Analisis Ekstrak HPLC

analisis aryl tetra hydro naphthalene lignan dan glikosida mereka dilaporkan dalam literatur
oleh berbagai pekerja. [28-29] Sistem HPLC yang dioptimalkan telah diterapkan pada analisis
ekstrak. Fase gerak yang digunakan terdiri dari air: metanol (3: 2) pada laju aliran 0,8 mL = mnt,
dengan RP-18, 5 mm (4 250 mm) kolom (Merck). Suhu kolom dipertahankan pada 30C dan panjang
gelombang yang digunakan adalah 240 nm. Tujuh senyawa penanda murni dari Podophyllotoxin (1),
Deoxypodophyllotoxin (2), 40 -dethethppylophyllotoxin (3), Picropodophyllotoxin (4),
Isopicropodophyllotoxin (5), Podophllotoxin-bD- glucopyranoside (6), dan 40 - demethpropylpod 7)
digunakan sebagai senyawa referensi untuk persiapan kurva standar untuk kuantifikasi senyawa
tersebut dalam ekstrak yang berbeda.

Persiapan Stok, Sampel, dan Kalibrasi Solusi Standar

Berat masing-masing 25 mg ekstrak secara akurat dilarutkan dalam metanol grade HPLC (5
mL), disaring melalui kertas saring Millipore 02 mm dan 10 mL masing-masing sampel diinjeksikan
ke dalam sistem HPLC. Konsentrasi senyawa yang berbeda dalam sampel ditentukan oleh HPLC
dengan metode kuantifikasi kurva standar eksternal.
Solusi stok (1000 mg = mL) dari senyawa penanda (Gambar 1a-g) disiapkan dalam metanol
grade HPLC dan disimpan dalam lemari es pada suhu 4C. Dari larutan stok, larutan kerja dari enam
konsentrasi berbeda disiapkan dengan pengenceran dengan metanol kadar HPLC. Campuran dari
tujuh senyawa penanda dibuat dengan mencampurkan larutan yang bekerja dalam volume yang sama
untuk memberikan konsentrasi masing-masing senyawa penanda dalam larutan. Sejumlah 10 mL (n ¼
6) masing-masing larutan disuntikkan ke kolom untuk mendapatkan kurva standar.
Instrumen.
Senyawa penanda dipisahkan dan diukur dengan menggunakan sistem HPLC Shimadzu
(Kyoto, Jepang) yang terdiri dari Pompa LC-10-ATvp, unit pengambilan sampel otomatis SIL-10
ADvp (injektor otomatis) oven kolom CTO-10 ASvp, SPD-M -10 Avp DAD, dan SCL-10 Avp
sebagai pengontrol sistem. Perangkat lunak Kelas VP (Versi 6.10) Shimadzu digunakan untuk akuisisi
dan pemrosesan data.

Analisis UV-DAD Kromatografi Cair

Menggunakan kondisi analitis yang dijelaskan pemisahan yang dapat direproduksi tercapai.
Gambar 2 menunjukkan kromatogram LC-UV-DAD (240 nm) dari tujuh senyawa penanda. Semua
senyawa penanda menunjukkan perbedaan yang wajar dalam waktu retensi mereka, yang membuat
kuantifikasi mereka lebih mudah. Gambar 3 menunjukkan LC-UV-DAD Chromatogram dari ekstrak
yang diperoleh oleh SFE pada 300 bar dimana senyawa 6 dan 7 adalah konstituen utama dari ekstrak.
Gambar 4 menunjukkan kromatogram LC-UV-DAD dari SFE yang diperoleh oleh ekstraksi CO2
yang dimodifikasi EtOAc pada 300 bar di mana senyawa 1 ditemukan sebagai konstituen utama.
Waktu retensi, nilai co-efisien korelasi, dan nilai RSD dari senyawa penanda disebutkan pada Tabel 1.

