LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

Oleh :
NI NYM AWIDIYA WIDNYANI (1420025001)
I GEDE YOGA ANDYKA (1420025026)
NI PUTU KARTIKA ARY PUTRI (1420025035)
MUHAMMAD ASYROVI ASSEGAF (1420025039)
NI KOMANG DESSY WINA SARI (1420025045)
NI MADYA MONITORING (1420025061)
NI NYOMAN INDIRA WULANDARI (1420025062)
DINDA TIOFANI TURNIP (1420025065)

PROGRAM STUDI ILMU KESEHATAN MASYARAKAT

FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS UDAYANA
2014
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Mikroorganisme atau mikroba adalah organisme yang berukuran sangat kecil sehingga
untuk mengamatinya diperlukan alat bantuan seperti mikroskop. Setiap sel tunggal
mikroorganisme memiliki kemampuan untuk melangsungkan aktivitas kehidupan antara lain
dapat dapat mengalami pertumbuhan, menghasilkan energi dan bereproduksi dengan sendirinya.
Karakteristik persyaratan pertumbuhan mikroba inilah yang menyebabkan bermacam-macamnya
media penunjang pertumbuhan mikroba.
Di dalam mikrobiologi, media diartikan sebagai bahan yang terdiri atas campuran nutrisi
atau zat-zat hara (nutrien) yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme di atas atau
didalamnya.Mikroorganisme memiliki fleksibilitas metabolisme yang tinggi karena
mikroorganisme ini harus mempunyai kemampuan menyesuaikan diri yang besar sehingga
apabila ada interaksi yang tinggi dengan lingkungan menyebabkan terjadinya konversi zat yang
tinggi pula.Akan tetapi karena ukurannya yang kecil, maka tidak ada tempat untuk menyimpan
enzim-enzim yang telah dihasilkan. Dengan demikian enzim yang tidak diperlukan tidak akan
disimpan dalam bentuk persediaan.enzim-enzim tertentu yang diperlukan untuk perngolahan
bahan makanan akan diproduksi bila bahan makanan tersebut sudah ada. Selain itu, media juda
dapat digunakan untuk isolasi, perbanyakan, pengujian sifat-sifat fisiologis dan biokimia, serta
perhitungan jumlah mikoorganisme.Mikroorganisme ini juga tidak memerlukan tempat yang
besar, mudah ditumbuhkan dalam media buatan, dan tingkat pembiakannya relative cepat
(Darkuni dalam Ali, 2008).Oleh karena aktivitasnya tersebut, maka setiap mikroorganisme
memiliki peranan dalam kehidupan, baik yang merugikan maupun yang menguntungkan.
Mikroorganisme terdapat dimana-mana, interaksinya dengan sesama mikroorganisme ataupun
dengan organsime lain dapat berlangsung dengan cara yang aman dan menguntungkan maupun
merugikan. Mikroorganisme cenderung diasosiasikan dengan penyakit-penyakit infeksi ataupun
pembusukan makanan.
1.2 Rumusan Masalah
1.2.1 Bagaimanakah prinsip kerja autoklaf dalam sterilisasi alat ?
1.2.2 Apakah manfaat pengenceran dan isolasi sampel mikroba?
1.2.3 Bagaimanakah hasil dari pengamatan dan perhitungan dan pada sampel lawar yang
telah diteliti ?

1.3 Tujuan Penelitian

Tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengetahui cara perhitungan mikroorganisme dengan
metode cat gram dan membandingkan jumlah koloni yang dapat tumbuh dari berbagai
ukuran pengenceran sampel lawar.

