BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Teknik Cryopreservasi

Pemindahan embrio ke rahim dimungkinkan pada semua tahap, tetapi tahap

blastokista memiliki tingkat kehamilan tertinggi dibandingkan dengan tahap
lainnya. Pemindahan tahap blastokista dapat dianggap sebagai proses seleksi untuk
mencegah gangguan genetik dan untuk mendapatkan embrio berkualitas tinggi. Dormansi
embrionik biasanya disebabkan oleh aneuploidi atau jumlah kromosom yang
abnormal. Faktor pembatas dalam transfer tahap blastokista adalah membekukan dan
menyimpan blastokista. Ketika embrio dipindahkan ke rahim, embrio lain harus disimpan
untuk digunakan dalam siklus lain atau berfungsi sebagai sumbangan untuk pasangan
infertil (Widjiati et al. 2018).

Teknik cryopreservasi telah berkembang cepat dalam beberapa tahun terakhir, tetapi
masih ada sensus apakah pembekuan lambat atau vitrifikasi alat paling bermanfaat untuk
penyimpanan jangka panjang sel hidup (Mandawala et al. 2016). Baru-baru ini
tampaknya sudah ada kecenderungan bergerak menuju vitrifikasi, sebagai cara yang lebih
mudah dan cepat teknik. Namun, protokol cryopreservasi tidak mudah ditransfer antar
spesies, karena menyebabkan embrio berbeda dalam ukuran, komposisi dan struktur
terkait, yang memengaruhi kerentanan mereka kemampuan selama cryopreservasi
(Saragusty dan Arav 2011).

Mengumpulkan bahan yang cukup dari spesies yang terancam punah adalah faktor
yang paling membatasi, dan karenanya hewan domestik sering digunakan sebagai model
untuk mengoptimalkan teknik cryopreservasi (Mandawala et al. 2016). Karena, kucing
domestik (Felis catus) adalah satu-satunya felid yang tidak digambarkan sebagai rentan
atau membahayakan, dapat berfungsi sebagai model untuk berkembang cepat, metode
yang dapat diandalkan, dan layak untuk kriopreservasi dari materi genetiknya. Lebih baik
memahami pengaruh suhu di bawah nol pada pengembangan blastomer dan faktor-faktor
yang menyebabkan kerusakan sel dan menginduksi reaksi apoptosis akan memungkinkan
protokol vitrifikasi untuk hasil terbaik.

3
 4

2.2 Definisi Apoptosis

Apoptosis adalah proses kematian sel yang bertujuan menghilangkan sel abnormal,
merugikan, atau berlebihan pada lokasi dan waktu tertentu (Makarevich et al. 2008).
Berasal dari perubahan genetik, yang menginduksi kaskade kompleks peristiwa biokimia
yang menurunkan protein dan DNA nuklear, untuk penyusutan sel, sitoplasma dan
kromatin kondensasi, dan fragmentasi (Fabian et al. 2005b). Merupakan mekanisme
intraseluler diri kehancuran, tetapi jarang dianggap sebagai proses endogen, karena dapat
dimulai sebagai respon terhadap stres sel, yaitu radiasi, nutrisi kekurangan, suhu, infeksi
atau meningkat konsentrasi kalsium intraseluler, dan biasanya tidak bisa berhenti begitu
dimulai (Fabian et al. 2007).

Insiden apoptosis in vivo dan in vitro embrio mamalia turunan telah diamati selama
bertahun-tahun (Hardy 1999) dan dianggap komponen penting dari desain pengembangan
embrio normal . Blastomer spontan mati di tingkat blastokista telah banyak dilaporkan
spesies, memungkinkan diferensiasi trofagus sel ledakan untuk implantasi dan massa sel
bagian dalam untuk pertumbuhan embrio. Meski bermanfaat efek selama perkembangan
embrio, kematian sel melampaui batas tertentu merugikan bagi kelangsungan hidup
embrio lebih lanjut (Betts dan King 2001). Juga telah ditunjukkan bahwa tingkat
apoptosis meningkat pada perkembangan suboptimal kondisi pada manusia (Hardy 1999),
tikus (Brison dan Schultz 1998), tikus (Pampfer et al. 2001), ternak (Gjorret et al. 2003),
kuda (Moussa et al. 2004), domba (Rizos et al. 2002), dan babi (Kidson et al. 2004).

