Identifikasi Beragam Kelelawar Alphacoronavirus dan Betacoronavirus di Tiongkok Memberi Wawasan

Baru ke dalam Evolusi dan Asal Usul Penyakit Terkait Coronavirus

Yelin Han1 †, Jiang Du1 †, Haoxiang Su1, Junpeng Zhang2, Guangjian Zhu3, Shuyi Zhang2, Zhiqiang Wu1
* dan Qi Jin1 *

1 Laboratorium Kunci NHC Sistem Biologi Patogen, Institut Biologi Patogen, Akademi Ilmu Kedokteran
Tiongkok dan Perguruan Tinggi Kedokteran Peking Union, Beijing, Cina, 2 Laboratorium Kunci Zoonosis
Provinsi Liaoning, Sekolah Tinggi Ilmu Hewan dan Kedokteran Hewan, Universitas Pertanian Shenyang ,
Shenyang, China, 3 EcoHealth Alliance, New York, NY, Amerika Serikat

Wabah sindrom pernafasan akut yang parah (SARS) pada tahun 2002, sindrom pernafasan Timur Tengah
pada tahun 2012 dan sindrom diare akut babi pada tahun 2017 menyebabkan penyakit menular yang
serius pada manusia dan ternak, mengakibatkan ancaman kesehatan masyarakat yang serius dan
kerugian ekonomi yang sangat besar. Semua coronaviruses (CoVs) tersebut dipastikan berasal dari
kelelawar. Untuk terus memantau CoV terkait epidemi pada kelelawar, analisis virome digunakan untuk
mengklasifikasikan CoV dari 831 kelelawar dari 15 spesies di Provinsi Yunnan, Guangxi, dan Sichuan
antara Agustus 2016 dan Mei 2017. Kami mengidentifikasi 11 galur CoV dari 22 sampel individu dari
empat sampel empat spesies kelelawar. Identifikasi empat alpha-CoV dari Scotophilus kuhlii di Guangxi,
yang terkait erat dengan CoV kelelawar yang dilaporkan sebelumnya dan virus diare epidemi babi
(PEDV), mengungkapkan garis keturunan kelelawar-babi di bawah genus Alphacoronavirus. CoV
rekombinan menunjukkan bahwa PEDV mungkin berasal dari CoV S. kuhlii. Alpha-CoV lain, α-YN2018,
dari Rhinolophus affinis di Yunnan, menyarankan bahwa garis keturunan alpha-CoV ini memiliki asal
beberapa inang, dan α-YN2018 telah bergabung kembali dengan CoV dari spesies kelelawar lainnya dari
waktu ke waktu. Kami mengidentifikasi lima CoV terkait SARS (SARSr-CoVs) pada kelelawar Rhinolophus
dari Sichuan dan Yunnan dan mengkonfirmasi bahwa enzim yang mengubah angiotensin 2 yang dapat
digunakan SARSr-CoVs terus beredar di Rhinolophus spp. di Yunnan. Beta-CoV lainnya, strain β-GX2018,
yang ditemukan di Cynopterus sphinx dari Guangxi, mewakili garis keturunan yang berevolusi secara
independen berbeda dari CoV yang dikenal sebagai kelelawar Rousettus dan Eonycteris. Identifikasi
beragam CoV di sini menyediakan data genetik baru untuk memahami distribusi dan sumber CoV
patogen di Cina.

