi juga sudah dipelajari
(Gaffar et al., 2010; Gaffar et al., 2012), namun hasil yang diperoleh masih belum
memuaskan.
Terdapat banyak faktor yang mempengaruhi level sekresi protein oleh mikroba.
Menurut Shi-Hwei et al. (2005), beberapa masalah yang sangat potensial dalam
sekresi protein, termasuk dalam P. pastoris adalah: (1) jenis penggunaan kodon dari
gen yang diekspresikan, (2) jumlah gen yang digunakan, (3) efisiensi dan kekuatan
promoter, (4) efisiensi sinyal translasi, (5) jenis peptida sinyal, (6) proses dan
pelipatan di dalam retikulum endoplasma dan badan Golgi, (7) faktor lingkungan
dalam sekresi ekstraseluler, dan (8) hidrolisis protein oleh protease.

1.2. Tujuan Penelitian.

Berdasarkan pertimbangan di atas, pada penelitian ini faktor “hidrólisis protein
oleh protease” menjadi perhatian. dalam peningkatan hasil. Penggunaan inang defisien
proteasi diyakini akan meminimalkan proteólisis protein yang dihasilkan sehingga
dapat meningkatkan hasil.
Penelitian ini merupakan topik penelitian S1. Hasil yang diperoleh akan
melengkapi data hasil penelitian tentang produksi -amilase dalam sistem ekspresi P.
pastoris, sehingga dapat dipublikasikan pada jurnal nasional atau internasional. Bagi
pengembangan institusi, adanya penelitian ini selain akan meningkatkan kualitas
sumber daya tenaga akademik institusi yang terlibat, juga akan memperkuat jaringan
kerjasama yang telah ada.

5
 BAB II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1.Sistem ekspresi Pichia pastoris.

Cowan (1996) dalam pembahasannya mengenai teknologi enzim dalam
industri melaporkan bahwa sebagian besar enzim yang telah digunakan di industri
ternyata merupakan hasil rekayasa, baik rekayasa pada tingkat genetik maupun
protein. Salah satu pendekatan untuk memproduksi enzim rekombinan pada skala
komersial adalah dengan cara kloning, yaitu dengan memindahkan gen pengkode
enzim tertentu ke inang (host), dengan harapan tingkat sekresi yang tinggi dari inang
terhadap enzim tertentu, karena tingkat jumlah enzim yang disekresi dari mikroba
asalnya (tanpa kloning) biasanya lebih rendah dibandingkan dengan hasil
rekombinan.
Escherichia coli telah lama menjadi pilihan sebagai ‘pabrik’ berbagai protein
rekombinan. Penggunaan E. coli sebagai sistem ekspresi dipilih karena sistem ini
mempunyai tingkat ekspresi yang tinggi, media pertumbuhannya murah, serta mudah
dilakukan peningkatan skala produksi untuk industri. Masalah timbul bila protein
yang akan diekspresikan dalam E. coli berasal dari organisme eukariot. Seperti semua
prokariot lainnya, E. coli tidak dapat melakukan modifikasi pasca-translasi yang
sangat diperlukan oleh protein-protein eukariot. Selain itu protein yang diekspresikan
di E. coli merupakan protein intraseluler yang sering menghasilkan badan inklusi yang
tidak larut (dalam kasus ekspresi tinggi). Untuk memperoleh protein dalam bentuk
aktif, badan inklusi harus dilarutkan dan dilakukan pelipatan ulang. Selanjutnya bila
protein diekspresikan di E. coli, residu metionin kadang-kadang tetap tertinggal pada
sisi N-terminal dari protein yang diekspresikan. Ekstra metionin ini dilaporkan
mempengaruhi kestabilan konformasi protein (Chaudlhuri et al., 1999; Takano et al.,
1999).
Untuk mengatasi kendala dalam sistem ekspresi E. coli, protein rekombinan
yang berasal dari eukariot banyak diekspresi dalam sistem Saccharomyces cerevisiae.
Beberapa hasil penelitian dari beberapa kelompok telah berhasil meningkatkan
produksi enzim-enzim tertentu di S. cerevisiae. Namun ternyata sistem ekspresi S.
cerevisiae memiliki keterbatasan. Produksinya rendah dan kebanyakan protein yang
disekresikan S. cerevisiae tidak ditemukan bebas dalam medium, akan tetapi berada
pada rongga periplasma, hal ini menimbulkan masalah pada saat pemurnian protein

6
sehingga menurunkan hasil yang diperoleh. Disisi lain, protein heterolog mengalami
hiperglikosilasi dengan lebih dari 100 residu manosa dalam bentuk rantai samping N-
oligosakarida. Kelebihan manosa sering mengubah fungsi protein sehingga protein
heterolog menjadi bersifat antigenik. Selain itu bila densitas sel tinggi, S. cerevisiae
akan memproduksi etanol yang bersifat racun, sehingga menurunkan jumlah protein
yang disekresikan (Glick dan Pasternak, 2003).
Pichia pastoris merupakan spesies alternatif untuk ekspresi protein
rekombinan. Penggunaan sistem ekspresi P. pastoris memberikan keuntungan
dibandingkan dengan sistem ekspresi lain. Sistem ini merupakan satu-satunya sistem
yang menggabungkan keuntungan penggunaan E. coli (tingkat ekspresi tinggi, mudah
dilakukan peningkatan skala produksi, dan murah) dan sistem ekspresi eukariot
(adanya komponen pelipatan protein dan modifikasi pasca translasi). Fleksibilitas
sistem ekspresi P. pastoris menjadikannya alat yang ideal untuk riset laboratorium
yang ditujukan untuk aplikasi industri. Berbagai jenis protein telah berhasil diproduksi
dengan sistem ekspresi P. pastoris dengan tingkat ekspresi hingga 12 g/L (Invitrogen,
2004). Tingkat ekspresi -amilase suatu bakteri dalam P. pastoris yang cukup tinggi
telah diperlihatkan oleh Paifer et al. (1994), yaitu sebanyak 2,5 g/L. P. pastoris telah
digunakan juga untuk ekspresi mutan -amilase pankreas manusia yang berbobot
molekul 56 kDa (Rydberg et al., 1999). Hasil yang ditunjukkan di atas dapat menjadi
pertimbangan kuat dalam penggunaan P. pastoris sebagai vektor dalam produksi -
amilase untuk aplikasi industri.
P. pastoris memiliki beberapa keunggulan dibandingkan dengan S. cerevisiae,
yaitu: (1) P. pastoris memiliki promoter yang diregulasi dengan ketat, yaitu gen AOX1
yang mengkode alkohol oksidase yang dapat diinduksi oleh metanol. Apabila ada
metanol, 30% dari protein selular adalah alkohol oksidase. Sedangkan bila tidak ada
metanol, gen AOX1 tidak bekerja. Selanjutnya promoter gen AOX1 dengan cepat
merespons penambahan metanol ke medium. Dengan kata lain, promoter AOX1
merupakan kandidat yang baik untuk menjalankan transkripsi gen yang diklon dan
memproduksi protein rekombinan dalam jumlah besar; (2) Tingkat sekresi protein
rekombinan pada P. pastoris tinggi, hal ini disebabkan oleh konsentrasi sel yang
tinggi dan tidak dihasilkannya etanol yang merupakan racun bagi sel; dan (3) P.
pastoris biasanya mensekresikan sangat sedikit proteinnya sendiri, sehingga

