FAKTOR-FAKTOR YANG MEMPENGARUHI IMUNOREAKTIVITAS DALAM PENYIMPANAN JANGKA

PANJANG DARI BAGIAN JARINGAN YANG TERTANAM PARAFIN FORMALIN

Federica Grillo • Simona Pigozzi • Paola Ceriolo •

Paola Calamaro • Roberto Fiocca • Luca Mastracci

Diterima: 26 Februari 2015

© Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2015

Abstrak Peluruhan antigen pada bagian jaringan formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) untuk
imunohistokimia adalah fenomena terkenal yang mungkin memiliki dampak pada studi translasi dan
penelitian dan lama waktu penyimpanan tampaknya mendasar. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk
mengevaluasi semua faktor yang mungkin yang dapat menyebabkan pembusukan antigen pada
pengumpulan standar prospektif dari jaringan manusia dengan panel 14 antibodi yang digunakan secara
rutin. Bagian slide serial dari jaringan kontrol FFPE disimpan menggunakan metode yang berbeda
(penyimpanan rutin pada suhu kamar, dilindungi Parafilm®, dilapisi parafin dan dingin disimpan pada
suhu 4 ° C) dan untuk periode waktu yang berbeda: 1, 6, 9, 12, 24 dan 36 bulan. Imunohistokimia
dilakukan pada setiap kali cutoff secara bersamaan pada bagian yang disimpan dan pada bagian yang
baru dipotong menggunakan panel 14 antibodi. Imunoreaktivitas dibandingkan dengan imunoreaksi
yang dilakukan pada waktu nol. Pengurangan dalam immunostaining diamati untuk subset antibodi
(CD3, CD 31, CD117, reseptor estrogen dan progesteron, Ki67, p53, TTF-1, vimentin) sementara untuk
yang lain (aktin otot polos, keratin 7, 20, AE1 / AE3, 34βE12), tidak ada kerusakan antigen yang diamati.
Kehilangan antigenisitas sebanding dengan usia bagian jaringan dan tergantung pada mode
penyimpanan dengan slide penyimpanan dingin yang paling tidak terpengaruh. Semua antigen dengan
pengurangan imunosignal adalah nuklear atau membran, dan mereka semua membutuhkan pemanasan
awal untuk pengambilan antigen. Sebaliknya

F. Grillo () • S. Pigozzi • P. Ceriolo • P. Calamaro • R. Fiocca •

L. Mastracci

Unit Patologi, Departemen Ilmu Bedah dan Terpadu

Diagnostik, Universitas Genoa, IRCCS AOU San Martino IST,

Largo Rosanna Benzi, 10, 16132 Genoa, Italia e-mail: federica.grillo@unige.it

E-mail L. Mastracci: luca.mastracci@unige.it

untuk hasil dari penelitian lain, ketika faktor pra-analitik dikontrol dan distandarisasi secara ketat,
peluruhan antigen tampaknya terbatas pada antigen nuklir atau membran yang memerlukan
pengambilan antigen panas.

Kata kunci Immunohistokimia • Peluruhan antigen •

Penyimpanan bagian parafin • Patologi arsip

pengantar

Immunohistokimia (IHC) pada bagian jaringan formalin-tetap paraffinembedded (FFPE) adalah teknik
divalidasi yang digunakan untuk diagnosis dan penentuan parameter prognostik atau prediktif dalam
pengaturan klinis dan penelitian. Penggunaan yang meluas ini membutuhkan prosedur operasi standar
untuk memastikan kualitas optimal dan diagnosa yang dapat diandalkan (Benar 2014).