Coronaviruses (CoVs) adalah sekelompok virus yang diselimuti dengan genom RNA untai tunggal positif
besar (panjang ∼26-32 kb) dari subfamili Coronavirinae di bawah keluarga Coronaviridae. Genom
lengkap CoV berisi lima bingkai pembacaan terbuka utama (ORFs) yang mengkodekan replikasi
poliprotein (ORF1ab), spike glikoprotein (S), protein amplop (E), protein membran (E), protein membran
(M), dan protein nukleokapsid (N) diapit oleh 50 - wilayah yang tidak diterjemahkan (UTR) dan 30 - UTR.
Saat ini, anggota subfamili Coronavirinae diklasifikasikan menjadi empat genus, Alphacoronavirus,
Betacoronavirus, Gammacoronavirus, dan Deltacoronavirus (Fehr dan Perlman,
2015; Su et al., 2016). CoVs dapat menyebabkan penyakit pernapasan bagian atas dan bawah,
gastroenteritis, dan infeksi sistem saraf pusat pada beragam inang unggas dan mamalia. Beberapa CoV
adalah patogen manusia yang menyebabkan penyakit ringan hingga berat, termasuk NL63 dan 229E dari
genus Alphacoronavirus, dan CoV sindrom pernapasan akut (SARS-CoV), CoV sindrom pernapasan Timur
(MERS-CoV), OC43, dan HKU1 dari genus Betacoronavirus (Dijkman dan van der Hoek, 2009; Desforges
et al., 2014; van den Brand et al., 2015; Lim et al., 2016). Pandemi SARS berasal dari Provinsi Guangdong
di Cina antara tahun 2002 dan 2003, dan menyebar ke 29 negara, mengakibatkan hampir 8.000 kasus
dan 800 kematian di seluruh dunia (Donnelly et al.,
2004). Sejak ditemukan di negara-negara Timur Tengah di Indonesia
2012, MERS-CoV telah menginfeksi 2.260 orang dengan kematian saat ini
tingkat 35,5% (Mackay dan Arden, 2015; van den Brand et al.,
2015; de Wit et al., 2016).
Dengan ditemukannya beragam CoV yang ditularkan oleh margasatwa di berbagai tempat
wilayah di dunia, penelitian sebelumnya telah menunjukkan kelelawar itu
adalah reservoir alami utama dan asli dari Alphacoronavirus
dan Betacoronavirus (Calisher et al., 2006; Woo et al., 2012).
Sistem metabolisme dan kekebalan khusus memungkinkan kelelawar
mentolerir beragam virus, dan perilaku bertengger sosial
banyak spesies kelelawar memungkinkan mereka berfungsi sebagai inkubator yang ideal untuk
sering terjadi koinfeksi, rekombinasi, dan intra-infeksi
penularan spesies CoV (Zhang et al., 2013; O'Shea et al.,
2014; Hu et al., 2015; Lu et al., 2015; Sola et al., 2015). Meskipun
15 tahun telah berlalu tanpa terulangnya wabah SARS,
penemuan konsisten CoV terkait SARS (SARSr-CoVs)
pada Rhinolophus, kelelawar menunjukkan risiko berkelanjutan akibat SARS.
Munculnya (Li et al., 2005; Balboni et al., 2012; Yang et al.,
2013; Wu et al., 2016b; Hu et al., 2017). Baru-baru ini, sebuah CoV dari
Asal kelelawar Rhinolophus, sindrom diare babi akut CoV
(SADS-CoV), ditemukan bertanggung jawab atas kematian
24.693 anak babi di empat peternakan di Provinsi Guangdong (Zhou
et al., 2018). Selain tanda-tanda klinis yang serupa, wabah
SADS bertepatan dengan infeksi oleh CoV enterik babi lainnya,
virus diare epidemi babi (PEDV; Zhou et al., 2018). Itu
Perlu disebutkan bahwa kelelawar terkait PEDV CoV, BtCoV / 512,
sebelumnya diidentifikasi dalam kelelawar Scotophilus kuhlii (Tang et al.,
2006; Wang et al., 2016; Gerdts dan Zakhartchouk, 2017; Zhou
et al., 2018). Semua temuan ini menekankan pentingnya
pemantauan berkelanjutan untuk keanekaragaman ekologis CoV pada kelelawar
meminimalkan dampak potensi penyakit terkait CoV pada masyarakat
pertumbuhan kesehatan dan ekonomi.

Sebagai situs asli epidemi SARS pada manusia dan wabah SADS pada babi (Heymann et al., 2013),
Provinsi Guangdong juga merupakan wilayah utama di Tiongkok di mana satwa liar dikonsumsi. Karena
pasokan satwa liar untuk konsumsi di Guangdong sebagian besar berasal dari Provinsi Yunnan dan
Guangxi (Wu et al., 2016b), memahami keberadaan dan perubahan dinamis dalam CoV kelelawar terkait
SARS atau SADS di dalam dan di antara provinsi-provinsi ini penting untuk memprediksi dan melacak
penyakit terkait CoV. Sichuan berada di sebelah Provinsi Yunnan, dan memiliki keanekaragaman ekologi
sumber daya hewan yang tinggi, dan merupakan provinsi peternakan babi terbesar di Cina. Meskipun
penyakit babi yang berhubungan dengan PEDV telah dilaporkan sebelumnya (Cai et al., 2016), tidak ada
survei sistematis tentang CoV yang ditularkan kelelawar telah dilakukan di Sichuan untuk mengetahui
apakah ada COV yang terkait dengan SARS atau SADS.
Dalam studi ini, sebuah survei tentang CoV yang ditularkan kelelawar dilakukan pada kelelawar di
provinsi Guangxi, Yunnan, dan Sichuan antara 2016 dan 2017. Sampel dari kelelawar Rhinolophus di
Provinsi Sichuan dan Yunnan, dan S. kuhlii dan Cynopterus sphinx di Provinsi Guangxi ditemukan
menjadi CoV-positif, dan sejumlah besar pembacaan sekuensing diklasifikasikan ke dalam beragam alfa
dan beta-CoV diperoleh dengan menggunakan analisis virome. Karakterisasi
11 CoVs dalam kelelawar dari berbagai daerah menyediakan petunjuk untuk hubungan evolusi PEDV,
SARS-CoV, dan CoV terkait kelelawar lainnya.

BAHAN DAN METODE Pengambilan sampel Bat

Kelelawar diperlakukan sesuai dengan pedoman Peraturan untuk Administrasi Hewan Laboratorium
(Keputusan No.
2 dari Komisi Sains dan Teknologi Negara Republik Rakyat Tiongkok, 1988). Pengambilan sampel
disetujui oleh Komite Etik dari Institut Biologi Patogen, Akademi Ilmu Kedokteran Cina & Peking Union
Medical College (Nomor persetujuan: IPB EC20100415). Spesies kelelawar awalnya ditentukan secara
morfologis dan kemudian dikonfirmasi oleh analisis urutan DNA sitokrom b mitokondria (Tang et al.,
2006; Du et al., 2016). Sampel swab anal dari kelelawar yang ditangkap direndam dalam tabung
pengambilan sampel virus (Yocon, China) yang mengandung media pemeliharaan dan disimpan
sementara di −20◦ C. Sampel kemudian diangkut ke laboratorium dan disimpan di −80◦ C. Lokasi
pengambilan sampel yang akurat adalah direkam dengan nama tempat, lintang, dan bujur.