1.4 Manfaat Penelitian

Kami berharap dengan laporan praktikum ini dapat bermanfaat bagi para pembaca dan
pembaca juga dapat melakukan praktek penghitungan dan pengamatan mikroorganisme
dengan baik dan benar sesuai dengan cara yang telah ditentukan.
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Medium Pertumbuhan Mikroba

Medium adalah tempat untuk menumbuhkan mikroba.Mikroba memerlukan nutrisi untuk
memenuhi kebutuhan energy, bahan pembangun sel, dan sintesis protplasma serta bagian-
bagian sel lainnya.
Setiap mikroba mempunyai sifat fisiologis tertentu, sehingga memerlukan nutrisi tertentu
pula. Susunan kimia sel mikroba relative tetap, baik unsur kimia maupun senyawa yang
terkandung di dalam sel. Penyusun utama sel adalah C, H, O, N, dan P, yamg jumlahnya
sekitar 95% dari berat kering sel, sedangkan sisanya tersusun dari unsur-unsur lain yaitu air
80-90% dan bagian-bagian lain 10-20% terdiri dari protoplasma, dinding sel, lipida untuk
cadangan makanan, polisakarida, polifosfat, dan senyawa lain.
Campuran bahan-bahan (nutrient) yang digunakan untuk menumbuhkan, mengisolasi,
menguji sifat-sifat fisiologis dan menghitung jumlah mikrobia tersebut. Media yang
digunakan untuk menumbuhkan mikrobia dibagi atas 2 golongan berdasarkan komposisi
bahan penyusunnya yaitu:
1. Media sintesis: media yang tersusun atas senyawa yang diketahui komposisi
kimianya secara tepat. Media tersebut berisi garam anorganik
misalnya asam-asam amino, asam lemak, alkihol, karbohidrat atau
senyawa organik serta vitamin-vitamin.
2. Media non-sintetik: adalah media yang tidak di ketahui komposisi kimiawinya secara
pasti. Beberapa dari komposisi yang ditambahkan misalnya
ekstrak beef, ekstrak yeast, peptone, darah, serum, dan kasein
hidrolisat.Contoh media nonsintetik NA, NB, PDA.
Berdasarkan sifat media dibagi menjadi :
1. Media umum: media yang ditambahkan bahan-bahan yang bertujuan menstimulasi
pertumbuhan mikrobia secara umum. Contoh Nutrien Agar (NA) untuk menstimulasi
pertumbuhan bakteri, Potato Dextose Agar (PDA) untuk menstimulir pertumbuhan fungi.
2. Media diperkaya (enrichment media): media yang ditambahkan bahan-bahan tertentu
untuk menstimulasi pertumbuhan mikrobia yang jumlahnya sedikit dalam suatu
 campuran berbagai mikrobia contoh Chocolate media dan Yeast-Extract-potassium
Nitrate Agar.
3. Media selektif: merupakan media yang ditambahkan bahan-bahan tertentu yang akan
menghambat pertumbuhan mikrobia yang tidak diinginkan yang ada dalam suatu
specimen. Inhibitor yang digunakan berupa antibiotic, garam dan bahan-bahan kimia
lainnya.
4. Media diferensial: merupakan media yang ditambahkan bahan-bahan kimia atau
reagensia tertentu yang menyebabkan mikrobia yang tumbuh memperlihatkan perubahan-
perubahan spesifik sehingga dapat dibedakan dengan jenis lainnya.

Ada tiga jenis media pengembangbiakan berdasarkan konsentrasinya antara lain:

a) Media padat, yaitu media berbentuk padat yang mengandung agar 1-1,5% misalnya
nutrient agar
b) Media cair yaitu media yang berbentuk cair yang tidak mengandung agar, misalnya
nutrient broth
c) Media semi padat, yaitu media yang berbentuk padat pada suhu dingin, dan
berbentuk cair bila suhu panas, misalnya media SIM (media yang digunakan untuk uji
produksi sulfur, indiol, motilitas.