7
memudahkan pemurnian protein rekombinan yang disekresikan (Glick dan Pasternak,
2003).
Protein dapat disekresikan ke medium ekstraselular dengan cara memilih
peptida sinyal tertentu dari sel eukariot seperti ragi. Banyak jenis sinyal sinyal yang
telah digunakan dalam sistem ekspresi ragi, seperti peptida sinyal yang berasal dari
gen PHO1, yeast invertase, sinyal sekresi -mating factor, dan lain-lain. Masing
masing sinyal memiliki keunggulan tersendiri dan tidak ada aturan khusus untuk
menentukan urutan sinyal yang efektif. Diantara peptida sinyal yang paling umum
digunakan adalah peptida sinyal protein -mating factor dari S. cerevisiae (Cereghino
dan Cregg, 2000).
Vektor P. pastoris pada umumnya dirancang sebagai plasmid integrasi untuk
mencegah masalah ketidakstabilan plasmid selama pertumbuhan jangka panjang. Gen
asing dan marker seleksi ragi diinsersikan ke kromosom spesifik melalui proses
rekombinasi homolog antara DNA pada vektor dengan daerah yang homolog pada
genom P. pastoris. Peta vektor ekspresi P. pastoris diperlihatikan pada Gambar 2.1.
(Invitrogen, 2004).

Gambar 2.1. Peta vektor ekspresi pPICZA, B, C dari P. pastoris (Invitrogen, 2005).

Pada P. pastoris terdapat dua gen yang mengkode alkohol oksidase, yaitu:
AOX1 dan AOX2. AOX1 bertanggung jawab terhadap aktivitas alkohol oksidase di
sel. Ekspresi gen AOX1 sangat tergantung kepada regulasi dan induksi dari metanol
dan biasanya jumlah AOX1 mencapai 30% dari total protein P. pastoris ketika
metanol dijadikan sebagai sumber karbon. Gen AOX2 memiliki kemiripan dengan
AOX1 sampai 97%. Gen ini terekspresi lebih lambat di metanol dibandingkan AOX1.
Tingkat ekspresi dari AOX1 diatur pada tingkat transkripsi. Pada medium sel yang

8
mengandung metanol, sekitar 5% dari polyA-RNA di dalam sel berasal dari gen
AOX1. Terdapat dua mekanisme regulasi AOX1, yaitu: mekanisme represi/ depresi
dan mekanisme induksi (Glick dan Pasternak., 2003).
Kemampuan P. pastoris mensekresikan protein tertentu dengan tingkat sekresi
tinggi tidak terlepas dari kemampuan ragi tersebut melakukan metabolisme terhadap
alkohol. Metabolisme yang dimaksud adalah oksidasi metanol menjadi formaldehid
dengan menggunakan molekul oksigen oleh alkohol oksidase. Salah satu produk
samping dari oksidasi metanol adalah hidrogen peroksida (H2O2). Untuk mencegah
sifat racun dari H2O2, maka metabolisme metanol ini dilakukan disebuah organel sel
khusus yang disebut dengan peroksisom. Karena alkohol oksidase memiliki afinitas
yang sangat rendah terhadap oksigen, maka kompensasi P. pastoris adalah dengan
cara mensekresi protein dengan jumlah sangat banyak (Invitrogen, 2004).
Sistem ekpresi P. pastoris telah digunakan untuk memproduksi lebih dari 100
protein aktif dari bakteri, jamur, invertebrata, tumbuh-tumbuhan, dan mamalia,
termasuk manusia. Protein-protein rekombinan ini, seperti antigen permukaan
hepatitis B, serum albumin manusia, dan bovine lysozyme, memiliki sifat identik
dengan protein natifnya (Cereghino dan Cregg, 2000)
Menurut Shi-Hwei et al. (2005), beberapa masalah yang sangat potensial
dalam sekresi protein, termasuk dalam P. pastoris adalah: (1) jenis penggunaan kodon
dari gen yang diekspresikan, (2) jumlah gen yang digunakan, (3) efisiensi dan
kekuatan promoter, (4) efisiensi sinyal translasi, (5) jenis peptida sinyal, (6) proses
dan pelipatan di dalam retikulum endoplasma dan badan Golgi, (7) faktor lingkungan
dalam sekresi ekstraseluler, dan (8) hidrolisis protein oleh protease.
Beberapa galur defisien protease SMD1163 (his4pep4prb1), SMD1165
(his4prb1), dan SMD1168 (his4, pep4) mendegradasi beberapa protein asing dengan
efektif. Hal ini terutama dapat diamati pada kultur fermentor, karena kombinasi dari
sel densitas tinggi dan lisis sejumlah kecil sel menghasilkan protease vakuola
konsentrasi tinggi. Galur defisien protease SMD1168 Δpep4:: URA3 Δkex1:: SUC2
his4 ura3 baru-baru ini dikembangkan untuk menginhibisi proteolisis dari endostatin
murine dan manusia. Protease Kex1 dapat memotong ujung karboksil dari lysin dan
arginin. Sehingga galur dengan delesi Kex1 dibuat untuk menghambat proteolisis
ujung karboksil. Setelah fermentasi selama 40 jam, pemurnian endostatin dapat
dilakukan. Namun sel defisien protease ini tidaklah sebagus galur wild type (dalam hal

9
PEP4). Selain itu, kelangsungan hidupnya juga rendah dan sel ini tumbuh lambat dan
lebih sulit untuk ditransformasi. Sehingga penggunaan galur defisien protease hanya
direkomendasikan pada situasi bila cara lain untuk mengurangi proteolisis
memberikan hasil yang tidak memuaskan (Cereghino & Cregg, 2000).