Konstruksi Perpustakaan DNA dan RNA dan Urutan Generasi Selanjutnya

Sampel masing-masing spesies dikumpulkan dengan menambahkan 1 ml dari masing-masing sampel
media pemeliharaan ke dalam satu tabung sampel baru. Sampel dikumpulkan, diklasifikasikan
berdasarkan spesies, diproses dengan metode pemurnian asam nukleat yang dilindungi oleh virus-
partikel seperti yang dijelaskan dalam penelitian kami sebelumnya (Wu et al., 2012, 2016a, 2018).
Sampel dihomogenisasi dan selanjutnya disaring melalui a
0,45 μm filter polivinilidena difluorida (Millipore, Jerman). Sampel yang disaring kemudian disentrifugasi
pada 150.000 × g selama 3 jam pada 4◦ C. Untuk menghilangkan DNA dan RNA telanjang, pelet dicerna
dalam campuran enzim DNase dan RNase. DNA virus dan

RNA secara bersamaan diisolasi menggunakan QIAmp MinElute Virus Spin Kit (Qiagen, Amerika Serikat).
CDNA viral strand pertama disintesis menggunakan primer K-8N dan sistem Superscript III (Invitrogen,
Amerika Serikat). CDNA diubah menjadi dsDNA oleh fragmen Klenow (NEB, Amerika Serikat). Amplifikasi
PCR independen urutan dilakukan menggunakan primer K. Produk PCR dianalisis dengan elektroforesis
gel agarosa. Semua noda DNA yang lebih besar dari 500 bp diekstraksi dengan Kit Ekstraksi MinElute Gel
(Qiagen). Perpustakaan asam nukleat yang diekstraksi kemudian dianalisis menggunakan sequencer
Illumina HiSeq2500, untuk pembacaan tunggal 100 bp. Urutan membaca disaring menggunakan kriteria
yang dijelaskan sebelumnya (Wu et al., 2012, 2016a, 2018). Bacaan tanpa situs panggilan, bacaan
dengan kemiripan dengan adaptor sekuensing dan urutan primer K, bacaan duplikat, dan bacaan dengan
kompleksitas rendah dihilangkan.

Penugasan Taksonomi
Penugasan taksonomi berbasis urutan-kesamaan dilakukan seperti yang dijelaskan dalam penelitian
kami sebelumnya (Wu et al.,
2012). Pembacaan urutan yang valid diselaraskan dengan urutan dalam database nukleotida non-
redundan NCBI dan database protein non-redundan menggunakan BLASTn dan BLASTx, masing-masing.
Taksonomi bacaan yang selaras dengan skor BLAST terbaik (skor E <10− 5) diuraikan oleh MEGAN 6 -
MetaGenome Analyzer.

Prevalensi dan Genom Virus

Pengurutan
Penyaringan CoV dari masing-masing sampel dilakukan dengan memperkuat fragmen 440-bp dari gen
RNA-dependent RNA polimerase (RdRp) dari CoV menggunakan primer yang dilestarikan (50 -
GGTTGGACTACTCCTAAGTGTGA-30 dan 50 -CCAT ATCAGATAGAATCATCATA-30), seperti yang dijelaskan
sebelumnya (Du et al., 2016).
Urutan membaca yang diklasifikasikan ke dalam genus virus yang sama diekstraksi. Lokasi pembacaan
yang akurat ditentukan berdasarkan hasil penyelarasan yang diekspor dengan MEGAN 6. Primer spesifik
dirancang dari urutan bacaan yang terletak. Fragmen antara pembacaan diperkuat dengan primer
spesifik bersarang dan kemudian diurutkan. Urutan genomik yang tersisa ditentukan menggunakan
amplifikasi ujung cDNA 50 - dan 30 - cepat.

Filogenetik dan Rekombinasi

Analisis
MEGA6.0 digunakan untuk menyelaraskan urutan nukleotida dan menyimpulkan urutan asam amino
menggunakan paket MUSCLE dan parameter default. Model substitusi terbaik kemudian dievaluasi oleh
paket Pemilihan Model. Akhirnya, kami membangun metode kemungkinan maksimum menggunakan
model yang sesuai untuk memproses analisis filogenetik dengan 1.000 ulangan bootstrap. Rekombinasi
di antara CoV terdeteksi dengan perangkat lunak SimPlot. Semua analisis dilakukan dengan model
Kimura, ukuran jendela 1000 bp, dan ukuran langkah 100 bp.

Aksesi Urutan Nukleotida

Angka
Semua urutan genom diserahkan ke GenBank. Nomor aksesi untuk lima bat alpha-CoV adalah
MK211369 hingga MK211373. Nomor aksesi untuk enam kelelawar beta-CoV adalah MK211374 hingga
MK211379.