Sejumlah penelitian dalam dua dekade terakhir telah melaporkan bahwa modifikasi dalam antigenisitas
bagian jaringan dapat menyebabkan masalah baik dalam analisis molekuler termasuk metode hibridisasi
(Lisowski et al. 2001; Nuovo et al. 2013; Karlsson dan Karlsson 2011) dan IHC (Jacobs et al. 1996;
Bertheau et al. 1998; Mirlacher et al. 2004; Wester et al. 2000). Untuk IHC, telah lama ditunjukkan
bahwa fiksasi formalin dan pemrosesan histologis dapat mengarah pada penutupan epitop atau
denaturasi sehingga membutuhkan, dalam beberapa kasus, pengambilan antigen yang mungkin
didasarkan pada pencernaan enzimatik atau panas (Puchtler dan Meloan 1985; Werner et al. 2000).
Penyebab lebih lanjut dari penurunan imunoreaktivitas atau pembusukan antigen adalah penyimpanan
bagian FFPE pada slide kaca pada suhu kamar; memang, pencegahan slide tersebut adalah praktik
umum di sebagian besar laboratorium diagnostik atau penelitian (Mirlacher et al. 2004; Prioleau dan
Schnitt 1995). Menyimpan bagian jaringan yang tidak ternoda tidak eksklusif untuk studi penelitian,
tetapi juga tersebar luas dalam pengaturan klinis. Dalam penelitian biomedis, pra-pemotongan dan
penyimpanan slide yang tidak ternoda memungkinkan ketersediaan jaringan sambil memastikan bahwa
blok parafin dengan cepat dikembalikan ke lembaga asal. Di sisi lain, dalam praktik klinis, biopsi kecil
sering dilakukan secara serial untuk menghindari hilangnya jaringan saat penghitungan ulang sementara
beberapa jenis jaringan (mis., Sentinel node) dibelah secara serial untuk diagnosis dan slide yang tidak
bernoda diarsipkan. Selain itu, penyimpanan slide yang tidak ternoda memberikan akses mudah ke
bagian yang digunakan sebagai kontrol imunohistokimia positif bila diperlukan dalam kegiatan rutin di
laboratorium IHC.

Beberapa makalah telah menunjukkan bahwa intensitas imunostaining dipengaruhi oleh lamanya waktu
penyimpanan, bahwa ketidakstabilan epitop ini dapat dimulai sedini 2 minggu setelah pembelahan dan
sedikit membantu dalam menghindari fenomena ini (Olapade-Olaopa dkk. 2001; Shin et al. 1997; van
den Broek dan van de Vijver 2000; Olapade-Olaopa et al. 1998). Alasan untuk pembusukan antigen yang
berkaitan dengan usia ini pada bagian jaringan sampai sekarang belum dikarakterisasi dengan baik.
Foto-oksidasi dan pengeringan bagian (Blind et al. 2008) serta hidrolisis karena pemrosesan jaringan
yang tidak memadai atau kelembaban lingkungan, yang mengakibatkan retensi air (Xie et al. 2011), telah
dipertimbangkan, tetapi mekanisme yang tepat masih Tidak dikenal.

Sebagian besar penelitian berfokus pada kehilangan imunoreaktivitas yang tergantung waktu dengan
menggunakan bahan arsip dengan variabel pra-analitik yang tidak terstandarisasi. Selain itu, sebagian
besar penelitian telah menyelidiki panel kecil antibodi, dan oleh karena itu, informasi mengenai antibodi
mana yang lebih dipengaruhi oleh mekanisme ini tidak tersedia secara luas. Hanya dalam beberapa
penelitian adalah panel antibodi yang lebih besar digunakan (van den Broek dan van de Vijver 2000;
Ramos-Vara et al. 2014).
Penelitian ini secara prospektif menyelidiki efek penyimpanan bagian jaringan menggunakan panel
antibodi 14, yang membutuhkan sistem pengambilan antigen yang berbeda, dan mengevaluasi waktu
penyimpanan yang berbeda dan metode penyimpanan yang berbeda. Tujuannya adalah untuk
mengidentifikasi variabel yang berhubungan dengan antibodi atau kondisi lingkungan yang berkorelasi
dengan penurunan imunoreaktivitas dalam slide yang tidak bernoda.

material dan metode

Penelitian ini dilakukan sesuai dengan Deklarasi Helsinki dan telah disetujui oleh komite etika lokal kami.
Diagram skematis dari penelitian ini diilustrasikan pada Gambar. 1.

Antibodi

Empat belas antibodi berbeda yang digunakan dalam praktik diagnostik rutin dipilih untuk memasukkan
pewarnaan nukleus, sitoplasma, dan membran (lihat Tabel 1). Pilihan antibodi diarahkan untuk
mencerminkan pilihan kemungkinan penggunaan IHC dalam identifikasi berbagai antigen jaringan [otot
polos aktin (SMA), keratin (K) AE1 / AE3, K7, K20, K34βE12, vimentin, CD3, CD117, CD31, TTF-1] serta
kemungkinan faktor prediktif (ER, PR) dan prognostik (Ki67, p53). Selanjutnya, antibodi ini dipilih untuk
memasukkan antigen yang tidak memerlukan pengambilan serta yang membutuhkan panas dan / atau
pra-perawatan enzimatik (lihat Tabel 1). Klon antibodi yang sama, serta bahan habis pakai yang sama,
dipertahankan selama seluruh penelitian.