2.2. Enzim α-amilase Saccharomycopsis fibuligera

Enzim -amilase (1,4--D-glukan glukanohidrolase [EC 3.2.1.1]) adalah
enzim yang mengkatalisis hidrolisis pati atau poli- dan oligosakarida lain yang
memiliki ikatan 1,4--glikosida secara acak dan cepat dengan produk berupa gula
yang lebih sederhana dengan konfigurasi-. Sejak -amilase termostabil yang
dihasilkan oleh Bacillus licheniformis digunakan dalam industri produksi gula cair,
maka pengembangan aplikasi -amilase bidang industri lainnya semakin luas, seperti
alkohol, pengolahan buah-buahan, dan tekstil. Kebutuhan yang besar akan -amilase
yang besar dengan sifat-sifat yang optimal, menyebabkan beberapa kelompok peneliti
berusaha meningkatkan kapasitas produksi dan sifat -amilase agar dapat
menyesuaikan dengan kebutuhan industri, salah satunya dengan rekayasa pada tingkat
protein atau gen. (Hashida dan Bisgaard-Frantzen, 2000).
Enzim -amilase Saccharomycopsis fibuligera merupakan salah suatu enzim
ekstraseluler yang memiliki potensi untuk dapat dikembangkan sehingga dapat
diaplikasikan dalam industri. Walaupun -amilase yang dihasilkan oleh ragi belum
diaplikasikan secara luas dibandingkan dengan yang diproduksi oleh bakteri dan
jamur, enzim -amilase dari S. fibuligera telah lama dimanfaatkan untuk proses
sakarifikasi pada fermentasi makanan. Kemampuan amilase (-amilase dan
glukoamilase) yang dihasilkan oleh Saccharomycopsis fibuligera dalam memecah pati
mentah merupakan sifat yang menarik, enzim semacam ini dapat digunakan dalam
pemrosesan pati yang hemat energi (Hostinova, 2002).

2.3. Penelitian yang telah dikerjakan.

Penelitian-penelitian tentang -amilase S. fibuligera telah dilakukan oleh
kelompok kami sejak tahun 1993. Penelitian ini telah menghasilkan publikasi
internasional tentang proteolisis -amilase S. fibuligera (Hasan et al., 2008),
Karakterisasi biokimia glukoamilase (Natalia et al., 2011) dan peningkatan aktivitas

10
-amilase S. fibuligera melalui modifikasi kovalen (Ismaya et al., 2013). Selanjutnya
-amilase S. fibuligera di produksi dalam P. pastoris pada penelitian RUT XII
(Puspasari et al, 2006), dan dimodifikasi peptida signalnya untuk peningkatan sekresi
dalam P. pastoris (Gaffar et al, 2007). Hasil yang diperoleh dari penelitian-penelitian
ini telah berhasil meningkatkan produksi -amilase dalam P. pastoris, namun masih
lebih rendah dibandingkan yang dipublikasikan oleh Paifer et al. (1994) yang
melaporkan ekspresi -amilase suatu bakteri dalam P. pastoris. Beberapa faktor yang
mempengaruhi tingkat sekresi juga sudah dipelajari, yaitu: penambahan faktor
pelipatan protein dan faktor sekresi (Gaffar et al., 2010; Gaffar et al., 2012).

2.4. Penelitian yang akan dikerjakan.

Topik yang akan dikerjakan pada penelitian ini adalah produksi a-amilase S.
fibuligera dalam inang P. pastoris defisien protease. Penggunaan inang ini disarankan
untuk meminimalkan degradasi protein oleh protease inang. Penelitian ini akan
melengkapi data hasil penggunaan sistem ekspresi P. pastoris untuk produksi -
amilase sehingga bisa dipublikasikan di jurnal internasional atau nasional
terakreditasi.

11
 BAB 3. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN

3.1. Tujuan
Tujuan penelitian ini adalah produksi -amilase S. fibuligera dalam inang P.
pastoris defisien protease. Sistem ekspresi yang dihasilkan diharapkan mampu
memproduksi -amilase yang secara ekonomi dapat bersaing dengan enzim
komersial.
Tujuan khusus yang akan dicapai pada penelitian ini adalah :
1. Transformasi inang P. pastoris defisien protease dengan vektor ekspresi yang
telah membawa gen pengode a-amilase.
2. Ekspresi a-amilase oleh P. pastoris defisien protease.
3. Produksi -amilase dalam P. pastoris.
4. Mengetahui aktivitas -amilase dan kadar protein
5. Karakterisasi a-amilase dengan SDS-PAGE dan Western Blot
6. Mengetahui kondisi optimum untuk produksi -amilase dalam inang P.
pastoris defisien protease.

3.2. Manfaat Penelitian

Hasil penelitian ini akan memberikan informasi tentang manfaat penggunakan
inang P. pastoris defisien protease untuk produksi protein rekombinan dalam sistem
ekspresi P. pastoris. Salah satu kunci dalam produksi enzim -amilase rekombinan
adalah manipulasi mikroba penghasil -amilase. Hampir semua enzim komersial
merupakan enzim rekombinan yang berasal dari mikroba yang telah direkayasa
(Cowan, 1996).
Salah satu kendala produksi enzim -amilase wild type adalah produktivitasnya
rendah, sedangkan dalam industri diperlukan mikroba dengan produktivitas yang
tinggi dan ekonomis. Untuk menghasilkan galur mikroba dengan sifat-sifat yang
unggul ini, dapat dimanfaatkan teknologi DNA rekombinan. Enzim-enzim tersebut
dapat dihasilkan dalam sistem ekspresi protein heterolog, seperti E. coli, S. cerevisiae
dan P. pastoris. Jumlah enzim yang disekresi dari mikroba asalnya biasanya lebih
rendah dibandingkan dengan hasil rekombinan.