Fungsi-fungsi medium adalah sebagai berikut :

Media basal dapat mendukung pertumbuhan berbagai jenis spesies tanpa syarat
nutrisi
Media penghambat merupakan medium yang memuat unsur pokok tertentu yang
menghambat pertumbuhan dari jenis mikroorganisme tertentu.
Medium pemeliharaan digunakan untuk pertumbuhan awal dan penyimpanan
selanjutnya, mempersiapkan kultur organisme yang disimpan baik pada suhu ruang
atau suhu dingin (Singleton, dkk, 2001)

2.2 Inokulasi Mikroba

Penanaman bakteri atau biasa disebut juga inokulasi adalah pekerjaan memindahkan bakteri
dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang
sangattinggi.Untuk melakukan penanaman bakteri (inokulasi) terlebih dahulu diusakan
agarsemua alat yang ada dalam hubungannya dengan medium agar tetap steril, hal ini
agarmenghindari terjadinya kontaminasi (Dwijoseputro, 1998).
Ada beberapa metode yang digunakan untuk mengisolasi biakan murni mikroorganisme
yaitu :
Metode Gores
Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi
memerlukan ketrampilan-ketrampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan
yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum digoreskan di
permukaan media agar nutrien dalam cawaan petri dengan jarum pindah (lup
inokulasi). Di antara garis-garis goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah
sehingga dapat tumbuh menjadi koloni.
Cara penggarisan dilakukan pada medium pembiakan padat bentuk lempeng.Bila
dilakukan dengan baik teknik inilah yang paling praktis. Dalam pengerjaannya
terkadang berbeda pada masing-masing laboratorium tapi tujuannya sama yaiitu untuk
membuat goresan sebanyak mungkin pada lempeng medium pembiakan.
Metode tebar
Setetes inokolum diletakan dalam sebuah medium agar nutrien dalam cawan petridish
dan dengan menggunakan batang kaca yang bengkok dan steril. Inokulasi itu
disebarkan dalam medium batang yang sama dapat digunakan dapat menginokulasikan
pinggan kedua untuk dapat menjamin penyebaran bakteri yang merata dengan baik.
Pada beberapa pinggan akan muncul koloni koloni yang terpisah-pisah.
Metode Tuang
Isolasi menggunakan media cair dengan cara pengenceran. Dasar melakukan
pengenceran adalah penurunan jumlah mikroorganisme sehingga pada suatu saat hanya
ditemukan satu sel di dalam tabung (Winarni, 1997).
Metode Tusuk
Metode tusuk yaitu dengan dengan cara meneteskan atau menusukan ujung jarum ose
yang didalamnya terdapat inokolum, kemudian dimasukkan ke dalam media (Winarni,
1997).
2.3 Pewarnaan
Pewarnaan gram ini bertujuan untuk mlihat bakteri bersifat gram positif atau negatif dan
bentuknya.
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies
bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan
sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan
penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan
teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella
pneumoniae. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain)
ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi
berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan
kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :
Zat warna utama (violet kristal)
Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna
utama.
Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang
digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.
Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel -sel yang
telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.
a. Bakteri Gram Negatif
Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil
ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna
ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.
Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:
1. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
2. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat
didalam
3. lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak
mengandung asam tekoat.
4. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
5. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
6. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
7. Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
8. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat
9. Peka terhadap streptomisin
10. Toksin yang dibentuk Endotoksin
b. Bakteri Gram Positif
Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu
sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah
mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan
klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur
dinding sel bakteri (Aditya,2010).
Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:
1. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
2. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang
sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan.
Mengandung asam tekoat.
3. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
4. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
5. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
6. Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
7. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut
8. Tidak peka terhadap streptomisin
9. Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu
lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan
safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa
peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding
sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan
warna biru (Fitria, 2009).
Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama.
Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu
pendek (Fitria, 2009)
 BAB III
METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan di Lab Bersama Gedung Timur Fakultas Kedokteran Universitas
Udayana, Jl P.B. Sudirman

3.2 Rancangan Penelitian

Percobaan ini menggunakan metode penelitian dan kaji pustaka serta media elektronik.
Adapun dalam penelitian ini prosedur kerja yang dilakukan adalah sebagai berikut.