Pengembangan Metode
Linearitas
Analisis regresi digunakan untuk menilai linearitas metode HPLC yang dikembangkan.
Linearitas respons detektor ditentukan berdasarkan kurva kalibrasi. Dalam penelitian ini, linearitas
dipelajari untuk solusi standar Podophyllotoxin (1), Deoxypodophyllotoxin (2), 40
-dethylpodophyllotoxin (3), Picropodophyllotoxin (4), Isopicropodophyllotoxin (5), Podophllotoxin-
bD- glucopyranoside (6), -demethyldemethylpodophyllotoxin bD-glucopyranoside (7), masing-
masing.

Batas Deteksi (LOD) dan Kuantifikasi (LOQ)

Batas deteksi (LOD) dan kuantifikasi (LOQ) diukur berdasarkan metode yang dijelaskan oleh
Konferensi Internasional tentang Harmonisasi (ICH, 2005) [30]. The LOD dan LOQ dari
Podophyllotoxin (1), Deoxypodophyllotoxin (2), 40 -dethethpopophyllotoxin (3),
Picropodophyllotoxin (4), Isopicropodophyllotoxin (5), Podophllotoxin-b D- glucopyopyranoside (6),
dan 40 -dipethyl -dip 7) ditentukan berdasarkan rasio signal-to-noise masing-masing 3 dan 10.
 Presisi dan Akurasi
Presisi ditentukan dengan menguji larutan standar Podophyllotoxin (1),
Deoxypodophyllotoxin (2), 40 -demethylpodophyllotoxin (3), Picropodophyllotoxin (4),
Isopicropodophyllotoxin (5), Podophllotoxin-b -D-glucopyranpide (6), dan bD-glukopiranosida (7)
pada dua konsentrasi yang berbeda (1,42 dan 8,00 mg = mL) dengan enam injeksi sampel berulang.
Studi intra-hari dan antar-hari juga dilakukan.

Pemulihan
Sebuah studi pemulihan dilakukan dengan menganalisis analit pada tiga tingkat yang berbeda
(1, 3, dan 6 mg = mL) dengan membandingkan daerah puncak rata-rata (n ¼ 6 untuk setiap
konsentrasi) yang diperoleh dari sampel kosong dengan yang dibubuhi pada 3 hari berturut-turut.

RESULTS
Method
Linearitas Validasi
Dalam metode yang diusulkan, linearitas dipelajari dalam kisaran konsentrasi 0,142-1,42 mg
= mL larutan standar Podophyllotoxin (1), Deoxypodophyllotoxin (2), 40 -dethylpodophyllotoxin (3),
Picropodophyllotoxin (4), Isopicropodophyllotoxin (5), Podophllotoxin-b-Dglucopyranoside (6), dan
40 -detethylpodophyllotoxin bD-glucopyranoside (7), masing-masing. Kurva kalibrasi linier pada
rentang konsentrasi besar dan menghasilkan regresi linier yang baik. Koefisien korelasi lebih besar
dari 0,9999, menunjukkan tingkat korelasi yang tinggi dan linearitas metode yang baik. Hasilnya
ditabulasikan dalam Tabel 1.

Batas Deteksi (LOD) dan Kuantifikasi (LOQ)

The LODs dari Podophyllotoxin (1), Deoxypodophyllotoxin (2), 40
-demethylpodophyllotoxin (3), Picropodophyllotoxin (4), Isopicropodophyllotoxin (5),
Podophllotoxin-bD-glukopiranoprotein (6), dan 40 - demotopilin (hidroksilpilin) mengandung 0,012,
0,015, 0,016, 0,011, 0,019, 0,006, dan 0,018 mg = mL, masing-masing. LOQ untuk Podophyllotoxin
(1), Deoxypodophyllotoxin (2), 40 -demethylpodophyllotoxin (3), Picropodophyllotoxin (4),
Isopicropodophyllotoxin (5), Podophllotoxin-bD- glucopyranoside (6), dan 40 -dipethylpotoxd
(hidroksilp) 0,035, 0,046, 0,048, 0,032, 0,059, 0,019, dan 0,060 mg = mL, masing-masing (Tabel 1).