12
 BAB III. METODE PENELITIAN

4.1 Alat dan Bahan

4.1.1 Alat

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah elektroporator, shaker

incubator, seperangkat alat PAGE (Poliakrilamid gel electrophoresis), seperangkat alat
elektroforesisi agarose, penangas air, autoclave, spektrofotometer, pengaduk magnet,
pemanas dan alat-alat gelas.

4.1.2 Objek Penelitian

Objek penelitian adalah gen pengode -amilase S. fibuligera R64 (Sfamy) yang
dibawa oleh inang E. coli Top10F’ [pPICZA-Sfamy]. Inang yang akan digunakan
adalah P. pastoris galur SMD 1165 (Invitrogen).

4.1.3 Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: YNB, ekstrak ragi, bakto
pepton, sorbitol, D-biotin, histidin, metanol, gliserol, kalium hidrogen fosfat dan
kalium dihidrogen fosfat untuk ekspresi protein. Pati, DNS, natrium hidroksida,
kalium-natrium-tartrat , buffer fosfat, reagen Bradford untuk uji aktifitas dan kadar
protein. Transformasi P. pastoris metode elektroporasi menggunakan HEPES, DTT
dan sorbitol. Isolasi DNA genom S. fibuligera menggunakan kit Wizard Genomic
DNA Purification kit (Promega). SDS, akrilamida, metilenbisakrilamida, AMPS,
TEMED, glisin, Tris-base, merkaptoetanol, bromofenol biru, gliserol, coomassie
brilliant blue, asam asetat glasial, dan marka protein untuk karakterisasi protein
dengan SDS-PAGE.

4.2 Metode Penelitian.

4.2.1. Isolasi plasmid rekombinan yang mengandung gen pengode -amilase dan
linearisasi dengan enzim restriksi Pme1.
Plasmid rekombinan akan diisolasi dari inang E. coli yang diperoleh pada
penelitian sebelumnya. Plasmid rekombinan diisolasi dari koloni E. coli transforman
menggunakan QIAgen Spin Plasmid Miniprep Test Kit (Qiagen) mengikuti protocol.
13
DNA plasmid rekombinan hasil pemurnian, dianalisis dengan elektroforesis agarosa
1%. Sebanyak 1-5 μg plasmid rekombinan pPICZA-Sfamy dilinearisasi menggunakan
enzim restriksi Pme1. Campuran reaksi mengandung 1-5 μg plasmid rekombinan, 10
Unit Pme1 dan buffer Tango 1X. Restriksi dilakukan dalam volume 20 L, dan
diinkubasi pada suhu 37C selama 16 jam. Hasil restriksi di elektroforesis
menggunakan gel agarosa 1%.

4.2.2. Peremajaan inang P. pastoris SMD 1165

Inang P. Pastoris SMD 1165 diremajakan menggunakan media pertumbuhan
YPD (yeast-peptone-dextrose). Kultur P. pastoris diremajakan untuk mendapatkan
koloni tunggal. Kultur dipindahkan ke dalam 20 mL media YPD cair (ekstrak ragi 1%
(b/v), bakto pepton 2% (b/v), dekstrosa 2% (b/v)) diinkubasi pada suhu 30C semalam
dengan pengocokan 250 rpm, dan kemudian di sebarkan pada media YPD padat
(ekstrak ragi 1% (b/v), bakto pepton 2% (b/v), dekstrosa 2% (b/v), bakto agar 2%)
untuk mendapatkan koloni tunggal. Koloni tunggal dipindahkan ke agar miring untuk
penyimpanan dalam jangka waktu 3 bulan.

4.2.3. Pembuatan sel kompeten dan transformasi P. pastoris dengan metoda

elektroporasi.
Satu koloni tunggal P. pastoris dipindahkan ke dalam 20 mL media YPD cair,
diinkubasi pada suhu 30C semalam dengan pengocokan 250 rpm. Kemudian 1 mL
kultur dipindahkan ke dalam 100 mL media YPD cair, diinkubasi pada suhu 30C
dengan pengocokan 250 g sampai mencapai OD660 = 1,3-1,5. Sel dipanen dengan
sentrifugasi pada 5000 g selama 10 menit, diresuspensi dalam 20 mL media YPD dan
ditambahkan 400 μL HEPES 1M (pH 8,0). Selanjutnya ditambahkan 0,5 mL DTT 1M
dan diinkubasi pada suhu 30C selama 15 menit dengan pengocokan. Pada pelet
ditambahkan ddH2O steril sampai volume 100 mL. Sel dipelet dengan sentrifugasi
pada 5000 g, suhu 4C selama 10 menit. Selanjutnya dicuci satu kali dengan 100 mL
ddH2O dingin, satu kali dengan 50 mL ddH2O dingin, dan satu kali dengan 4-10 mL
sorbitol 1M dingin. Setiap setelah pencucian, sel dipelet dengan sentrifugasi pada
5000 g, 4C selama 10 menit, dan terakhir sel diresuspensi dalam 100 μL sorbitol 1M
dingin (akan menghasilkan volume total 200-300 μL). Sebanyak 40-50 μL sel
dimasukkan kedalam kuvet elektroporasi, kemudian ditambahkan 5 ng - 1 μg DNA

14
hasil linearisasi (dalam volume 5 μL). Kuvet yang telah berisi campuran didiamkan
dalam es selama 5 menit. Kuvet dikeringkan dan segera lakukan elektroporasi
menggunakan BTX electro cell manipulator 600. Kemudian segera tambahkan 1 mL
sorbitol 1M dingin ke dalam kuvet. Sel hasil transformasi ditumbuhkan pada media
padat YPDS (ekstrak ragi 1% (b/v), bakto pepton 2% (b/v), dekstrosa 2% (b/v),
sorbitol 1M, bakto agar 2% (b/v)) yang mengandung zeocin 100 μg/mL. Sel
diinkubasi pada suhu 30C selama 3-5 hari.