3.3 Alat dan Bahan

3.3.1 Sterilisasi
Adapun alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah :
1. 3-5 liter air
2. Alat atau bahan yang akan di sterilkan
3. Autoclave
3.3.2 Pengenceran
Adapun alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah :
1. Sampel lawar pepaya
2. Saline (NaCl 0,85%)
3. Eppendorf
4. Cawan Petri + Media
5. Tabung Reaksi
6. Pipet Ukur

3.3.3 Pengecatan Gram

Adapun alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah :
 Jarum ose
 Kaca Penutup
 Pembakar Spiritus
  Mikroskop
 Cawan Petri
 Baki
 Kaca Benda
 Koloni hasil isolasi
 Kristal violet
 Iodim
 Alkohol
 Salfranin
 Aquadest
 Alkohol
 Kapas

3.4 Langkah kerja

3.4.1 Sterilisasi
1. Isi chamber dengan air sampai permukaan atas air sedikit di atas permukaan
keranjang
2. Siapkan alat atau bahan yang akan disterilkan pada bagian rak autoclave
3. Masukkan alat dan bahan yang ada di dalam rak tersebut ke dalam bejana
autoclave
4. Panaskan autoclave ini dan biarkan semua udara yang ada di dalamnya
keluar (yang ditandai dengan keluarnya tetes-tetes air melalui klep udara
5. Tutup klep udara bila semua udara dalam autoclave sudah keluar
6. Pemanasan dilanjutkan sampai mencapai suhu 121oC dan tekanan 15 lbs,
selama 15 menit
7. Pemanasan dihentikan, suhu dikembalikan ke suhu kamar dan tekanan pada
titik 0
8. Jangan pernah mencoba membuka autoclave sebelum jarum penunjuk
tekanan menunjukkan pada angka 0 (nol). Karena sangat berbahaya
3.4.2 Pengenceran
1. Ambil sampel lawar kelapa sebanyak 1 gram
2. Tandai 5 eppendorf dengan 10-2, 10-3, …. 10-6
3. Masukkan sampel lawar kelapa ke dalam larutan saline 9 ml, kocok (vortext)
sampel sampai homogen, maka akan didapatkan hasil pengenceran pertama
sebesar 10 kali (10-1)
4. Ambil secara aseptic sebanyak 1 ml, kemudian dimasukkan ke dalam eppendorf
untuk mendapatkan factor pengenceran sebesar 100 kali (10-2)
5. Dari tabung ini juga ambil air sebanyak 1 ml sampel dan masukkan ke dalam
eppendorf kedua untuk memperoleh factor pengenceran sebanyak 1000 kali (10-3)
6. Begitu seterusnya dilakukan perlakuan yang sama terhadap eppendorf ke 3,4 dan
5.
7. Ambil hasil pengenceran 10-4,10-5 dan 10-6
8. Siapkan cawan petri kemudian ambil 1 ml dari ke 3 tabung tersebut dan tuangkan
ke dalam Petridis.
9. Campurkan media Na (Nutrian Agar) dengan suhu 45oC kemudian tuangkan ke
dalam Petridis
10. Letakkan Petridis pada bidang datar dan goyangkan perlahan-lahan sampai
membeku
11. Beri label kemudian simpan pada incubator selama 2 x 24 jam dengan posisi
terbalik
12. Bersihkan dan kembalikan alat dan bahan pada tempatnya.