Presisi dan Akurasi

Ketepatan intra-hari dan antar-hari untuk penentuan marka dirangkum dalam Tabel 2. Nilai
keseluruhan untuk variasi intra-hari adalah antara 0,50-3,46% dan variasi antar-hari antara 0,39-
1,98% untuk analit.
Pemulihan dilakukan dengan menganalisis analit pada dua tingkat yang berbeda dalam enam
hari yang berbeda. Hasil studi akurasi disajikan pada Tabel 3. Kisaran pemulihan bervariasi dari 94,87
hingga 102,81% dengan RSD kurang dari 2,02%.

Kekhususan
Spesifisitas dari metode ini diperiksa dengan menganalisis sampel kosong dan ekstrak kosong
yang dibubuhi dengan konsentrasi Podophyllotoxin (1), Deoxypodophyllotoxin (2), 40
-demethylpodophyllotoxin (3), Picropodophyllotoxin (4), Isopicropodophyllotoxin (5), Podophlloto-
boxox-botoxin diketahui (5), -Dglucopyranoside (6), dan 40 -demethylpodophyllotoxin bD-
glucopyranoside (7); puncak tambahan tidak diamati kecuali puncak bunga.
Podophyllotoxin (1), Deoxypodophyllotoxin (2), 40 -dethethppylophyllohylpodophyllotoxin
(3), Picropodophyllotoxin (4), Isopicropodophyllotoxin (5), Podophllotoxin-bD- glucopyranoside (6),
dan 40 -dipetekdemetipdipetunjuk dengan waktu 9,33, 16,66, 10,38, 7,74, 6,21, 8,523, dan 4,53 dalam
kromatogram UV, masing-masing. Metode HPLC yang dikembangkan selanjutnya diterapkan untuk
penentuan konsentrasi lignan yang berbeda seperti Podophyllotoxin (1), Deoxypodophyllotoxin (2),
40 -dethethppophophotootoxin (3), Picropodophyllotoxin (4), Isopicropodophyllotoxin (5),
Podophllotoxin-bD- 6), dan 40demethylpodophyllotoxin bD-glucopyranoside (7) dalam ekstrak yang
diperoleh dengan teknik ekstraksi yang berbeda (ekstraksi karbon dioksida superkritis, ekstraksi
pelarut yang dipercepat, dan metode ekstraksi tradisional) dari Podophyllum hexandrum.
 Sebuah kromatogram representatif dari teknik ekstraksi yang berbeda ditunjukkan pada
Gambar 3. Jumlah tujuh analit yang berbeda [Podophyllotoxin (1), Deoxypodophyllotoxin (2), 40
-dethethpopophyllotoxin (3), Picropodophyllotoxin (4), Isopicropodophyllotoxin (5), Podophllotoxin-
b) -D- glucopyranoside (6), dan 40 -dethethylpodophyllotoxin bD-glucopyranoside (7) dalam ekstrak
telah dikuantifikasi dan hasilnya dirangkum dalam Tabel 4.