4.2.4. Penentuan Fenotip Mut P. pastoris.

Menggunakan tusuk gigi steril, satu koloni transforman P. pastoris diambil dan
digoreskan pada media padat MMH (minimal methanol medium+ histidin: YNB
1,34% (b/v), biotin 4x10-5% (b/v), metanol 0,5% (v/v), histidin 0,004% (b/v)) dan
MDH (minimal dextrose medium + histidin: YNB 1,34% (b/v), biotin 4x10-5% (b/v),
dekstrosa 2% (b/v)), penggoresan koloni dilakukan pada media MMH terlebih dulu.
Menggunakan tusuk gigi steril yang berbeda sejumlah koloni transforman lain
digoreskan pada media MMH dan MDH. Untuk membedakan fenotip Mut+ dari MutS
dibuat satu goresan kontrol (GS115/ albumin MutS dan GS115/pPICZ/lacZ Mut+)
pada media MDH dan MMH. Lalu diinkubasi pada suhu 30C selama 2 hari atau
lebih, dan dianalisis dengan “scoring template”. Galur Mut+ akan tumbuh normal
dikedua media, sementara galur MutS tumbuh normal pada media MDH tetapi
menunjukkan pertumbuhan lambat atau sama sekali tidak tumbuh pada media MMH.

4.2.5. Ekspresi -amilase.

Ekpresi -amilase akan dilakukan pada transforman P. pastoris yang positif
berisi plasmid rekombinan dengan menambahkan penginduksi metanol. Satu koloni
tunggal transforman P. pastoris diinokulasi dalam 10 mL media YPD cair, dan
diinkubasi semalam pada suhu 30C dengan pengocokan 200 rpm. Sebanyak 1 mL
kultur cair dipindahkan ke 10 mL media BMGY (buffered glycerol complex medium:
ekstrak ragi 1% (b/v), bakto pepton 2% (b/v), kalium fosfat 100 mM pH 6, YNB
1,34% (b/v), biotin 4x10-5% (b/v), gliserol 1% (v/v)) menggunakan labu 100 mL. Sel
ditumbuhkan pada suhu 28–30C pada inkubator pengocok 250 rpm hingga mencapai
OD600 = 10-20 (kira-kira 18-20 jam). Sel di panen dengan sentrifugasi pada 1500 –
3000 rpm selama 5 menit pada suhu ruang. Supernatan didekantasi dan pelet sel

15
diresuspensi dalam 25 mL media BMMH (buffered minimal methanol-histidin: YNB
1,34% (b/v), kalium fosfat 100 mM pH 6, biotin 4x10-5% (b/v), metanol 1% (v/v),
histidin 0,004%) menggunakan labu 250 mL. Labu ditutup dengan kapas steril dan
inkubasi dilanjutkan dengan pengocokan.
Induksi dilakukan dengan menambahkan metanol dengan konsentrasi akhir 0,75%
setiap 24 jam, pada jam ke 24, 36, 72, 96, 120, dan 144. Pengambilan sampel
dilakukan setiap jam induksi dengan mengambil 1 mL kultur hasil ekspresi
dipindahkan ke dalam tabung mikro 1,5 mL. Sampel disentrifugasi pada kecepatan
maksimum selama 2-3 menit pada suhu ruang. Supernatan dipindahkan ke tabung
lain, supernatan dan pelet disimpan pada pendingin -20C sampai siap untuk diuji.

4.2.6. Karakterisasi -amilase dengan SDS-PAGE.

Persiapan gel: Pelet dan supernatan hasil ekspresi dikarakterisasi dengan SDS-
PAGE (Sambrook et al., 1989) menggunakan gel dengan komposisi 10% separating
gel dan 4% stacking gel. Separating gel dibuat dengan mencampurkan 4 mL
akrilamida 30% (akrilamida 29% (b/v) dan N-N’-metilenbisakrilamida 1% (b/v)); 3,3
mL aquadest; 2,5 mL buffer Tris-Cl 1M (pH 8,8); 50 μL SDS 20%; 200 μL AMPS
10% dan 8,2 μL TEMED. Larutan dimasukkan kedalam cetakan dan dibiarkan
memadat. Stacking gel dibuat dengan mencampurkan 0,67 mL akrilamid 30%; 2,65
mL aquadest; 0,65 mL buffer Tris-Cl 1M (pH 6,8); 20 μL SDS 20%; 50 μL AMPS
10% dan 6 μL TEMED. Stacking gel dituang diatas separating gel setelah memadat.
Sebelum stacking gel dimasukkan, terlebih dahulu dipasang sisir untuk membuat
sumur sampel. Setelah itu didiamkan sampai terjadi polimerisasi (kira-kira 30 menit).
Persiapan supernatan: 50 μL supernatan dicampur dengan sampel bufer (Tris-
Cl 50 mM, pH 6,8, gliserol 1% (v/v), β-merkapoetanol 100 mM, SDS 2% (b/v),
bromofenol biru 0,1% b/v) dan dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit dan
didinginkan.
Persiapan pelet sel: Pelet sel diresuspensi dalam 300 μL aquadest, dan
ditambahkan 100 μL TCA 50%, diaduk segera. Sampel dibekukan pada suhu -80C
selama 30 menit. Sel disentrifugasi pada suhu ruang dengan kecepatan 14.000 g
selama 5 menit. Pelet sel dicuci dua kali dengan 500 μL aseton 80% dingin,
dilanjutkan dengan sentrifugasi pada 14.000 g selama 5 menit pada suhu ruang.
Supernatan dibuang dengan hati-hati, dan pelet dibiarkan mengering. Pelet dilarutkan

16
dalam 100 μL SDS 1% dalam natrium hidroksida 0,1N. Kemudian ditambahkan
sampel buffer (Tris-Cl 50 mM pH 6,8, gliserol 1% v/v, β-merkaptoetanol 100 mM,
SDS 2% b/v, bromofenol biru 0,1% b/v) dan dipanaskan dalam air mendidih selama 5
menit dan didinginkan.
Elektroforesis: Gel yang sudah memadat dimasukkan ke dalam tangki
elektroforesis dan ditambahkan running buffer (glisin 1,18% b/v, Tris base 0,32%
b/v, SDS 0,2% b/v). Sebanyak 25 μL sampel protein dimasukkan ke dalam tiap-tiap
lubang gel dan elektroforesis dilakukan pada tegangan 120 V, 400 A selama 60-80
menit). Sebagai marka digunakan PageRulerTM prestained protein ladder (Fermentas,
SM0671). Alat elektroforesis dimatikan setelah blue dye tepat keluar dari gel.
Staining dan Destaining: Gel dikeluarkan dari plat kaca kemudian di cuci 3x
selama 5 menit dalam 20 mL air de-ion, kemudian diinkubasi dalam 20 mL larutan
staining (coomassie brilliant blue 0,25% b/v, asam asetat glasial 10% v/v, metanol
45% v/v, dan akua dm) selama 45 menit dengan pengocokan rotasi. Kemudian
dipindahkan ke dalam 30 mL larutan destaining (asam asetat glacial 10% v/v glasial,
metanol 45% v/v, dan akua dm) dan dibiarkan sampai gel menjadi bersih (30 menit
sampai semalam). Gel yang sudah bersih di scan