HASIL

Analisis Virome dan Prevalensi CoV Penyeka dubur dari 831 kelelawar dari 15 spesies dikumpulkan dari
Provinsi Yunnan, Guangxi, dan Sichuan di Cina antara Agustus 2016 dan Mei 2017. Semua sampel usap
dubur diklasifikasikan berdasarkan spesies dan kemudian digabungkan ke dalam 27 kumpulan dan
menjadi sasaran analisis virome. Pembacaan sequencing terkait CoV terdeteksi di sepuluh dari 27
kumpulan sampel. 10 kolam ini terkait dengan
22 Rhinolophus spp. sampel dari Sichuan, 176 Rhinolophus
sampel affinis dari Yunnan, 150 sampel S. kuhlii dari
Guangxi, dan 30 sampel C. sphinx dari Guangxi. Pan CoV
skrining mengungkapkan bahwa 22 sampel individu adalah CoV-positif
(Tabel 1 dan Gambar 1). Sebanyak 1.040.901 bacaan 100 bp
panjangnya menunjukkan kecocokan terbaik dengan virus Coronavirinae
protein dalam database non-berlebihan NCBI, dan ini berbunyi
menunjukkan 40-100% asam amino (aa) identitas dengan alfa yang dikenal
atau beta-CoVs.
Sebelas virus dari sampel positif yang representatif adalah
dipilih untuk sekuensing genom sebagai spesies kuasi. Sana
lima virus dalam genus Alphacoronavirus; empat
dari S. kuhlii di Provinsi Guangxi dinamai BtSk-
AlphaCoV / GX2018A (α-GX2018A), BtSk-AlphaCoV / GX2018B
(α-GX2018B), BtSk-AlphaCoV / GX2018C (α-GX2018C), dan
BtSk-AlphaCoV / GX2018D (α-GX2018D). Virus lainnya
dari R. sinicus di Provinsi Yunnan dinamai BtRs-
AlphaCoV / YN2018 (α-YN2018). Ada enam CoV di dalamnya
genus Betacoronavirus. Virus diidentifikasi dari Rhinolophus
spp. di Provinsi Sichuan dinamai BtRl-BetaCoV / SC2018
(β-SC2018); empat CoVs dari R. sinicus di Provinsi Yunnan
diberi nama sebagai BtRs-BetaCoV / YN2018A (β-YN2018A), BtRs-
BetaCoV / YN2018B (β-YN2018B), BtRs-BetaCoV / YN2018C
(β-YN2018C), dan BtRs-BetaCoV / YN2018D (β-YN2018D).
Satu CoV dari C. sphinx di Provinsi Guangxi dinamai sebagai
BtCs-BetaCoV / GX2018 (β-GX2018).

Organisasi Genom
Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2 dan Gambar 2, dengan organisasi genom yang khas, ukuran
genom penuh dari 11 CoV berkisar dari
28, 146 (α-GX2018C) hingga 30, 256 basis (β-YN2018B) dan konten G + C-nya berkisar antara 0,38 hingga
0,41. Ada beberapa ORF aksesori di setiap galur CoV. ORF aksesori ini terutama ada di daerah antara S
dan E (bernama ORFs-e), M dan N (bernama ORFm-n), atau hilir N (bernama ORFn). ORF aksesori dari α-
GX2018 (A– D), α-YN2018, dan β-GX2018 terutama terdapat di wilayah ORFs-e dan ORFm-n; ORF kecil β-
SC2018 dan

β-YN2018 (A – D) terutama hadir di daerah ORFs-e dan ORFm. Kami menamai ORF aksesori ini menurut
penelitian sebelumnya.
Seperti ditunjukkan pada Tabel 3, Urutan inti dari urutan peraturan transkripsi pemimpin (TRS; 50 -
CUAAAC-30) diidentifikasi dalam 50 urutan yang tidak diterjemahkan dari α-GX2018 (A – D) dan α-
YN2018, yang unik untuk Alphacoronavirus (Madhugiri et al., 2014). Motif TRS dari gen S, ORF3, E, dan
M pada α-GX2018 (A-D) berbeda dari urutan inti dari pemimpin TRS (Tabel Tambahan 1). Motif TRS dari
S diidentifikasi sebagai 50 -CCAAAU-30 atau 50 -CCAAAC-30; motif TRS ORF3 diidentifikasi sebagai 50 -
CAUUAC-30; motif TRS dari E diidentifikasi sebagai 50 -CUAGAC-30; motif TRS dari M diidentifikasi
sebagai 50 -AUAAAC-30. Motif TRS alternatif (50 -GUAAAC-30) dari α-YN2018 ditemukan sebelum ORF3,
yang berbeda dengan 1 nukleotida (nt) dari gen-gen lain di α-YN2018. Selain E dari β-GX2018, motif TRS
dari enam betacoronavirus semuanya

sesuai dengan motif konsensus 50 -ACGAAC-30, yang unik untuk Betacoronavirus (Woo et al., 2010).
Motif TRS alternatif (50 -UCGAAC-30) ditemukan sebelum E dalam β-GX2018.