DISKUSI
Metode HPLC-UV (DAD) untuk identifikasi dan kuantifikasi simultan dari berbagai lignan
Podophyllum hexandrum dikembangkan, dan pemisahan tujuh analit dicapai dalam waktu 25 menit
pada kolom analitik [RP-18 (4,6 mm 250 mm); 5 mm] dengan fase gerak air: metanol (3: 2) pada laju
aliran 0,8 mL = mnt. Suhu kolom dipertahankan pada 30C, panjang gelombang adalah 240 nm, dan
volume injeksi adalah 10 mL.
Studi menunjukkan bahwa ekstrak SFE yang dikumpulkan lebih diperkaya dengan senyawa
1, 2, 3, 4, dan 6 (36,55, 1,46, 0,85, 6,82, dan 1,51%, masing-masing). Ekstrak metanol yang diperoleh
dengan metode Soxhlet memberikan peningkatan jumlah senyawa 5 (24,49%) dan senyawa 7
menyajikan konsentrasi yang cukup baik (1,89%) dalam ekstrak turunan ASE. Hasilnya ditabulasikan
dalam Tabel 4.
Telah dilaporkan bahwa senyawa 5 hadir dalam konsentrasi yang lebih rendah pada tanaman.
Picropodophyllotoxin mudah dibentuk dengan penataan ulang podophyllotoxin dan dianggap sebagai
artefak yang dihasilkan dalam proses metode ekstraksi tradisional (ekstraksi Soxhlet). [31] Dalam
SFE, ekstraksi terjadi pada suhu rendah 50C; oleh karena itu, itu muncul kurang dalam ekstrak yang
diperoleh oleh SFE dan lebih tinggi dalam ekstraksi Soxhlet. Senyawa 7 diekstraksi dalam konsentrasi
yang lebih tinggi dengan metode ASE, di mana metanol pelarut polar digunakan pada 50C dan
ekstraksi dilakukan di bawah tekanan pada 120 PSI; sedangkan senyawa 1, 3, 4, dan 5 dapat
diekstraksi dalam konsentrasi yang lebih tinggi dalam metode SFE dengan memasukkan etil asetat
sebagai pengubah CO2 cair pada tekanan 300 bar dan suhu 50C.
Senyawa 2 diekstraksi dalam konsentrasi 5,47% dengan CO2 cair yang dimodifikasi dengan
metanol pada tekanan 300 bar; sedangkan senyawa 6 dan 7 memiliki selektivitas dengan CO2 cair
murni pada tekanan 300 bar dan suhu 50C.
SFE dengan CO2 menghasilkan senyawa 6 dan 7 (5,51 dan 7,73%) sebagai konstituen utama,
sedangkan SFE dengan CO2 dengan etil asetat digunakan sebagai pengubah menghasilkan senyawa 1
sebagai konstituen utama dari ekstraksi (52,12%). Senyawa 3, 4, dan 5 juga ada dalam jumlah yang
cukup dibandingkan dengan keberadaannya dalam ekstrak lain. Di antara semua ekstrak, konsentrasi
senyawa 2 adalah cukup besar (5,47%) dalam ekstrak (S-1) ketika metanol superkritis CO2 yang
dimodifikasi digunakan sebagai pelarut ekstraksi. Hasilnya dilaporkan dalam Tabel 5.
Kualitas prosedur ekstraksi bahan tanaman tercermin dalam persentase senyawa yang
menarik dalam ekstrak yang diperoleh dengan proses tertentu. Setelah ekstraksi, senyawa yang
diinginkan dapat dimurnikan dengan metode pelaporan pemurnian yang normal. Di antara metode
yang digunakan untuk ekstraksi, SFE ditemukan ekonomis dalam hal hasil senyawa dalam ekstrak.
Metode ekstraksi khusus dapat lebih disukai dengan tetap mengingat molekul target. ASE dalam etil
asetat (60C) menunjukkan jumlah senyawa penanda yang cukup. Ekstraksi fluida superkritis
menunjukkan hasil yang terjamin kualitas produk yang diinginkan.
Dapat disimpulkan bahwa metode ekstraksi SFE dapat digunakan untuk ekstraksi senyawa 1,
2, 3, 4, dan 6 dalam jumlah yang lebih tinggi; sedangkan, metode ASE dapat menjadi alat yang
berguna untuk mengekstrak senyawa 7. Penelitian ini membuktikan bahwa volume rendah dan ekstrak
bernilai tinggi dapat diperoleh dari tanaman obat dengan ekstraksi cairan superkritis tetapi metode
ekstraksi lain tidak boleh diabaikan.