Tabel 1 Panel antibodi, klon, protokol utama (pengenceran, pengambilan antigen, amplifikasi) dan situs
antigen

Antibodi Klon Asal Pengenceran Panas pra-perawatan (min) Pretreatment enzimatik Suhu inkubasi (C °)
Situs amplifikasi antigen

ER 6F11 Ventana 1: 1 30 Tidak 37 ° C Tidak N

PR 16 Ventana 1: 1 30 Tidak 37 ° C Tidak N

Vimentin V9 Ventana 1: 1 30 No 37 ° C No C

CD3 SP7 Ventana 1: 200 60 Tidak 37 ° C Ya M

CD117 poli Cell marque 1: 1 60 No RT No M

Ki67 K-2 Ventana 1: 1 60 Tidak 37 ° C Tidak N

p53 DO7 Ventana 1: 1 60 Tidak 37 ° C Ya N

CD31 1A10 Cell marque 1: 1 60 Tidak 37 ° C Ya M

TTF-1 8G7G / 1 Sel marque 1: 1 60 Tidak 37 ° C Tidak

K 7 K72 Cell marque 1: 1 Tidak Ya 37 ° C Tidak C

K 20 KS20.8 Cell marque 1: 1 Tidak Ya 37 ° C Tidak C

K AE1 / AE3 Ventana 1: 1 Tidak Ya 37 ° C Tidak C

K 34ßE12 Cell marque 1: 1 8 Ya 37 ° C Tidak C

SMA 1A4 Sel marque 1: 1 Tidak Tidak RT Tidak C

Reseptor estrogen ER, reseptor PR progesteron, aktin otot polos SMA, poli poliklonal, suhu ruang RT,
sitoplasma C, inti N, membran M (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ, AS; Cell Marque Corporation,
Rocklin, CA, USA)

Persiapan jaringan

Sampel jaringan dipilih dari rutin segar, jaringan sisa, diterima untuk diagnosa klinis di Unit Patologi, dan
dipilih untuk mewakili kontrol positif untuk setiap antibodi sebagai berikut: karsinoma payudara untuk K
AE1 / AE3, positif dan positif antibodi reseptor progesteron; tumor stroma gastrointestinal untuk CD117
dan vimentin; adenokarsinoma paru untuk K7; adenokarsinoma kolorektal untuk K 20 dan p53; prostat
normal untuk berat molekul tinggi K (34ßE12); tiroid normal untuk TTF1; ovarium normal untuk CD31;
kelenjar getah bening normal untuk CD3; dan esofagus berlapis skuamosa normal untuk Ki67.

Fiksasi distandarisasi dengan memilih jaringan segar dari praktik rutin pada hari yang sama dan
memperbaiki setiap sampel dalam formalin buffer 10% untuk tepat 24 jam. Sampel kemudian secara
rutin diproses dalam parafin pada hari yang sama dan dalam batch yang sama, dan dari setiap blok
parafin setidaknya tiga puluh bagian setebal 4 mikron dipotong dalam satu sesi dan dipasang pada
mikroskop Superfrost Plus (Thermo Scientific, Braunschweig, Germany) slide. Semua slide dipotong pada
mikrotom yang sama oleh orang yang sama dalam satu sesi (waktu nol). Bagian pertama adalah H&E
yang diwarnai sebagai kontrol jaringan, dan bagian kedua diuji dengan antibodi yang dipilih untuk
memverifikasi imunoreaktivitas pada waktu nol. Semua bagian lainnya disimpan seperti yang dijelaskan
sebagai berikut.

Metode penyimpanan dan penuaan

Semua blok parafin disimpan pada suhu kamar dalam kotak kardus tertutup.
Bagian yang dipotong dari setiap blok parafin pada saat nol segera disimpan setelah dipotong
menggunakan empat metode penyimpanan yang berbeda:

Penyimpanan rutin di laci logam di bawah kondisi cahaya aman tanpa AC, pada suhu kamar.

Bagian penyimpanan yang dilindungi Parafilm® dibungkus dalam Parafilm® (American National Can,
USA), ditempatkan dalam silinder kardus dan ditutup dalam kotak plastik pada suhu kamar.

cells in dark grayabsence of immunosignal score+0

periode waktu berikut: 1, 6, 9, 12, 24 dan 36 bulan. Imunohistokimia untuk semua antibodi kemudian
dilakukan pada setiap kali cutoff. Selanjutnya, untuk mengevaluasi antigenisitas jaringan yang disimpan
dalam blok parafin, bagian baru dipotong dari blok parafin pada setiap kali cutoff.