Analisis Kesamaan Urutan

Empat Alpha-CoV dari S. kuhlii di Provinsi Guangxi
Empat alpha-CoV diidentifikasi dari S. kuhlii. Genom panjang penuh dari strain α-GX2018A, B, C, dan D
diurutkan. Kesamaan urutan genom di antara keempat CoVs ini, PEDV, dan BtCoV / 512 diperiksa
dengan analisis Simplot (Gambar 3A) dan perataan berpasangan (Tabel Tambahan 2). Α-GX2018A, B, dan
C terkait erat dengan CoV yang diketahui, BtCoV / 512, diidentifikasi di S. kuhlii Provinsi Hainan dengan
96,9-100% identitas aa untuk ORF1b, ORF3, E, M, dan N. Perbedaannya terutama terjadi pada S (93,4-
96,1% identitas) dan ORFx (65,7-67,6% identitas). Ada juga perbedaan signifikan antara α-GX2018A dan
B dan BtCoV / 512 di ujung depan ORF1a

(1000–2500 nt) dengan identitas 81,3–82% nt. Selain itu, meskipun α-GX2018D terkait erat dengan
BtCoV / 512 dengan
92.2–99.4% identitas untuk ORF1a, ORF1b, ORF3, dan M, tidak terduga bahwa identitas aa-GX2018D
dan BtCoV / 512 di wilayah S1 adalah 39,7%, yang lebih rendah daripada α-GX2018D dan PEDV ( 42,7%
aa identitas). Meskipun identitas a-GX2018D dan PEDV di wilayah S1 hanya 42,7%, kami belum
menemukan virus yang dikenal dengan identitas lebih tinggi dari ini.

Novel Alpha-CoV dari R. affinis di Provinsi Yunnan

Novel alpha-CoV (α-YN2018) diidentifikasi dalam R. affinis dari Provinsi Yunnan. Kesamaan urutan
genom antara α-YN2018, BtRf-alphaCoV / HuB2013 (α-HuB2013), kelelawar Hipposideros CoV HKU10
(Hi-batCov HKU10), Kelelawar Rousettus CoV HKU10 (Ro-BatCoV HKU10), dan Cardioderma / 2006 (Ca-
batCov / Kenya) diperiksa dengan analisis Simplot (Gambar 3B) dan perataan berpasangan (Tabel
Tambahan 3). Virus ini menunjukkan kesamaan urutan yang rendah dengan alpha-CoV yang diketahui.
α-YN2018

menunjukkan kemiripan urutan tertinggi dengan α-HuB2013 dari Rhinolophus ferrumequinum dengan
63,9-92,4% identitas di ORF1a, ORF1b, dan N; untuk Hi-batCov HKU10 dengan 50-85,7% identitas di S,
M, dan ORF7b; ke Ca-batCov / Kenya di ORF3a dengan
60,6% identitas; dan untuk Ro-BatCoV HKU10 di E dengan 74,3% identitas. Urutan ORF7a dari α-YN2018
menunjukkan <25% identitas dengan orang-orang dari CoVs yang disebutkan sebelumnya. Selain itu,
kami tidak menemukan urutan yang mirip dengan ORF3b dan ORF3c dari α-YN2018 dari virus yang
dikenal. Menurut kriteria ICTV, CoV yang berbagi <90% identitas urutan dalam domain replikasi
dilestarikan dianggap milik spesies yang berbeda; dengan demikian, α-YN2018 dapat dianggap sebagai
spesies baru di bawah genus Alphacoronavirus.

Lima Beta-CoVs dari Rhinolophus spp. Dari Provinsi Sichuan dan Yunnan
Kami memperoleh lima beta-CoV dari Rhinolophus spp. dari Provinsi Yunnan dan Sichuan, yang dinamai
β-YN2018A, β-YN2018B, β-YN2018C, β-YN2018D, dan β-SC2018. Semua

beta-CoV ini memiliki identitas urutan tinggi dengan SARSr-CoVs. Kelima SARSr-CoV ini menunjukkan 92-
97% nt identitas dengan manusia SARS-CoV SZ3. Kesamaan urutan genom antara lima strain SARSr-CoVs
dan SARS-CoV SZ3 diperiksa dengan analisis Simplot (Gambar 3C). Kelima SARSr-CoV ini sangat
dilestarikan dan memiliki kesamaan urutan yang sama tinggi dengan SARS-CoV dengan 94,2-100%
identitas di ORF1a, ORF1b, E, M, dan N (Tambahan Tabel 4). Ada beberapa perbedaan antara SARSr-
CoVs dan SARS-CoV SZ3 di wilayah pengkodean ORF3a, ORF3b, ORF7a, dan ORF7b. Setelah analisis lebih
lanjut, pihak

SARS-CoV SZ3 menunjukkan kemiripan urutan tertinggi dengan β-YN2018B dengan 92-96% identitas di
S, ORF3a, dan ORF3b; dan untuk β-YN2018A dengan 93.2–95.9% identitas dalam ORF7a dan ORF7b.
Sebaliknya, keragaman genetik yang cukup besar ditunjukkan dalam S (72,9-92,4% identitas) dan ORF8
(32,6–
34,1% aa identitas) di antara lima strain SARSr-CoVs dan SARS-CoV SZ3.
β-YN2018B berbagi 98,8% identitas dengan SARSr-CoV WIV1, yang lebih tinggi dari empat SARSr-CoV
lainnya (78,8–
79,1% aa identitas) (Gambar 3C dan Tabel Tambahan 4). Hebatnya, WIV1 dan WIV16 (atau Rs4874)
diidentifikasi

antara 2012 dan 2013, dan mereka dapat menggunakan reseptor angiotensin converting enzyme II
(ACE2) manusia untuk masuk, seperti SARS-CoV (Ge et al., 2013; Yang et al., 2015).
ORFx juga ditemukan dalam genom β-YN2018B dan β-YN2018D. ORFx dari β-YN2018B dan β-YN2018D
keduanya berbagi 98,8% identitas dengan WIV1. Kecuali untuk ORF3b (95,6% aa identitas), β-YN2018B
sangat dilestarikan dan berbagi kesamaan urutan tinggi seragam dengan SARS-CoV WIV1 di setiap ORF
(98,2-100% aa identitas) (Tambahan Tabel 4).

