Akumulasi metabolisme bakteri pada deteksi sebesar 75% dari semua periopato-
permukaan jaringan keras mulut dianggap gen dalam plak (Kasuga et al., 2000) dan
sebagai penyebab primer periodontitis. dengan titer antibodi dan deteksi mikroba
Lebih dari 400 spesies telah diisolasi dan di- diperoleh 70% P. gingivalis (Morinoshi et
tandai dalam plak gigi. Akumulasi bakteri al., 2000).
pada gigi merangsang respon inflamasi Porphyromonas gingivalis adalah salah
secara reversibel pada jaringan gingiva. satu bakteri Gram-negatif anaerob yang
Bagian yang mengalami inflamasi pada berperan penting pada patogenesa
akhirnya dapat menyebabkan destruksi periodontitis. Pengobatan dengan antibiotik
jaringan secara permanen pada daerah sangat ditentukan oleh spesies penyebab
lokalisasi sejumlah organisme patogen yang periodontitis. Biasanya digunakan antibiotik
potensial. Spesies subgingival tertentu ke- seperti metronidazole, doxycycline dan
banyakan terdiri dari bakteri Gram-negatif clindamycin. Sejak dikembangkannya
yang dihubungkan dengan etiologi fluoroquinolon, gatifloxacin dan moxifloxacin
penyakit periodontal destruktif seperti: antibiotik tadi memperlihatkan tingkat
Actinobacillus actinomycetemcomitans,
Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis),
Provotella Intermedia dan beberapa spesies Correspondence:
bakteroid lainnya. (Ronderos et al., 2000; Prof. dr. Mochammad Hatta, PhD, SpMK(K), Department of
Microbiology, Molecular Biology and Immunology
Ting et al., 2000). Walaupun demikian Laboratory, Faculty of Medicine, Hasanuddin University,
Porphyromonas gingivalis dengan pemeriksa- Makassar, Jalan Perintis Kemerdekaan, Kampus Tamalanrea
Km.10, Makassar 90245, Telephone/Facsimile: 0411-586971
an Polymerase Chain Reaction (PCR) ter-
012 IRENE E.RIEUWPASSA, MOCHAMMAD HATTA
sentrifus, Erlenmeyer, neraca analitik, gelas Hinton, kemudian cawan petri ditutup
ukur, botol reagen, tips untuk pipet, dan dibiarkan selama 3-5 menit.
refrigerator, freezer, water bath atau dry block Cakram kertas (paper disc) yang berisi
heater, biohazard (safety cabinet), thermocycler, ciprofloxacin diletakkan pada permuka-
electrophoresis, perangkat UV dan kamera an agar Mueller Hinton dan sedikit
digital. ditekan agar melekat sempurna dan
tidak bergeser. Kemudian didiamkan
Cara kerja selama 15 menit. Setelah itu diinkubasi
Identifikasi P. gingivalis pada suhu 35-37ºC selama 16-20 jam
Spesimen pus atau cairan gingival, dalam posisi cawan terbalik.
diambil menggunakan kapas lidi diusap- Hasil diperoleh dengan mengukur
kan. Kemudian kapas lidi dimasukkan zona hambatan yang terbentuk pada
dalam media transport. agar dan lebar zona hambat dibanding-
Spesimen diinokulasikan ke dalam kan dengan tabel standar NCCLS tahun
media Blood Agar dan diinkubasi pada 1997, untuk menentukan hasil isolat
suhu 35-37ºC selama 24 jam. Hasil koloni bakteri P. gingivalis yang resisten,
dilakukan uji pewarnaan Gram untuk intermediat dan sensitif.
menemukan bakteri Gram-negatif basil.
Hasil bakteri Gram-negatif basil dilanjutkan UJI PCR
dengan uji SIM untuk melihat ada tidaknya a. Preparasi sampel
pergerakan. Metode ekstraksi DNA menggunakan
prosedur celite dan guanidium
Uji Disc Diffusion thyocyanate (Hatta dan Smits, 2007).