3.4.3 Pengecatan Gram

 Membersihkan kaca objek dan kaca penutup dengan alkohol, melewatkan di atas
bunsen atau lampu spiritus beberapa kali.
 Secara aseptis mengambil 1 lup biakan padat Acetobacter xylinum dan S.
Aureus, meletakkan di atas kaca objek, meratakan seluas ± 2 cm, mengering
anginkan.
 Memfiksasi di atas nyala lampu spiritus beberapa kali, sehingga sel-sel bakteri
mati.
 Meneteskan 2-3 tetes larutan Gram A pada preparat dan mendiamkan selama 1
menit.
  Mencuci dengan air mengalir sampai cat tercuci semua, mengering anginkan.
 Meneteskan 2-3 tetes larutan Gram B dan mendiamkan selama 1 menit. Mencuci
dengan air mengalir sampai cat tercuci semua, mengering anginkan.
 Melunturkan dengan larutan Gram C sampai lapisan tampak pucat (± 30 menit),
dan langsung mencuci dengan air mengalir lalu mengering anginkan.
 Meneteskan cat penutup (Gram D) dan membiarkan selama 2 menit. Mencuci
dengan air mengalir dan mengering anginkan.
 Mengeringkan bagian bawah kaca objek dengan tissu, mengamati di bawah
mikroskop mulai dari perbesaran lemah, sedang dan kuat.
 Menggambar dan memberi keterangan bakteri yang tampak serta memperhatikan
bentuk, warna dan reaksi pengecatan.

3.5 Teknis Analisis Data

Pada penelitian ini digunakan teknik analisis deskriptif kualitatif dan analisis kuantitatif
 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Sterilisasi
Yang dimaksud sterilisasi dalam mikrobiologi adalah suatu proses untuk mematikan
semua organisme yang terdapat pada atau didalam suatu benda (Hadioetomo, 1993).Sterilisasi
alat–alat laboratorium untuk pengamatan mikroba sebelum digunakan adalah penting, cara yang
salah satu yang dapat digunakan adalah Autoclave.
Autoclave adalah cara sterilisasi dengan menggunakan uap bertekanan panas. Autoclave
merupakan sebuah alat yang terdiri atas suatu bejana yang tahan terhadap tekanan tinggi yang
dilengkapi manometer (barometer), termometer dan klab bahaya. Prinsip kerja alat ini sama
dengan prinsip kerja kukusan hanya saja memiliki tekanan sehingga menghasilkan panas yang
lebih tinggi.
Dalam sterilisasi yang menggunakan autoclave kita menggunakan suhu 121°C, ini
dikarenakan pada suhu ini mikroorganisme sudah mati.Pada sterilisasi alat dibutuhkan waktu 20–
30 menit.Pada waktu sterilisasi alat dan bahan terdapat perbedaan waktu, ini di karenakan besar
tekanan yang digunakan tergantung pada macam bahan dan alat yang disterilkan, sehingga
terjadi perpanjangan waktu pemanasan.
Autoklaf adalah alat sterilisasi yang memanfaatkan uap air panas bertekanantinggi dan
biasanya digunakan untuk mensterilisasi peralatan atau bahan ukur yangtahan panas dan tidak
rusak oleh panas (Sumarsih, 2010). Prinsip kerja autoklaf adalah memanfaatkan suhu diatas
120oC dan tekanan uap air 1,5 kg/cm2. Tekananyang digunakan pada umumnya 15 Psi atau
sekitar 2 atm dan dengan suhu 121oC(250oF). Lama sterilisasinya adalah 15 menit untuk suhu
121oC (Sunarmi danSaparinto, 2010). Faktor-faktor yang mempengaruhi sterilisasi uap ada 3
yaitu : waktu,suhu dan kelembaban (Stefanus, 2006).