Imunohistokimia

Pewarnaan imunohistokimia dilakukan dengan BenchMark XT immunostainer® otomatis (Ventana

Medical Systems, Arizona, AS) untuk teknik standarisasi. Sistem ini menggunakan kit pendeteksi DAB
iVIEW ™ (Ventana Medical Systems, Arizona, AS) yang merupakan metode tidak langsung berbasis
streptavidin-biotin. BenchMark XT® memungkinkan perlakuan awal panas dan enzimatik dilakukan
secara khusus. Bagian-bagian jaringan dideparafinisasi dan tidak dinilai

larutan buffer digunakan: CC1 adalah buffer EDTA pada pH8, dan CC2 adalah buffer sitrat pada pH6.
Suhu termopad dipertahankan konstan sepanjang prosedur lengkap; waktu siklus dapat bervariasi
mempertahankan suhu pada 95 ° C selama siklus 8 menit atau pada 100 ° C selama 30 atau 60 menit
siklus.

Pra-perawatan enzimatik dilakukan dengan protease 1 dengan waktu inkubasi variabel antara 4 dan 32
menit.

Kit amplifikasi (Ventana Medical Systems, Arizona, USA) terdiri dari dua solusi pra-diencerkan (anti-tikus
kelinci IgG dan anti-kelinci tikus IgG) yang fungsinya untuk mengikat kompleks antibodi-antigen primer
sehingga memperkuatnya. Waktu inkubasi adalah 8 menit pada 37 ° C.

Teknik imunohistokimia, klon antibodi dan jenis pra-perawatan dijelaskan pada Tabel 1.
Kontrol kualitas Immunostainer

Pada 12, 24 dan 36 bulan, pemeriksaan imunostainer lengkap dilakukan yang mencakup proses di mana
semua 36 posisi slide ditempati oleh bagian-bagian yang berasal dari blok jaringan yang sama
(adenokarsinoma kolorektal), dan ini semua diwarnai dengan antibodi yang sama, membutuhkan
pemanasan awal (p53, klon D07, Ventana Medical Systems, Tucson AZ, USA). Ini dilakukan untuk
menunjukkan bahwa posisi yang berbeda pada Thermopad tidak menyebabkan variabilitas pra-
perawatan dan akibatnya pewarnaan.

Dalam ketiga pemeriksaan tahunan, tidak ada variasi signifikan yang dicatat.

Evaluasi imunohistokimia

Semua imunostains dievaluasi oleh satu ahli patologi (LM) pada setiap cutoff waktu untuk menilai reaksi
secara kualitatif. Evaluasi ulang lengkap semua slide dilakukan setelah akhir penelitian pada 36 bulan
secara bersamaan oleh dua patolog (FG dan LM) membutakan waktu cutoff dan metode penyimpanan
kecuali untuk bagian kontrol waktu nol. Setiap perbedaan diselesaikan dengan konsensus. Intensitas
pewarnaan dibandingkan untuk setiap antibodi pada setiap cutoff waktu dengan imunoseksi yang
diwarnai pada waktu nol, dan perbandingan ini dianggap juga diperluas secara optimal (kontrol
termasuk bagian — 3 bagian baru +). yang dipotong segar dari blok parafin pada setiap cutoff waktu.

Intensitas dievaluasi secara semikuantitatif menggunakan skala numerik antara 0 dan 3an intensitas
pewarnaan analog dengan waktu nol, 2 + di mana 3+ diwakili kurang dari pingsan dan tidak memadai /
berpotensi samar-samar untuk diagno3 + tetapi masih dianggap cukup untuk diagnosis, + 1+ sis dan 0
sama sekali tidak ada imunostaining.

Hasil

Sebanyak 429 reaksi imunohistokimia dilakukan. Tiga puluh satu bagian immunostained dievaluasi untuk
setiap antibodi. CD3 tidak dievaluasi pada 36 bulan karena klon yang disimpan di laboratorium kami
telah berubah saat ini.

Semua 14, hari nol, immunostains menunjukkan imunoreaktivitas homogen dan intens, dan ini diambil
sebagai dasar untuk semua perbandingan. Tabel 2 menunjukkan semua hasil terintegrasi untuk waktu,
antibodi dan metode penyimpanan.

Parafin memblokir imunoreaktivitas

Bagian yang baru dipotong dari blok parafin yang disimpan menunjukkan

3+ imunoreaktivitas nol) untuk semua antibodi (sama dengan pada semua bagian kontrol yang dipotong
setelah

waktu

1–12 bulan penyimpanan blok parafin. Pengurangan imunosignal (2+) sedikit diamati mulai dari 24 bulan
hanya untuk Ki67, TTF-1 dan K7. Hanya CD3 yang menunjukkan penurunan imunoreaktivitas yang nyata
pada 24 bulan.