Novel Beta-CoV dari C. sphinx di Provinsi Guangxi

Beta-CoV novel, β-GX2018, diidentifikasi dari spesies kelelawar ini. Kesamaan urutan genom antara β-
GX2018 dan empat CoV yang dikenal, BatCoV HKU9-4, BatCoV HKU9-
10-1, Ro-BatCoV HKU9, dan BatCoV Philippines / Diliman diperiksa dengan analisis Simplot (Gambar 3D)
dan perataan berpasangan (Tambahan Tabel 5). Urutan genom lengkap dari virus ini memiliki urutan
kemiripan dengan yang ada pada CoU Kelelawar Rousettus yang terkait dengan HKU9 dan CoV terkait
Kelelawar Eonycteris yang terkait dengan GCCDC1 (Woo et al., 2007; Huang et al., 2016), tetapi identitas
urutan di antara mereka rendah. Kesamaan urutan antara β-GX2018 dan terkait HKU9- dan GCCDC1

CoV adalah 51-90,8% identitas dalam ORF1a, ORF1b, S, ORF3, E, M, dan N. Beberapa segmen genom
yang diurutkan sebagian dari CoV yang baru-baru ini dilaporkan, Filipina / Diliman1525G2 / 2008
(BatCoV Philippines / Diliman) (Watanabe et al., 2010), diidentifikasi dalam C. brachyotis dari Filipina,
menunjukkan identitas urutan aa tertinggi dengan β-GX2018 dalam M (96% identitas aa), N (identitas
identitas 91%), ORF7a (identitas identitas 80%) , ORF7b (84,3% aa identitas), dan ORF7c (80,8% aa
identitas) (Watanabe et al., 2010). Menurut kriteria ICTV, β-GX2018 dapat dianggap sebagai spesies baru
di bawah genus Betacoronavirus.

Analisis filogenetik
Untuk menentukan lebih lanjut hubungan evolusi antara CoV ini, pohon filogenetik dibangun
menggunakan urutan a dari RdRp, S, S1, E, M dan N (Gambar 4). Seperti yang telah kita berspekulasi
sebelumnya, α-GX2018A, α-GX2018B, α-GX2018C, α-GX2018D dan α-YN2018 dikelompokkan dengan
genus Alphacoronavirus, dan β-SC2018, β-YN2018A, β-YN2018A, β-YN2018B, β-YN2018B, β-YN2018B, β
YN2018D, dan β-GX2018 berkerumun dengan genus Betacoronavirus. Hasil analisis filogenetik konsisten
dengan orang-orang dari identitas urutan

menganalisis, dan mengkonfirmasi bahwa CoV yang diidentifikasi dapat dibagi menjadi empat garis
keturunan.

Silsilah E
α-GX2018A, α-GX2018B dan α-GX2018C dikelompokkan dengan BtCoV / 512, dan cabang-cabangnya
pendek, mencerminkan kesamaan urutan tinggi. Selain itu, analisis filogenetik dari protein S mendukung
analisis kami sebelumnya bahwa α-GX2018D mewakili clade independen antara PEDV dan BtCoV / 512.
Analisis lebih lanjut dari S1 mengungkapkan bahwa α-GX2018D mewakili evolusi terpisah yang jauh dari
semua anggota lain dari garis keturunan E. Dari panjang cabang, α-GX2018D memiliki hubungan yang
lebih dekat dengan PEDV, yang berarti bahwa α-GX2018D mungkin telah mengalami rekombinasi
dengan leluhur PEDV dan BtCoV / 512.

Silsilah F
α-YN2018 berkerumun dengan Hi-batCov HKU10, Ro-BatCoV HKU10, Ca-batCoV / Kenya, dan α-
HuB2013. Namun, α-YN2018 memiliki hubungan yang lebih dekat dengan α-HuB2013 dari

R. ferrumequinum dalam RdRp dan N, dan hubungan yang lebih dekat dengan HKU10 dari Hipposideros
dan Rousettus kelelawar di S dan M. Ini berarti rekombinasi mungkin telah terjadi antara α-YN2018 dan
tiga CoV terkait ini.

Silsilah B
β-SC2018, β-YN2018A, β-YN2018B, β-YN2018C, dan β-YN2018D dikelompokkan dengan SARS- dan
SARSr-CoVs di bawah garis keturunan B. Dalam pohon RdRp, E, M, dan N, novel ini SARSr-CoVs dan SARS
-CoV memiliki cabang pendek, yang menunjukkan bahwa mereka terkait erat di wilayah ini. Analisis
filogenetik dari S dan S1 mengungkapkan bahwa β-YN2018B lebih dekat dengan SARS-CoV SZ3 dan
SARS-CoV Tor2 serta WIV1 dan WIV16.