a. Media dan reagen Reagen
Media yang digunakan adalah; agar Suspensi diatom dibuat dengan cara
Muller Hinton (dengan ketebalan agar menambahkan 50 ml H2O dan 500 ml
4 mm); Strain kontrol P. gingivalis dari 32% (w/v) HCl (atau 445 μl dari
(ATCC 33277). Reagen yang digunakan 36% HCl) ke dalam 10 gram dari “High
adalah larutan standar NaCl fisiologis purity analytical grade celite” (diatom)
steril; larutan hipoklorit 2% dan standar yang diperoleh dari Jansen Chimica
kekeruhan Mc Farland 0,5. (Beerse, Belgium 10.864.79). Suspensi
diatom dibagi dalam beberapa tube
b. Prosedur pemeriksaan steril kapasitas 2 ml, di mana setiap
Inokulum disiapkan dengan meng- bagian terdiri dari 0,5 ml. Tube hasil
gunakan kapas lidi steril atau sengkelit. aliquots ditutup rapat dan disimpan
Diambil 3-5 koloni P. gingivalis hasil dalam box pada ruangan steril (mix
isolasi specimen klinik dan disuspensi- room), 20 μl dari suspensi ini akan
kan ke dalam tabung berisi larutan dapat bergabung dengan 10 μg DNA
NaCl fisiologis steril 5 ml, kemudian bakteri (10-5 gram DNA bakteri = 109 sel
kapas lidi bekas pakai dibuang dalam bakteri). Peningkatan jumlah volume
larutan hipoklorit 2%. Hasil suspensi diatoms akan meningkatkan hasil
bakteri dibandingkan dengan standar ekstraksi DNA. Diatom tidak perlu
kekeruhan Mc Farland 0,5. disterilisasi karena HCl yang terdapat
Kapas lidi dicelupkan ke dalam sus- dalam larutan diatom sudah dapat
pensi bakteri dan diputar beberapa kali merusak DNA sel bakteri.
kemudian ditekantekan pada dinding Larutan L6 (buffer lisis), dibuat dengan
tabung untuk membuang kelebihan cara melarutkan 120 gram GuSCN
inokulum. Kapas lidi yang meng- (Fluka Cehmie AG, Buchs, Switzerland,
andung inokulum dihapuskan secara catalog no 50990) ke dalam 100 ml Tris
merata pada permukaan agar Mueller HCl 0,1 M, pH 6,4. Kemudian larutan
dipanaskan pada suhu 600C untuk
014 IRENE E.RIEUWPASSA, MOCHAMMAD HATTA
Hasil sampel yang sensitif (13 sensitif sebelum dan sesudah restriksi
sampel) mempunyai nilai diameter zona dengan enzim Sac II.
hambatan rata-rata 25 mm sedangkan Hasil uji PCR diperlihatkan pada
sampel yang intermediat (1 sampel) dia- Gambar 2 sebelum direstriksi dengan
meter zona hambatannya 19 mm (Gambar adanya pita pada tiap slot pada posisi 339
1). bp. Slot 1-8 dan slot 10-14 berasal dari
sampel yang sensitif terhadap ciprofloxacin
2. Pada uji PCR dan slot 9 berasal dari sampel yang
Uji PCR dilakukan pada 14 sampel intermediat terhadap ciprofloxacin.
P.gingivalis dengan 13 sampel sensitif ter-
hadap ciprofloxacin dan 1 sampel inter- 3. Pada pemeriksaan dengan RFLP-PCR
mediat terhadap ciprofloxacin berdasarkan Telah dilakukan pemeriksaan
uji disc diffusion. Hasilnya dapat dilihat pada dengan RFLP-PCR menggunakan enzim
Gambar 2 sebagai gambaran hasil restriksi Sac II untuk mempelajari mutasi
elektroforesis pada sampel resisten dan yang terjadi pada sampel yang ada.
Resisten
Sensitif
Intermediat
M1234567891011121314
Slot
339bp
M1234567891011121314
Slot
339bp
Frekwensi Persen
Mutasi 0 0.00
Tidak Mutasi 14 100
Total 14 100
hanya terbentuk satu fragmen dengan Bachrach G, Altman H, Kolenbrander PE et al., 2007.
panjang nukleotida 339 bp. Resistance of Porphyromonas gingivalis ATCC
33277 to Direct Killing by Antimicrobial
Hasil penelitian uji RFLP-PCR pada Peptides is Protease Independent. Institute of
sampel yang sensitif terhadap ciprofloxacin Dental Sciences, The Hebrew University-
memperlihatkan 13 sampel sensitif dan 1 Hadassah School of Dental Medicine.Jerusalem,
sampel intermediat tidak mengalami Israel.
BioLabs, Restriction Endonucleases, New England
perubahan urutan nukleotida (tidak Biolabs. Diakses 28 Januari 2007.
bermutasi). Terlihat satu fragmen sebelum Brooks GF, Butel SJ dan Morse SA 2001. Mikrobiologi
menggunakan enzim restriksi dan setelah Kedokteran. Penerjemah dan Editor. Bagian
dilakukan restriksi. Hasilnya terlihat pada Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas
Airlangga. Salemba Medika. Jakarta.
gambar elektroforesis Gambar 2 sebelum
Buhlin Kare, Gustafsson Anders, Pockley AG,
restriksi, Gambar 3 setelah direstriksi. Hal Frostegard Johan Klinge Bjorn 2003. Risk Faxtors
ini menunjukkan bahwa urutan nukleotida for Cardiovascular Disease in Patients with
dapat dikenali oleh enzim restriksi yang Periodontitis, European Heart J.24: 2099-2107
digunakan sehingga tidak terjadi restriksi Burt BA 1996. Epidemiology of Periodontal Disease.