Hasil tergantung waktu

Semua penurunan intensitas yang signifikan (mulai dari cutoff waktu 6 bulan + dan seterusnya. Atau 0)
terjadi Peningkatan progresif ketidakcukupan imunoreaksi diamati dengan peningkatan waktu
penyimpanan. Secara khusus, hanya tiga kasus (0,7% dari semua imunoreaksi) menunjukkan penurunan
yang signifikan dalam imunoreaktivitas pada 6 bulan sedangkan lima kasus (1,2% dari semua
imunoreaksi) menurun pada 9 bulan dan tujuh kasus (1,6% dari semua imunoreaksi) pada 12 bulan .
Setelah 24 bulan, 28 kasus (6,5% dari semua imunoreaksi) menunjukkan penurunan yang signifikan
dalam imunoreaktivitas.

Hasil yang tergantung pada antibodi

Atas dasar kehilangan imunosignal, dua kelompok antigen diidentifikasi: kelompok 1 - kelompok di mana
imunoreaktivitas sebagian besar dipertahankan dalam waktu (SMA, keratin 7, keratin 20, keratin AE1 /
AE3 dan 34βE12) dan kelompok

2 - mereka yang penurunan imunoreaktivitas dalam waktu (CD3, CD 31, CD117, ER, PR, Ki67, p53, TTF-1
dan vimentin).

Semua antigen kelompok 1 adalah sitoplasma, sedangkan sebagian besar antigen kelompok 2 adalah
nuklir atau membran dengan pengecualian vimentin.

Mengingat pra-perawatan, hanya satu antigen, SMA, tidak memerlukan pengambilan antigen (baik
panas atau enzimatik) dan itu mempertahankan immunoreaktivitasnya dalam waktu (kelompok 1).
Empat antigen kelompok 1 lainnya adalah keratin yang kesemuanya memerlukan pra-perlakuan
enzimatik saja (kecuali untuk K 34βE12 di mana ditambahkan juga pra-perlakuan panas yang sangat
singkat - 8 menit).

Menariknya, semua antigen kelompok 2 membutuhkan pretreatment panas untuk waktu variabel antara
30 dan 60 menit (lihat Tabel 1).

Hasil penyimpanan tergantung metode

Bagian penyimpanan rutin menunjukkan pembusukan antigen variabel dan progresif dalam waktu dari 6
hingga 36 bulan. Secara khusus, pengurangan penting dicatat untuk antigen berikut: CD 3 (penurunan
yang signifikan mulai dari 12 bulan dengan reaksi negatif total pada 24 bulan); CD 117 (penurunan
signifikan mulai dari 9 bulan); Ki 67 (penurunan signifikan mulai dari 12 bulan); p53 (penurunan
signifikan pada 24 bulan); CD 31 (penurunan signifikan mulai dari 12 bulan); dan TTF1 (penurunan
signifikan mulai dari 12 bulan dengan negativitas lengkap tercapai pada 36 bulan).

Sebagian besar imunoreaksi yang dilakukan pada bagian cold storage mempertahankan
imunoreaktivitasnya tepat waktu. Hanya dua pengecualian adalah CD 3 pada 24 bulan dan vimentin
pada 36 bulan di mana penurunan yang ditandai dalam imunoreaktivitas diidentifikasi.

Masalah utama muncul dengan bagian metode penyimpanan Parafilm® yang dilindungi dan berlapis
parafin. Pada bagian-bagian ini, diamati penurunan imunointensitas yang tidak progresif dan tidak dapat
diprediksi (lihat Tabel 2). Variabilitas ini terdiri dari fluktuasi imunosignal dari waktu ke waktu.

Diskusi

Peluruhan antigen adalah fenomena yang terkenal, tetapi sulit untuk memprediksi antigen mana yang
paling terpengaruh dan setelah berapa banyak masalah waktu arsip akan terungkap. Dalam penelitian
ini, kami membandingkan immunoreaktivitas bagian yang disimpan dengan metode penyimpanan yang
berbeda selama periode waktu yang berbeda (dari 1 hingga 36 bulan) dan mencoba mengidentifikasi
faktor-faktor yang akan menyebabkan penurunan immunoreaktivitas.