4.2 Enumerasi dan Isolasi

Dalam praktikum ini dilakukan percobaan Analisis Kuantitatif Mikroba, dengan sampel
lawar kelapa.Sebelum melakukan perhitungan dilakukan pengenceran untuk memperkecil
jumlah suspensi mikroba. Terdapat dua cara dalam memperkecil jumlah suspensi mikroba, yaitu
metode hitungan cawan (Technique Plate Count/TPC) dan metode hitungan ”Most Probable
Number”/MPN.
Di dalam suatu populasi bakteri tidak semua sel mampu hidup terus, yang di
anggap sebagai sel hidup adalah sel yang mampu membentuk koloni di dalam agar biak atau
membentuk suspensi dalam larutan biak. Sel-sel yang mampu hidup terus inilah yang dihitung
dengan berbagai metode untuk menetapkan jumlah sel hidup
Banyak tersedia metode untuk menganalisa jumlah mikroorganisme dalam suatu
sampel, diantaranya adalah plate count (spread plate, pour plate, spiral plate), MPN,
menghitung langsung dengan Petroff Hausser ataupun cara lainnya (misalnya aktivitas
metabolik, turbidimetri, berat kering dll.). Namun dalam percobaan ini lebih ditekankan pada
metode yang memerlukan penghitungan koloni pada cawan petri.
Pemahaman tentang satuan dalam menghitung sel mikroba khususnya bakteri adalah
sangat penting. Pada hasil akhir penghitungan bakteri pada cawan digunakan satuan
CFU’s/volume atau berat. CFU’s adalah singkatan dari Coloni Forming Unit’s yang artinya unit-
unit / satuan pembentuk koloni, yang dimaksud satuan pembentuk koloni adalah sel tunggal atau
sekumpulan sel yang jika ditumbuhkan dalam cawan akan membentuk satu koloni tunggal.
Pada dasarnya sel tersebar homogen pada sampel, tetapi ada jenis bakteri yang memang
pembelahan selnya dapat terpisah baik sehingga tersebar merata tiap sel dan ada pula bakteri
yang setelah membelah sel anakan masih menempel pada induknya, seperti halnya yang terjadi
pada streptococcus, diplococcus, sarcina dll.sehingga penyebarannya berkelompok-kelompok.
Pada jenis yang seperti ini jika tersebar merata dalam kelompok-kelompok sel maka
pertumbuhan menjadi koloni tunggal bukan berasal dari satu sel saja melainkan dari beberapa
sel.
Beratus-ratus spesies mikroba dapat menghuni berbagai macam bagian tubuh kita, misal:
mulut, saluran pencernaan, kulit, dll. Sekali bersin dapat menyebarkan beribu-ribu
mikroorganisme.Satu gram kotoran manusia/hewan dapat mengandung jutaan bakteri.Udara, air,
tanah, juga dihuni oleh sekumpulan mikroorganisme.
Populasi mikroorganisme tersebut pada umumnya terdapat dalam populasi
campuran.Amat jarang mikroorganisme tersebut dijumpai sebagai satu spesies tunggal.Di sisi
lain, untuk mencirikan dan mengidentifikasikan suatu spesies mikroorganisme tertentu, yang
pertama harus dilakukan adalah memisahkannya dari organisme lain, hingga diperoleh biakan
murni. Biakan murni adalah biakan yang sel-selnya berasal dari pembelahan satu sel
tunggal.Proses pemisahan/pemurnian dari mikroorganisme lain perlu dilakukan karena semua
pekerjaan mikrobiologis, misalnya telaah dan identifikasi mikroorganisme, memerlukan suatu
populasi yang hanya terdiri dari satu macam mikroorganisme saja. Teknik tersebut dikenal
dengan Isolasai Mikroba. Terdapat berbagai cara mengisolasi mikroba, yaitu: 1) isolasi pada agar
cawan, 2) isolasi pada medium cair, dan 3) Isolasi sel tunggal. Dimana cara yang digunakan
dalam praktikum ini adalah isolasi pada agar cawan.
Prinsip pada metode isolasi pada agar cawan adalah mengencerkan mikroorganisme
sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari organisme lainnya.Setiap koloni
yang terpisah yang tampak pada cawan tersebut setelah inkubasi berasal dari satu sel tunggal.
Terdapat beberapa cara dalam metode isolasi pada agar cawan, yaitu: Metode gores kuadran, dan
metode agar cawan tuang Metode gores kuadran. Bila metode ini dilakukan dengan baik akan
menghasilkan terisolasinya mikroorganisme, dimana setiap koloni berasal dari satu sel.
Setelah diperoleh biakan murni (koloni yang berasal dari sel tunggal), mikroorganisme
tersebut siap dilakukan telaah dan identifikasi, dan kemudian ditumbuhkan sesuai tujuan.
Pertumbuhan pada mikroorganisme diartikan sebagai penambahan jumlah atau total massa
sel yang melebihi inokulum asalnya. Telah dijelaskan pada bahasan sebelumnya, bahwa sistem
reproduksi bakteri adalah dengan cara pembelahan biner melintang, satu sel membelah diri
menjadi 2 sel anakan yang identik dan terpisah. Selang waktu yang dibutuhkan bagi sel untuk
membelah diri menjadi dua kali lipat disebut sebagai waktu generasi. Waktu generasi pada setiap
bakteri tidak sama, ada yang hanya memerlukan 20 menit bahkan ada yang memerlukan sampai
berjam-jam atau berhari-hari.
Bila bakteri diinokulasikan ke dalam medium baru, pembiakan tidak segera terjadi tetapi
ada periode penyesuaian pada lingkungan yang dikenal dengan pertumbuhan. Kemudian akan
memperbanyak diri (replikasi) dengan laju yang konstan, sehingga akan diperoleh kurva
pertumbuhan. Pada kurva pertumbuhan dikenal beberapa fase pertumbuhan yaitu :
a) Fase lamban
Fase lamban merupakan periode awal dan merupakan fase penyesuaian diri (adaptasi),
sehingga tidak ada pertambahan jumlah sel bahkan kadang-kadang jumlah sel menurun.
b) Fase cepat
Fase cepat merupakan periode pembiakan yang cepat.Pada periode ini dapat teramati ciri-
ciri sel yang aktif.Waktu generasi pada setiap bakteri dapat ditentukan pada fase cepat
ini.Pada fase tersebut dapat terlihat beberapa sel mulai membelah, yang lainnya setengah
membelah, dan yang lainnya lagi selesai membelah.
c) Fase statis
Pada fase statis pembiakan mulai berkurang dan beberapa sel mati. Apabila laju pembiakan
sama dengan laju kematian, maka secara keseluruhan jumlah sel tetap konstan. Hal ini dapat
disebabkan karena berkurangnya nutrien ataupun terbentuknya produk metabolisme yang
cenderung menumpuk mungkin menjadi racun bagi bakteri yang bersangkutan.
d) Fase kematian
Fase kematian merupakan fase dimana proses pembiakan telah berhenti. Sel-selnya sudah
mati, yang kemudian akan diikuti dengan proses lisis. Apabila laju kematian melampaui laju
pembiakan, maka jumlah sel sebenarnya menurun.