J.Periodontal.67:935-945.
pada sekuen spesifik tempat enzim Sac II Burton GRW, Engelkirk 2004. Microbiology for the
bekerja. Health Sciences. Sevent Edition. Lippincott
William & Wilkims, USA.
SIMPULAN DAN SARAN Collins CH 1995. Collins and Lyne's, Microbiological
Methods. Seventh Edition. Buuterworth
Heinamann. Oxford London.
Simpulan Corbert EF, Wong MCM, Lin HC 1997. Periodontal
Berdasarkan hasil penelitian yang Attachment Loss in Adult in Guandong
diperoleh dapat disimpulkan bahwa: RRC,J.Dent.Res.5:1176-50.
Terdapat P. gingivalis yang Depkes RI 2000. Standar Operating Prosedur (SOP) in
intermediat terhadap ciprofloxacin sebanyak Microbiology, Laboratoriun Kesehatan
Departemen Kesehatan, Jakarta.
1 dari 14 sampel yang dikumpulkan. Eick S, Schmitt A, Sachse S et al., 2004. In vitro
Tidak terlihat adanya mutasi pada antibacterial activity of fluoroquinolones against
gen topoisomerase II (gyrase A) dengan Porphyromonas gingivalis strains. Journal of
menggunakan teknik RFLP-PCR. Antimicrobial Chemotherapy.54(2):553-556.
Enersen M, Olsen I et al., 2005. Multilocus Sequence
Typing of Porphyromonas gingivalis Strains
Saran from Different Geographic Origins. Institute of
Perlu dilakukan penelitian lebih Oral Biology, Dental Faculty, University of Oslo,
lanjut mengenai hubungan antara resistensi Departement of Oral Microbiology, Academic
dan mutasi yang terjadi dengan mengguna- Center for Dentistry Amsterdam, The
Netherlands.
kan sampel yang lebih besar untuk Fishman Stuart L 2000. Summary of Brush Up in
mendapatkan hasil yang lebih akurat. Wellness Symposium, Meeting Summary. J.
Perlu adanya penelitian untuk Periodontal.71:679-682.
melihat mutasi lain dengan sasaran gen Gabastou JM et al., 1995. Phenotypes of resistance to
antibiotics of the most frequently isolated strains
yang berbeda, mengingat teknik ini walau-
in five specialized hospital centers. Multicenter
pun mampu mendeteksi gen penyandi study. PubMed – indexed for MEDLINE, vol 43
resisten, secara klinis belum tentu relevan, (4), Apr, hal 320-323,
khususnya untuk gen yang tingkat http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fc
ekspresinya rendah dengan melakukan gi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list, diakses 31
Mei 2006.
penelitian pada effllux pumps dan juga Grkovic S, Brown MH and Skurray RA 2002.
pada tingkat sekuensing. Regulation of bacterial drug export systems.
Microbiol. Mol. Biol., Rev 66:671 – 701.
KEPUSTAKAAN Haake SK 1993. Microbiology of Dental Plaque.
California Continuing Education.
Han XY and Andrade RA 2004. Brevundimonas
Ansubel F, Donald MC et al., 1995. Short Protocols in
diminuta infections and its resistance to
Moleculer Biology: The Polymerase Chain
fluoroquinolones. Section of Clinical
Reaction, third edition, John Wiley and Sons,
Microbiology, The University of Texas.
Inc, USA.
020 IRENE E.RIEUWPASSA, MOCHAMMAD HATTA
Hatta M and Smits L, Henk 2007. Detection of Morinushi T, Lopatin DE, Poperin NV et al., 2000. The
Salmonella typhi by Nested Polymerase Chain Relationship Between Gingivitis and
Reaction in blood, urine and stool samples. Colonization by Porphyromonas gingivitis and
American J. Tropical Medicine Hygiene.Vol: Actinobacillus actinomycetemcomitans in
76;139-143. Children. J.Periodontal.71:403-409.
Hooper DC, Wolfson JS, Bozza MA and Ng EY Naim R 2003. Cara Kerja dan Mekanisme Resistensi
2002.Genetics and regulation of outer membrane Antibiotik. Harian Kompas. Kompas Online.
protein expression by quinolone resistance loci Qarah SMD 1992.Pseudomonas aeruginosa Infections.
nfxB, nfxC, and cfxB. Antimicrob. Agents Dermatology Online Journal. May-Jun; 18(3):
Chemother, 36:1151 – 1154. 187-121.
Izadi Shima Mahdavi 1998. Periodontal Disease, Oral Ronderos M, Michalowicz B, Camara R, Contreras A
Health and Cardiovascular Disease Among 2000. Bacterial and Viral Risk Markers for
Females in Sweden.J.Dental Ed.395-404. Juvenile Periodontitis.J.Periodontal.71.1208.
Kasuga Y, Ishihara K, Okuda K 2000. Significance of
Detectioning Porphyromonas gingivalis,
Bacteroides forsythus and Treponema denticola
in Periodontal Pockets.Bull Tokyo DENT. Coll.
41(3):109-117.