Mempertimbangkan bahwa faktor pra-analitik (kelebihan atau kekurangan fiksasi, ketebalan

penampang geser, reagen, dll.) Dapat sangat memengaruhi imunoreaktivitas (Werner et al. 2000),
langkah-langkah ketat dilakukan untuk membatasi variasi ini hingga minimum. Memang, alih-alih
menggunakan jaringan arsip, sampel baru dikumpulkan secara prospektif. Semua sampel dikumpulkan
pada hari yang sama dan menjalani waktu fiksasi yang sama dan diproses dalam prosesor otomatis yang
sama. Selanjutnya, semua bagian dipotong pada mikrotom yang sama dan oleh orang yang sama.
Standarisasi ini masih kurang dalam banyak penelitian yang dilakukan sampai sekarang, meskipun itu
diketahui penting (Karlsson dan Karlsson 2011). Studi sebelumnya (terutama yang lebih tua) tidak
menggunakan teknik IHC standar sementara kami melakukan semua reaksi menggunakan
immunostainer otomatis modern dengan kontrol panas standar untuk pengambilan antigen dan sistem
deteksi sensitif.

Kami telah menunjukkan, mirip dengan kelompok lain (Karlsson dan Karlsson 2011; Jacobs dkk. 1996;
Bertheau dkk. 1998; Mirlacher dkk. 2004; Olapade-Olaopa dkk. 1998; Ramos-Vara dkk. 2014), bahwa
kehilangan imunoreaktivitas sebanding dengan lama penyimpanan. Dalam penelitian kami, semua reaksi
menunjukkan imunoreaktivitas optimal setelah 1 bulan. Temuan ini penting karena bagian yang
dipotong selama diagnosis klinis rutin biasanya digunakan dalam 1 bulan

bagian. Penelitian kami secara khusus tertarik pada bagaimana ketidakstabilan epitop mempengaruhi
bagian-bagian setelah waktu yang lebih lama dari pembelahan (hingga 3 tahun); banyak makalah
sebelumnya telah menunjukkan bahwa bahkan dalam jangka waktu yang singkat (hanya 3 hari),
peluruhan antigen mungkin memiliki efek pada evaluasi kekebalan tubuh (Ramos-Vara et al. 2014).
Perbedaan waktu di mana peluruhan mulai diidentifikasi oleh penelitian kami, berbeda dengan makalah
sebelumnya, mungkin disebabkan oleh beberapa faktor seperti variabel pra-analitik (waktu iskemia
dingin, waktu fiksasi, dll.), Jenis antibodi yang diuji dan prosedur imunohistokimia. (IHC manual vs
otomatis, penggunaan metode amplifikasi, penggunaan microwave vs prosedur pemanasan lainnya).

Kami telah menunjukkan bahwa tidak semua antigen sama-sama terpengaruh oleh peluruhan antigen.
Temuan ini juga telah dikomentari oleh penulis lain (Karlsson dan Karlsson 2011) meskipun alasannya
tidak diketahui. Dalam pengalaman kami, tetapi berbeda dengan penulis lain (Ramos-Vara et al. 2014),
antigen nuklir dan membran lebih banyak terpengaruh, sementara antigen sitoskeleton sitoplasma
(mis., Keratin dan SMA) tampaknya lebih stabil. Penjelasan yang mungkin termasuk konformasi protein,
protein-protein interaksi serta berbagai tingkat epitop masking oleh formalin cross-binding yang
mungkin tergantung pada situs antigen. Selain itu, kami telah menunjukkan bahwa peluruhan antigen
yang signifikan ditemukan sebagian besar untuk antigen yang membutuhkan sistem pengambilan
berbasis panas. Sangat menarik untuk dicatat bahwa antigen yang membutuhkan pemanasan awal,
menurut protokol kami, sebagian besar adalah nuklir atau membran. Protokol pengambilan antigen
yang berbeda atau lebih ekstrem mungkin diperlukan untuk mengatasi degradasi antigen pada slide
lama, tetapi protokol ini sulit dibuat (Wester et al. 2000; Shin et al. 1997). Penulis lain, di sisi lain, telah
mengusulkan penggunaan konsentrasi antibodi yang lebih tinggi (Olapade-Olaopa et al. 2001), waktu
inkubasi yang lama (Brandtzaeg 1981) atau penambahan sitrat (Katoh et al. 1997). Meskipun menarik,
kami tidak dapat melakukan pengujian kondisi pra-perawatan yang berbeda karena semua slide
sebelumnya telah digunakan dan tidak ada yang tersedia.

Metode penyimpanan slide berdampak pada pengawetan karena dapat mengubah antigenisitas.
Pelapisan parafin dan perlindungan Parafilm® diperkenalkan untuk mengurangi oksidasi udara jaringan
dan foto-oksidasi. Namun, mirip dengan penulis lain (Karlsson dan Karlsson 2011; Jacobs et al. 1996;
Blind et al. 2008; DiVito et al. 2004), kami menemukan bahwa metode ini tidak mencegah pembusukan
antigen. Metode penyimpanan terbaik tampaknya adalah penyimpanan dingin, meskipun tidak berarti
optimal (Mirlacher et al. 2004). Penyimpanan dingin, sementara mungkin tidak layak dalam penggunaan
klinis rutin, mungkin terbukti sangat berharga dalam studi penelitian di mana jaringan yang ditandai
dengan baik sangat berharga.