4.2.7. Penentuan aktivitas -amilase.

Aktivitas -amilase ditentukan dengan metode DNS (Miller, 1959). Reagen
DNS disiapkan dengan menambahkan 0,1 gram asam dinitrosalisilat ke dalam 2 mL
natrium hidroksida 2N dan 5 mL aquadest. Kemudian, ditambahkan 3 gram garam
Rochelle (kalsium natrium tartrat) dan volume dicukupkan menjadi 10 mL dengan
aquadest.
Persiapan supernantan dan pelet sel. Supernatan disiapkan untuk pengukuran
aktivitas tanpa pengenceran dan dengan pengenceran sampai 100 kali. Pelet sel
diresuspensi dalam breaking buffer (natrium fosfat 50 mM, pH 7,4; PMSF 1 mM;
EDTA 1 mM; gliserol 5%) kemudian disentrifugasi selama 5-10 menit pada 3000 g
pada suhu 4C. Sel kemudian diresuspensi dalam breaking buffer sampai mencapai
OD600 sekitar 50-100. Kemudian ditambahkan glass beads (diameter 0,5 mm) dengan
volume yang sama, campuran di vortex selama 30 detik, inkubasi di es selama 30
detik, dilakukan sampai 7 kali. Campuran disentrifugasi pada suhu 4C selama 5-10

17
menit pada 12.000 g. Supernatan dipindahkan ke tabung baru dan digunakan untuk
penentuan aktivitas -amilase.
Reaksi enzimatik: Sebanyak 325 μL pati 2% (b/v) (yang dilarutkan dalam
buffer fosfat 20 mM pH 6,0) ditambahkan 625 μL buffer fosfat 20 mM pH 6,0,
diinkubasi pada suhu 50C selama 10 menit. Kemudian 50 μL sampel supernatan atau
hasil lisis pelet ditambahkan ke dalam campuran reaksi, dan inkubasi dilanjutkan
selama 10 menit. Reaksi enzimatik dihentikan tepat setelah inkubasi 10 menit dengan
memindahkan tabung ke dalam wadah es. Sebagai blanko digunakan semua
komponen reaksi, kecuali sampel diganti dengan ddH2O.
Penentuan aktivitas amilase dan pembuatan kurva kalibrasi: Sebanyak 50 μL
hasil reaksi enzimatik digunakan untuk penentuan aktivitas -amilase dengan
menambahkan 50 μL reagen DNS. Kurva kalibrasi disiapkan dengan menambahkan
50 μL glukosa 1; 2; 3; 4; 5 mM ke dengan 50 μL reagen DNS. Semua tabung sampel
ditempatkan dalam waterbath dan dididihkan selama 7 menit. Setelah didinginkan,
sampel diencerkan 10x dengan menambahkan 900 μL aquadest, dan absorbansi diukur
pada 500 nm. Satu unit aktivitas enzim adalah enzim yang membebaskan sejumlah
gula pereduksi yang ekivalen dengan 1 μmol gula pereduksi per-menit pada kondisi
uji.

4.2.8. Penentuan kadar protein.

Kadar protein ditentukan dengan metode Bradford. Sebanyak 160 μL sampel
dan standar BSA dipipet ke dalam pelat mikro, kemudian ditambahkan 40 μL reagen
Bradford. Sampel dicampur menggunakan pipet multi-channel, kemudian diinkubasi
pada suhu ruang selama 5 menit. Absorbansi diukur pada 595 nm.

18
 BAB 5. HASIL YANG DICAPAI

5.1 Isolasi plasmid rekombinan yang membawa gen pengode a-amilase

(pPICZA-Sfamy).

Hasil karakterisasi dengan gel agarose memperlihatkan bahwa plasmid

pPICZA-Sfamy telah berhasil diisolasi dari E. coli. Plasmid ini mempunyai ukuran
sekitar 3300 pb dan membawa DNA sisipan gen Sfamy dengan ukuran 1700 pb,
sehingga total ukurannnya adalah sekitar 5000 pb. Hasil pemotongan dengan enzim
restriksi Kpn1 dan Apa1 akan mengeluarkan DNA sisipan Sfamy sehingga terlihat dua
pita (3300 dan 1700 pb). Hasil pemotongan dengan enzim Pme1 melinearkan plasmid
ini sehingga terlihat satu pita dengan ukuran 5000 pb (Gambar 5.1). plasmid pPICZA-
Sfamy yang sudah linear ini yang digunakan untuk mentransformasi P. pastoris.

A. B.
Gambar 5.1. A. Hasil isolasi plasmid pPICZA-Sfamy. (1) Marka DNA, (2) Plasmid
pPICZA-Sfamy sirkular, (3) pPICZA-Sfamy/Kpn1/Apa1, (4) pPICZA-
Sfamy/Pme1. B. Peta plasmid pPICZA-Sfamy.

Plasmid pPICZA-Sfamy yang digunakan adalah hasil rancangan dari

penelitian sebelumnya, dengan peta seperti diperlihatkan pada gambar 5.1.

5.2. Peremajaan inang P. pastoris SMD 1165

Hasil peremajaan P. pastoris SMD 1165 diperlihatkan pada gambar 5.3.
Peremajaan dilakukan dengan memindahkan kultur P. pastoris dari media agar
miring ke media YPD padat (ekstrak ragi 1% (b/v), bakto pepton 2% (b/v), dekstrosa

19
2% (b/v), bakto agar 2%) dalam cawan petri, untuk mendapatkan koloni tunggal.
Koloni tunggal yang diperoleh diperlihatkan pada gambar 5.3.