Silsilah D
β-GX2018 dari C. sphinx berkerumun dengan CoV Rousettus terkait HKU9 dan CoV Eonycteris terkait
GCCDC1 di bawah garis keturunan D; namun, β-GX2018 selalu mewakili garis keturunan terpisah yang
berbeda dari anggota garis keturunan lain D. Meskipun BatCoV Filipina / Diliman dari C. brachyotis
memiliki hubungan yang lebih dekat

dengan α-YN2018 di M dan N, itu hanya diurutkan sebagian, jadi kami tidak bisa menganalisis hubungan
evolusionernya dengan α-YN2018 di RdRp, S, dan E, yang menghambat analisis lebih lanjut.

Analisis Rekombinasi
Kami menemukan bahwa peristiwa rekombinan telah terjadi di antara α-GX2018D, CoV kelelawar
lainnya, dan PEDV dari garis keturunan E. α-GX2018D menunjukkan tingkat kemiripan tertinggi dengan
BtCoV / 512 di wilayah ORF1ab, dan tingkat kemiripan tertinggi dengan PEDV di Wilayah S1. Analisis
evolusi menunjukkan bahwa S α-GX2018D mungkin bertindak sebagai nenek moyang bersama BtCoV /
512 dan PEDV. Kami menganalisis peristiwa rekombinasi yang mungkin dalam garis keturunan E
menggunakan perangkat lunak SimPlot. Plot kesamaan dan hasil bootscan menunjukkan bahwa wilayah
S-N dari α-GX2018D memiliki tingkat kemiripan tertinggi dengan PEDV, dan rekombinasi yang rumit
mungkin terjadi antara kelelawar CoV dan PEDV di wilayah ORF1ab (Gambar 5A).
Untuk CoVs dari garis keturunan F, setidaknya dua peristiwa rekombinasi telah terjadi (Gambar 5B).
Analisis kesamaan plot dan bootscan menunjukkan bahwa subunit S1 α-YN2018 memiliki tingkat
kemiripan tertinggi dengan Ro-BatCoV HKU10, sedangkan subunit S2 mereka memiliki tingkat kemiripan
tertinggi dengan Hi-batCov HKU10 (Gbr 5B). Sejarah rekombinasi yang rumit antara alpha-CoV ini
menunjukkan transfer gen yang sering, terutama S, di antara CoV yang berbeda, yang mungkin
merupakan hasil dari penularan lintas spesies CoVs ini.

DISKUSI

Identifikasi SARSr-CoV pada kelelawar pada tahun 2005 pertama kali membangun hubungan genetik
antara kelelawar dan manusia SARS-CoVs (Lau et al., 2005; Li et al., 2005). Setelah itu, dalam 13 tahun
berikutnya, penemuan terus-menerus kelelawar SARSr-CoV menunjukkan risiko kemunculan kembali
SARS-CoV yang berasal dari spesies kelelawar. Selain itu, dua kasus terkait CoV, MERS manusia pada
2012 dan SADS pada 2017, yang memiliki dampak besar pada kesehatan dan ekonomi diidentifikasi
berasal dari kelelawar (Omrani