Bagian yang tidak ternoda jauh lebih rentan terhadap peluruhan antigen bila dibandingkan dengan blok
parafin (Mirlacher et al. 2004). Hampir semua imunoreaksi yang dilakukan pada bagian yang dipotong
pada periode waktu yang berbeda menunjukkan immunoreactivity yang diawetkan dibandingkan
dengan slide yang diwarnai pada hari ke-0. Oleh karena itu, penyimpanan dalam blok parafin menjaga
antigenisitas, meskipun beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa blok yang sudah bertahun-tahun
menunjukkan laju degradasi antigen yang lambat ( Litlekalsoy et al.

2007; Camp et al. 2000).

Pengamatan ini sangat menarik jika kita mempertimbangkan semakin pentingnya identifikasi biomarker
dan efek bahwa pengurangan sinyal imunohistokimia dapat memiliki pada penelitian translasi (Mirlacher
et al. 2004; Olapade-Olaopa et al. 2001; Economou et al. 2014) . Sebagian besar penelitian, termasuk
penelitian kami, telah menyelidiki antibodi yang secara rutin digunakan dan banyak informasi terdapat
dalam literatur (mis., Panel kanker payudara). Namun, dalam pengaturan penelitian, antigen baru dan
sebagian besar belum diuji dievaluasi pada seluruh bagian atau blok microarray jaringan dari jaringan
arsip. Ketika prosedur praanalitik standar ketat diterapkan, peluruhan antigen tampaknya terbatas pada
antigen nuklir atau membran yang membutuhkan pengambilan antigen panas.

Sebagai kesimpulan, hasil yang paling dapat dipercaya diperoleh ketika bagian segar dipotong dari blok
parafin dan digunakan secepat mungkin; alternatifnya, jika ini tidak memungkinkan, bagian harus
disimpan dalam cold storage.

Konflik kepentingan. Penulis menyatakan bahwa mereka tidak memiliki konflik kepentingan.

Standar etika Semua prosedur dan studi yang melibatkan partisipan manusia sesuai dengan standar
etika komite penelitian institusional dan dengan Deklarasi Helsinki 1964 dan amandemen selanjutnya.

Referensi

Bertheau P, Cazals-Hatem D, Meignin V, de Roquancourt A, Vérola O, Lesourd A, Séné C, Brocheriou C,

Janin A (1998) Variabilitas reaktivitas imunohistokimia pada slide parafin yang disimpan. J Clin Pathol 51:
370-374

Buta C, Koepenik A, Pacyna-Gengelbach M, Fernahl G,

Deutschmann N, Dietel M, Krenn V, Petersen I (2008) Pengujian antigenisitas oleh immunohistoc setelah
oksidasi jaringan. J Clin Pathol 61: 79–83
Brandtzaeg P (1981) Waktu inkubasi yang berkepanjangan dalam imunohistokimia: efek pada
pewarnaan fluoresensi imunoglobulin dan komponen epitel dalam etanol dan jaringan tertanam parafin
formaldehida-tetap. J Histochem Cytochem 29: 1302–1315

Camp RL, Charette LA, Rimm DL (2000) Validasi teknologi microarray jaringan pada karsinoma payudara.
Investigasi Lab 80: 1943–1949

DiVito KA, Charette LA, Rimm DL, Camp RL (2004) Pelestarian antigenisitas jangka panjang pada
microarray jaringan. Lab Investig 84: 1071-1078

Economou M, Schöni L, Hammer C, Galvàn JA, Mueller DE, Zlobec I (2014) Penyimpanan slide parafin
yang tepat sangat penting untuk translasi

proyek penelitian yang melibatkan pewarnaan imunohistokimia. Clin Translate Med 3: 4. doi: 10.1186 /
2001-1326-3-4

Jacobs TW, Prioleau JE, Stillman IE, Schnitt SJ (1996) Hilangnya intensitas penanda-imunostaining tumor
pada slide parafin yang disimpan dari

kanker payudara. J Natl Cancer Inst 88: 1054–1059

Karlsson C, Karlsson MG (2011) Efek penyimpanan jangka panjang pada deteksi protein, DNA, dan mRNA
dalam slide microarray jaringan. J Histochem Cytochem 59: 1113–1121. doi: 10.1369 /
0022155411423779