Gambar 5.3. Kultur P. pastoris SMD 1165 hasil peremajaan

5.3. Transformasi P. pastoris SMD 1165 menggunakan plasmid pPICZA-Sfamy linear

dengan metoda elektroporasi.
P. pastoris ditransformasi menggunakan metode elektroporasi. Elektroporasi
menghasilkan 103-104 transforman per μg DNA linear dan tidak merusak dinding sel
P. pastoris. Metode elektroporasi menghasilkan frekuensi transformasi yang tinggi
pada P. pastoris dan merupakan metode pilihan yang tepat untuk mengisolasi integran
multi-kopi. Kemungkinan insersi multi-kopi berkisar antara 1-10%, sehingga
dibutuhkan ratusan sampai ribuan transforman untuk mengisolasi sejumlah klon
multi-kopi (Invitrogen, 2006).
Vektor pPICZA-Sfamy yang dilinearkan pada daerah 5’AOX1 akan mengalami
integrasi melalui insersi gen ke daerah 5’AOX1 inang. Sehingga inang P. pastoris
yang digunakan akan menentukan apakah galur rekombinan dapat memetabolisme
metanol (Mut+) atau tidak (Muts). Untuk menghasilkan galur rekombinan Mut+,
digunakan inang P. pastoris yang mengandung gen AOX1 natif (misalnya X-33,
GS115, SMD1165). Pada penelitian ini digunakan inang P. pastoris SMD 1165.
Sebanyak 1-5 μg plasmid rekombinan pPICZA-Sfamy dilinearkan
menggunakan enzim restriksi Pme1 mengikuti prosedur (Gambar 5.1). Sisi
pemotongan Pme1 berada pada daerah promotor 5’AOX1.
Transformasi P. pastoris dengan metode elektroporasi dilakukan mengikuti
prosedur. Sel hasil transformasi ditambahkan 1 mL sorbitol 1M dingin dan

20
ditumbuhkan pada media padat YPDS yang mengandung zeocin 100 μg/mL dan
diinkubasi pada 30C selama 3 hari.

A. B.
Gambar 5.4. A. Koloni transforman P. pastoris[Sfamy]. B. replika P. pastoris[Sfamy]

Hasil transformasi metode elektroporasi memperlihatkan efisiensi yang tidak

terlalu tinggi, diperoleh sekitar 10 koloni P. pastoris transforman (Gambar 5.4).
Elektroporasi dilakukan menggunakan Eppendorf electroporator pada tegangan 1500
volt, menggunakan kuvet 0,2 cm Elektroporasi atau elektropermeabilisasi merupakan
peningkatan konduktivitas listrik dan permeabilitas membran plasma sel yang
disebabkan pemberian arus listrik dari luar. Elektroporasi biasa digunakan untuk
transformasi bakteri, ragi dan protoplas tanaman. Dinding sel pada umumnya berpori
dan berperan sebagai kerangka yang kaku yang berfungsi menjaga sel dari pengaruh
lingkungan. Jika sel (bakteri/ragi) dan plasmid dicampur, maka plasmid dapat pindah
ke dalam sel setelah elektroporasi. Setelah itu sel harus diperlakukan dengan hati-hati
sampai sel memiliki kesempatan untuk membelah membentuk sel baru yang
mengandung plasmid. Transformasi metode elektroporasi 10 kali lebih efektif
dibandingkan transformasi kimia (Weaver & Chizmadzhev, 1996). Transforman yang
tumbuh direplika ke media YPD yang baru. Hasil replika transforman diperlihatkan
pada gambar 5.4B.

5.4. Uji Kualitatif P. pastoris [Sfamy]

Uji kualitatif perlu dilakukan untuk memastikan koloni P. pastoris yang akan
dipakai mengekspresikan α-amilase. Uji kualitatif pada P. pastoris dilakukan dengan
menggunakan media YPD padat yang mengandung pati. Hasil pengamatan (Gambar
5.5) menunjukkan bahwa koloni P. pastoris [Sfamy] mampu mensekresikan α-amilase
21
keluar sel. Hal ini ditunjukkan oleh adanya daerah bening di sekeliling koloni P.
pastoris setelah dilakukan penambahan larutan KI/I2. Daerah bening tersebut
terbentuk karena tidak adanya pati yang membentuk kompleks dengan KI/I2 karena
pati telah dihidrolisis oleh -amilase yang disekresikan oleh P. pastoris, sedangkan
daerah biru menunjukkan adanya pati yang masih tersisa dalam media pertumbuhan
sehingga membentuk kompleks dengan iodium.

Gambar 5.5 Hasil uji aktivitas -amilase secara kualitatif dalam media padat yang
mengandung 2% pati dan 0,5% metanol.

5.5. Ekspresi α-amilase oleh P. pastoris[Sfamy].

Transforman P. pastoris [Sfamy] dan [WT-ALP1] digunakan untuk

mengekspresikan Sfamy. Ekspresi dilakukan mengikuti prosedur. Induksi dilakukan

dengan menambahkan metanol 0,75% (konsentrasi akhir dalam medium) setiap 24

jam. Sebagai pembanding tingkat sekresi Sfamy oleh P. pastoris digunakan inang

GS115. Supernatan dan pelet dikumpulkan setiap 24 jam dan dianalisis aktivitas -

amilasenya dengan metode DNS. Sekresi Sfamy meningkat tajam pada jam ke-72,

namun kemudian menurun hingga pengambilan sampel terakhir pada jam ke-144.

Pada jam ke-72, aktivitas Sfamy pada supernatan kultur P. pastoris [MS-ALP1] dan

[WT-ALP1] berturut-turut adalah 106,69 U/mL dan 32,29 U/mL (Gambar 4.15).

Sedangkan pada inang GS115 aktivitas -amilase yang terdeteksi pada kultur

supernatan hanya 1,9 U/mL sehingga bisa dianggap bahwa inang P. pastoris tidak

22
mensekresikan -amilase. Hasil ini memperlihatkan level sekresi Sfamy oleh P.

pastoris [MS-ALP1] lebih tinggi 3,3x dibandingkan P. pastoris [WT-ALP1].