4.3 Pengecatan Gram

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak
digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah
awal identifikasi.Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di
dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri.Jenis bakteri
berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif.Bakteri
gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis.Sedangkan baktri gram
negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Manurung,
2010).
Penambahan violet pada bakteri.Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu.
Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada
mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel
mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang
transparan akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan
meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada
bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri.Bakteri gram positif
mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan
dinding selnya tipis.Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar cat
atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.
Penambahan lugol pada bakteri.Lugol merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang
berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan
warna utama. Pemberian lugol pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat
pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat lugol terperangkap antara dinding sel dan membran
sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme
gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Lugol yang diteteskan
didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih
kuat.
Selanjutnya, 1 tetes alkohol diteteskan di atas objek glass tersebut kemudian didiamkan
selama 10 detik.Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air hingga warnanya hilang.Etanol
merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan
kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung
pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak
akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna
akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua
kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi
tidak berwarna. Pemberian alkohol juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar
permeabilitas dinding sel.
Selanjutnya diteteskan 1 tetes safranin di atas kaca objek tersebut kemudian didiamkan
selama 5 detik.Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air hingga warnanya hilang.Safranin
merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder.Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali
sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata
lain, safranin memberikan warna pada mikroorganisme non target serta menghabiskan sisa-sisa
cat atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi
berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya
terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan
membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.
 Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna lain dengan
waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut dapat berikatan dengan
komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian zat
warna yang satu ke yang lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung
cepat.
Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap kaca
objek dengan menggunakan air.pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap zat
warna yang sedang diberikan. Setiap akhir pembilasan pada masing-masing reagen, perlu
dilakukan penyerapan air bilasan dari air dengan menggunakan kertas tissu agar aquades tidak
tercampur dengan reagen atau pewarna baru yang akan diberikan. Setelah pembilasan terakhir,
gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika terbentuk warna ungu maka
termasuk golongan bakteri gram positif , dan jika terbentuk warna merah atau merah muda maka
termasuk golongan bakteri gram negatif.
Pada percobaan pengecatan gram terhadap biakan bakteri yang terkandung dalam lawar
kelapa, ditemukan adanya bakteri jenis gram positif karena dari percobaan warna yang
menempel atau melekat pada bakteri adalah warna hasil ungu bukan merah. Bakteri yang diamati
dalam praktikum ini dapat dilihat dengan jelas pada mikroskop dengan pembesaran
100x.Dimana bakteri tersebut berwarna ungu dan berbentuk filamen-filamen.