et al., 2015; Zhou et al., 2018). Dalam penelitian kami sebelumnya, analisis virome skala besar dilakukan
antara 2010 dan 2013 untuk memahami keanekaragaman ekologi virus kelelawar dan asal kelelawar
penyakit menular yang baru muncul. Kelelawar Rhinolophus di Provinsi Yunnan dan Guangxi telah
memberikan petunjuk genetik tentang asal-usul SARS-CoV, dan CoV terkait SADS-CoV dan HKU2, BtRf-
alphaCoV / YN2012, juga ditemukan di Provinsi Yunnan (Wu et al., 2016a). Provinsi Sichuan memiliki
beragam sumber daya satwa liar dan pengembangbiakan babi terbesar di Tiongkok, dan CoV terkait
MERS dilaporkan pada kelelawar di provinsi ini pada 2013 (Yang et al., 2014). Penting bagi kita untuk
melakukan pengawasan terus-menerus untuk prevalensi, keragaman genetik, dan distribusi geografis
CoV pada beberapa spesies kelelawar di wilayah berisiko tinggi yang potensial ini. Dengan menggunakan
analisis virome, penelitian kami menyelidiki keberadaan dan keragaman genetik CoV yang bersirkulasi
pada spesies kelelawar dari Provinsi Sichuan, Yunnan, dan Guangxi antara 2016 dan 2017.
Hubungan erat antara lima alpha-CoV di S. kuhlii di Provinsi Guangxi dan CoV yang sebelumnya
dilaporkan di S. kuhlii di Provinsi Hainan mengungkapkan bahwa spesies kelelawar dari lokasi geografis
yang berbeda ini mengandung spesies CoV yang sama, tetapi dengan protein S yang berbeda. Wilayah
S1 α-GX2018D lebih erat kaitannya dengan PEDV daripada CoV kelelawar lainnya, dan secara filogenetik
terletak di akar garis keturunan PEDV dan S.V kuhlii. Temuan ini menunjukkan keberadaan leluhur
bersama yang jauh lebih dekat dari PEDV pada kelelawar CoVs. Analisis rekombinasi mendukung bahwa
wilayah S PEDV mungkin berasal dari leluhur α-GX2018D. Mempertimbangkan bahwa spesies kelelawar
seperti S. kuhlii lebih suka bersirkulasi di sekitar rumah pertanian dan kandang babi, dan sekuens terkait
PEDV lainnya telah dilaporkan dalam kelelawar dalam laporan sebelumnya (Simas et al., 2015; Phan et
al.,
2018), hubungan antara CoV kelelawar dan PEDV harus diselidiki lebih lanjut.
Penemuan β-SC2018 memberikan bukti bahwa Rhinolophus di Provinsi Sichuan dapat menampung
SARSr-CoVs, dan mengungkapkan distribusi geografis yang lebih luas dari virus-virus ini. Penemuan β-
YN2018B di sini, dikombinasikan dengan WIV1 dan WIV16 yang dilaporkan sebelumnya (Ge et al., 2013;
Yang et al., 2015), mengungkapkan bahwa SARSr-CoV yang dapat beradaptasi dengan ACE2 ini terus
beredar di R. affinis Provinsi Yunnan setidaknya dari 2012 hingga 2016. Temuan ini menekankan kembali
pentingnya pemantauan longitudinal berkelanjutan untuk SARSr-CoVs di Rhinolophus di Rhinolophus. di
area yang luas. Meskipun tidak ada CoV terkait SADS dan HKU2 yang ditemukan pada kelelawar
Rhinolophus dalam penelitian kami, pengawasan terhadap jenis CoV pada kelelawar ini masih
diperlukan di masa depan.
Dalam penelitian kami sebelumnya, dengan mengidentifikasi alpha-CoVs berkorelasi dalam spesies
Miniopterus berbeda dari berbagai daerah, karakteristik koinfeksi, rekombinasi, dan pengalihan inang
untuk alpha-CoVs telah dijelaskan. Di sini, CoVs dari garis keturunan F yang ditemukan pada spesies
kelelawar yang lebih beragam (termasuk kelelawar pemakan buah dan pemakan serangga) memperluas
jangkauan inang yang diketahui dari virus ini. Namun, peristiwa rekombinasi ditemukan antara α-
YN2018, Ro-BatCoV HKU10, dan Hi-batCov HKU10, dan beberapa asal dari S dari α-YN2018, lebih lanjut
menunjukkan bahwa host-shift yang lebih jauh sesuai dengan rekombinasi dari Wilayah S mungkin telah
terjadi dalam sejarah evolusi virus ini di antara spesies inang yang beragam.
Ketika kami mengumpulkan S. kuhlii di Provinsi Guangxi, kami menemukan bahwa ada banyak C. sphinx
di lokasi pengambilan sampel. Kelelawar Pteropodidae (kelelawar C. sphinx milik Pteropodidae) adalah
inang alami dari beberapa patogen manusia yang muncul seperti virus Hendra, virus Nipah, dan virus
Ebola (Leroy et al., 2005; Halpin dkk., 2011; Sendow dkk., 2011) , 2013; Mari Saez et al., 2015; Paez et
al., 2017). Filovirus yang berhubungan dengan Ebola ditemukan dalam kelelawar Pteropodidae Cina
baru-baru ini (Yang et al., 2019), dan dengan demikian, kami mengumpulkan sampel C. sphinx untuk
analisis virome. C. sphinx beta-CoV, β-GX2018, mewakili garis keturunan independen yang berevolusi
berbeda dari HKU9 dari Rousettus dan GCCDC1 dari Eonycteris di bawah garis keturunan D. Berdasarkan
wilayah yang diurutkan sebagian, CoV

strain Philippines / Diliman1525G2 / 2008 yang sebelumnya diidentifikasi dalam C. brachyotis dari
Filipina, juga dapat dikelompokkan ke dalam clade β-GX2018 yang terpisah ini. Dengan menyediakan
data urutan panjang penuh, temuan ini mengungkapkan kisaran host baru dari virus ini di lokasi yang
tidak dilaporkan.

KONTRIBUSI PENULIS

YH, QJ, dan ZW menyusun eksperimen, menganalisis hasilnya, dan menulis naskah. YH, JD, HS, dan ZW
melakukan percobaan dan menganalisis hasilnya. JZ, GZ, dan SZ mengumpulkan spesimen. Semua
penulis meninjau naskah.

PENDANAAN

Pekerjaan ini didukung oleh Proyek Utama S&T Nasional “Proyek Besar China untuk Penyakit Menular”
(Hibah No. 2018ZX10101001), Dana Lembaga Pusat Nirlaba Akademi Ilmu Pengetahuan Medis Tiongkok
(No. Hibah No.
2018RC310018), Dana Inovasi CAMS untuk Medis
Ilmu Pengetahuan (Hibah No. 2016-I2M-1-014 dan 2017-I2M-B & R-
12), dan National Science Science Foundation of China
(Grant No. 81772228).

MATERI TAMBAHAN

Materi Tambahan untuk artikel ini dapat ditemukan online di:

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.

2019.01900 / bahan tambahan # penuh