Penentuan aktifitas, kadar protein dan karakterisasi a-amilase hasil ekspresi

1
y = 0.0757x + 0.0276
0.8
R² = 0.9879
Absorbansi

0.6

0.4

0.2

0
1 2 3 4 5 6
Konsentrasi Glukosa (mM)

Pembuatan laporan akhir

Publikasi di Jurnal Nasional Bionatura.
Jam ke - A500 [Glukosa] Aktivitas
(U/mL)
0 0.06 0.44 88
24 0.245 2.90 581
48 0.372 4.6 920
72 0.351 4.32 864
96 0.143 1.54 309
120 0.127 1.33 266

23
 1000

800
Aktivitas (U/ml)
600

400
[WTSfamy]
200

0
0 24 48 72 96 120
Waktu (jam)

24
 BAB 7. KESIMPULAN DAN SARAN

7.1. Kesimpulan

1. Plasmid pPICZA-Sfamy telah berhasil diisolasi, dikarakterisasi dan dilinerkan

dengan enzim restriksi.
2. P. pastoris SMD 1165 telah berhasil diremajakan menggunakan media
pertumbuhan YPD padat.

7.2 Saran
1. Penelitian ini perlu dilanjutkan ke tahap berikutnya, yaitu transformasi P.
pastoris, ekspresi a-amilase, uji aktivitas dan karakterisasi.

25
 DAFTAR PUSTAKA

Chandhuri, T.K., Horii, K., Yoda, T., Arai, M., Nagata, S., Terada, T.P., Uchiyama,
H., Ikura, K., Tsumoto, K., Kataoka, H., Matshushima, M., Kuwajima, K.,
Kumagai, I. 1999. Effect of the extra N-Terminal Met. Residu on the Stability
and folding of Recombinant-lactalbumin express in E. coli. J. Mol. Biol. 285,
1179-1194.

Cereghino, J. L., Cregg, J. M. 2000. Heterologous protein expression in the

methylotrophic yeast Pichia pastoris. FEMS Microbiol. Rev. 24, 45-66

Cowan, D. 1996. Industrial enzyme technology. Trends Biotechnol. 14, 177-178

Gaffar, S., 2007. Peningkatan sekresi -amilase S. fibuligera melalui manipulasi

peptide sinyal dalam P. pastoris. Laporan Penelitian Hibah Bersaing.

Gaffar, S., 2010. Penambahan faktor pelipatan protein (PDI1) untuk meningkatkan
sekresi -amilase S. fibuligera oleh P. pastoris. Laporan Penelitian Hibah
Bersaing.

Gaffar, S., 2011. Pengaruh manipulasi genetik terhadap tingkat sekresi -amilase
Sacharomycopsis fibuligera R64 dalam Pichia pastoris. Disertasi. Unpad.

Gaffar, S., 2012. Pengaruh ko-ekspresi Sec4p terhadap tingkat sekresi -amilase
S. fibuligera R64 oleh Pichia pastoris.

Glick, B.R., Pasternak, J.J. 2003. Molecular biotechnology, principles and

applications of recombinant DNA. ASM Press (Washington DC). 163-173.

Hasan, K., Ismaya, W.T., Kardi, I., Andiyana, Y., Kusumawidjaya, S., Ishmayana, S.,
Subroto, T., and Soemitro, S. 2008. Proteolysis of -amylase from
Saccharomycopsis fibuligera: characterization of digestion products. Biologia.
63: 1044-1050.

Hashida, M., Bisgaard-Frantzen, H. 2000. Protein engineering of new industrial

amylase. Trends Glycosci. Glycotechnol. 12, 389-401

Hostinova, E. 2002. Amylolitic enzyme produced by the yeast Saccharomycopsis

fibuligera. Biologia Bratislava. 11, 247-251

Invitrogen, 2005. A manual of methods for expresion of recombinant proteins in

Pichia Pastoris. California. 7-10.

Ismaya, W. T., Setiana, T., Mulyana, B., Natalia, D., Soemitro, S. 2001. Stabilization
and protein engineering of -amylase from Saccharomycopsis fibuligera. The
First Symposium on -Amilase Family, Slovakia. 30 September-4 Oktober.

26
Ismaya, W.T., Hasan, K., Kardi, I., Zainuri, A., Rahmawaty, R.I., Permanahadi, S.,
Viera, B.V.E., Harinanto, G., Gaffar, S., Natalia, D., Subroto, T., Soemitro,
S.2013. Chemical Modification of Saccharomycopsis fibuligera R64α-
Amylase to Improve its Stability Against Thermal, Chelator, and Proteolytic
Inactivation, Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol 170, No.1, 44-57.
ISSN 0273-2289, DOI 10.1007/s12010-013-0164-8.

Ismaya, W. T., Setiana, T., Natalia, D., Soemitro, S. 2003. Peningkatan kestabilan
amilase melalui rekayasa protein. Laporan Hibah Bersaing IX. Departemen
Pendidikan Nasional

Paifer, E., Margolles, E., Cremata, J., Montesino, R., Herrera, L., Delgado, J. M. 1994.
Efficient expression and secretion of recombinat alpha amylase in Pichia
pastoris using two different signal sequences. Yeast. 10, 1415-1419.

Puspasari, F., Soemitro, S., Natalia, D. 2007. Produksi -Amilase dengan Kestabilan
Tinggi dalam Pichia pastoris. Laporan RUT XII. Kementrian Riset Dan
Teknologi.

Rydberg, E. H., Sidhu, G., Vo, H. C., Hewitt, J., Cote, H. C. F., Wang, Y., Numao, S.,
Macgillivray, R. T. A., Overall, C. M., Brayer, G. D., Withers, S. G. 1999.
Cloning, mutagenesis, and structural analysis of human pancreatic -amylase
expressed in Pichia pastoris. Protein Sci. 8, 635-643.

Shi-Hwei, L., Wei-I, C., Chia-Chin, S., Margaret Dah-Tsyr, C. 2005. Improved
secretory production of glucoamylase in Pichia pastoris by combination of
genetic manipulation. Biochem. Biophys. Res. Comm. 326, 817-824

Soemitro, S., Bahti, H. H., Adi, T. P, Thaurhesia, S., Hardjito, L., Niloperbowo, W.,
Wenten I. G. 1996. Produksi enzim pemecah pati. Laporan RUT I. Kementrian
Riset Dan Teknologi

Takano, K., Tsuchimora, K., Yamagata, Y., Yutani, K. 1999. Effct of foreign N-
terminal residues on the conformational stability of human lyzozyme. Eur. J.
Biochem. 266, 675-682.

27