Katoh AK, Stemmler N, Specht S, D'Amico F (1997) pewarnaan Immunoperoxidase untuk reseptor
estrogen dan progesteron dalam arsip formalin tetap, karsinoma payudara tertanam parafin setelah
pengambilan antigen microwave. Biotech Histochem 72: 291–298

Lisowski AR, Bahasa Inggris ML, AC Opsahl, Bunch RT, Blomme EA (2001) Pengaruh periode
penyimpanan bagian parafin pada deteksi mRNA dengan hibridisasi in situ. J Histochem Cytochem 49:
927–928

Litlekalsoy J, Vatne V, Hostmark JG, Laerum OD (2007) Penanda imunohistokimia dalam karsinoma
kandung kemih dari jaringan arsip parafin yang tertanam setelah penyimpanan selama 5-70 tahun. BJU
Int 99: 1013-1019

Mirlacher M, Kasper M, Storz M, Knecht Y, Dürmüller U, Simon R, Mihatsch MJ, Sauter G (2004)
Pengaruh penuaan geser pada hasil studi penelitian translasi menggunakan imunohistokimia. Mod
Pathol 17: 1414–1420

Nuovo AJ, Garofalo M, Mikhail A, Nicol AF, Vianna-Andrade C, Nuovo GJ (2013) Pengaruh penuaan
jaringan parafin yang melekat pada formalin pada hibridisasi in situ dan sinyal imunohistokimia dalam
lesi serviks. Diagnosis Mol Pathol 22: 164–

173. doi: 10.1097 / PDM.0b013e3182823701

Olapade-Olaopa EO, MacKay EH, Habib FK (1998) Variabilitas reaktivitas imunohistokimia pada slide
parafin yang disimpan. J Clin Pathol 51: 943
Olapade-Olaopa EO, Ogunbiyi JO, MacKay EH, Muronda CA, Alonge TO, Danso AP, Moscatello DK,
Sandhu DP, Shittu OB, Terry TR, Wong AJ, Habib FK (2001) Karakterisasi lebih lanjut dari perubahan
terkait penyimpanan terkait imunoreaktivitas dari imunoreaktivitas. bagian jaringan arsip dan
implikasinya untuk studi imunohistokimia multisenter kolaboratif. Appl Immunohistochem Mol Morphol
9: 261–266

Prioleau J, Schnitt SJ (1995) p53 kehilangan antigen dalam slide parafin yang disimpan. N Engl J Med 332:
1521–1522

Puchtler H, Meloan SN (1985) Tentang kimia fiksasi formaldehida dan pengaruhnya terhadap reaksi
imunohistokimia. Histokimia 82: 201–204

Ramos-Vara JA, Webster JD, DuSold D, Miller MA (2014) Evaluasi imunohistokimia dari efek
penyimpanan bagian parafin pada stabilitas biomarker. Vet Pathol 51: 102–109. doi: 10.1177 /
0300985813476067

Shin HJ, SK Kalapurakal, Lee JJ, Ro JY, Hong WK, Lee JS (1997) Perbandingan p53 immunoreaktivitas
dalam potongan baru dibandingkan dengan slide yang disimpan dengan dan tanpa pemanasan
gelombang mikro. Mod Pathol 10: 224–230

True LD (2014) Persyaratan metodologis untuk studi biomarker berbasis jaringan yang valid yang dapat
digunakan dalam praktik klinis. Virchows

Arch 464: 257–263. doi: 10.1007 / s00428-013-1531-0 van den Broek LJ, van de Vijver MJ (2000)
Penilaian masalah dalam diagnostik dan penelitian imunohistokimia terkait dengan

ketidakstabilan epitop pada bagian parafin yang disimpan. Appl Immunohistochem Mol Morphol 8: 316–
321

Werner M, Chott A, Fabiano A, Battifora H (2000) Pengaruh fiksasi dan pemrosesan jaringan formalin
pada imunohistokimia. Apakah J

Surg Pathol 24: 1016-1019

Wester K, Wahlund E, Sundström C, Ranefall P, Bengtsson E, Russell PJ, Ow KT, Malmström PU, Busch C
(2000) Penyimpanan bagian parafin dan imunohistokimia. Efek waktu, suhu, fiksasi, dan protokol
pengambilan dengan penekanan pada protein p53 dan antigen MIB1. Appl Immunohistochem Mol
Morphol 8: 61–70

Xie R, Chung JY, Ylaya K, Williams RL, Guerreo N, Nakatsuka N, Badie C, Hewitt SM (2011) Faktor-faktor
yang mempengaruhi degradasi arsip bagian formalin-tetap jaringan tertanam parafin-tertanam. J
Histochem Cytochem 59: 356–365. doi: 10.1369 / 0022155411398488