Adapun Hasil Praktikum yang diperoleh adalah sebagai berikut:

1. Hasil penghitungan jumlah bakteri
No Sampel Pengenceran Jumlah Koloni
1 10-4 104
Lawar kelapa
2 10-5 31
3 10-6 14

2. Cara Penghitungan :
Rumus: ∑ per gr = ∑ koloni x 10 x 1/FP (Faktor Pengencer)

1. Diketehui :
Jumlah koloni : 104
 Faktor Pengencer : 10-4
Jawab :
Rumus: ∑ per gr = ∑ koloni x 10 x 1/FP (Faktor Pengencer)
∑ per ml = 104 x 10 x 1/10-4
= 104 x 105 CFU/gr
= 10,4 x 106 CFU/gr
2. Diketehui :
Jumlah koloni : 31
Faktor Pengencer : 10-5
Jawab :
Rumus: ∑ per gr = ∑ koloni x 10 x 1/FP (Faktor Pengencer)
∑ per ml = 31 x 10 x 1/10-5
= 131 x 106 CFU/gr
= 13,1 x 107 CFU/gr
3. Diketehui :
Jumlah koloni : 14
Faktor Pengencer : 10-6
Jawab :
Rumus: ∑ per gr = ∑ koloni x 10 x 1/FP (Faktor Pengencer)
∑ per ml = 14 x 10 x 1/10-6
= 14 x 107 CFU/gr
 BAB V
PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang sudah dilaksanakan dapat disimpulkan beberapa hal sebagai
berikut:
1. Dalam melaksanakan praktikum harus keadaan steril. Alat-alat harus di sterilisasi sebelum
penggunaan
2. Perlu dilakukan pengenceran dan inkubasi mikroba sebelum melakukan penghitungan koloni.
3. Koloni yang tumbuh pada agar cawan dapat dibedakan berdasarkan besarnya, warna
penampakan apakah keruh atau bening, bentuk penyebarannya atau margin dan bentuk
kemunculannya di atas agar dan bentuk permukaan.

5.2 Saran
Untuk mendapatkan hasil praktikum yang baik diharapkan kepada semua praktikan
datang tepat waktu, mengikuti praktikum sesuai dengan arahan dari co. assisten dan tata tertib
yang ada dan memperhatikan keselamatan kerja selama kegiatan praktikum berlangsung.
DAFTAR PUSTAKA

Hucker, George J., and Harold Joel Conn. "Methods of Gram staining." (1923).
Sujaya, I. N. Penuntun Praktikum Mikrobiologi. Denpasar: Universitas Udayana.(2014)
Hadioetomo, Ratna Siri. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek.Jakarta : PT Gramedia
Pustaka Utama