Berbagai metode dapat digunakan untuk mengidentifikasi perubahan apoptosis pada

embrio, dimulai dari perubahan awal membran plasma dengan translokasi
phosphatidylserine (Annexin-V), melalui kondensasi nuklear dan fragmentasition (DAPI
atau Hoechst 33342) atau keberadaan single- and double-strand DNA breaks ke tahap
akhir apoptosis dengan membran sel (pewarnaan dengan ethidium homodimer, EthD-1). 
Percobaan dilakukan pada tikus (Dhali et al. 2009) dan sapi (Yang dan Rajama- hendran
2002) embrio menyarankan cryostorage itu dapat mengubah ekspresi gen terkait
apoptosis dan bahkan menginduksi apoptosis. Peningkatan kejadian kematian sel
terprogram adalah penting indikator tekanan lingkungan atau tidak memadai kondisi
budaya sebelum atau sesudah pemanasan (Fabian et al. 2007). Pemahaman terperinci
tentang aplikasi proses totik selama penyimpanan embrio sangat penting untuk
meningkatkan kelangsungan hidup dan kualitas embrio selama prosedur reproduksi
 5

berbantuan. Karena sedikit yang diketahui tentang apoptosis pada kucing embrio dan
blastokista yang terpapar pada suhu di bawah nol.

2.3 Bahan Warming Embrio

Semua bahan kimia dan agen yang digunakan dalam penelitian ini dibeli dari Sigma-
Aldrich, Polandia. Oosit adalah dikumpulkan dari ovarium yang diperoleh dari seksual
pematangan subject ovariektomi rutin atau variohisterektomi. Setelah operasi, ovarium
disimpan dalam phosphate buffered saline (PBS) dengan 1% dari Antibiotik Antimycotic
Solu tion pada 4 ° C hingga 24 jam sebelum cumulus oocyte complexes (COCs)
pulih. COCs dikumpulkan dengan mengiris indung telur dengan pisau bedah di wastafel
media (WM) yang berisi M199 dengan Earle garam, ditambah dengan 3 mg / ml serum
sapi albumin (BSA), 0,1 mg / ml sistein, 1,4 mg / ml (4-2-hydroxyethyl) -1-
piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 0,25 mg / ml natrium piruvat, 0,6 mg / ml
natrium laktat, 0,15 mg / ml l-glutamin, dan 0,055 mg / ml gentamisin.

Isolasi COCs yang diklasifikasikan di bawah mikroskop bedah dan hanya oosit
dengan ooplasma gelap berpigmen rata dan beberapa lapisan sel kumulus dipilih dan
ditempatkan ke dalam 400 μl medium maturasi oosit per setiap ulangan, WM dengan
tambahan dari 0,025 IU / ml hormon luteinizing dan 0,02 UI / ml hormon perangsang
folikel di bawah minyak mineral dan matang selama 24 jam pada 38,5 ° C dalam 5%
CO2 di udara dengan kelembaban maksimum (Ochota et al. 2016a).

Zigot dugaan telah dipindah setelah Inkubasi 18 jam dengan spermatozoa, dicuci, dan
dikultur hingga 7 hari, 8 ± 5 presumtif zygot mendapat tetesan dalam 50 μl protein
embrio cultur (EC) medium (Continuous Single Culture ® dengan suplemen Pengganti
Serum 10% ® ; Irvine Scientific, Irlandia) pada 38,5 ° C dalam 5%
O2 diudara. Pengembangan embrio dinilai berdasarkan harian pada karakteristik
morfologi.

2.4 Definisi Vitrifikasi

Vitrifikasi diaplikasikan pada embrio hari ke 3 dan ke hari ke 7 blastokista. Embrio

dan blastokista sangat penting pada Cryotops menggunakan protokol yang dijelaskan
oleh Ochota et al. (2016b). Secara singkat, 1-3 embrio atau blastokista diinkubasi selama
2 menit (embrio) dan 4 menit (blastokista) dalam larutan kesetimbangan (ES: 7,5%
dimethyl sulfoxide (DMSO), 7,5% PrOH, 0,5 M sukrosa, dan 10% Ficoll), lalu mereka
 6

terpapar kurang dari 30 detik pada vitrifikasi solusition (VS: 15% DMSO, 15% PrOH,
1M sukrosa, dan 10% Ficoll) dan selama ini mereka dimuat ke perangkat Cryotop
(Kitazato Bio-Pharma Co., Ltd., Jepang) dengan volume minimal VS (<0,5 μl), dan
langsung dicelupkan ke dalam cairan nitrogen. 

2.5 Proses Warming Embrio

Pemanasan dilakukan sebagai tiga langkah: rendam selama 1 menit pada suhu 37 ° C
dalam 0,5 ml cairan thawing solution 1 (TS 1): sukrosa 1M, 10% Ficoll, dan 20% fetal
calf serum (FCS) dalam Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS), lalu selama 3
menit dalam 20 ° C TS 2: sukrosa 0,5 juta, 10% Ficoll, dan 20% FCS di DPBS, dan
selanjutnya dicuci selama 5 menit dalam DPBS dengan 20% FCS. Embrio yang
dihangatkan dikembalikan hingga 50 μl media EC (2-3 embrio per masing-masing drop)
pada 38,5 ° C dalam 5% O 2 di udara untuk sisanya 4 hari EC. Embrio, yang memulai
kembali perpecahan dalam 24 jam pertama pasca pemanasan, diklasifikasikan sebagai
selamat dari prosedur vitrifikasi. Dihangatkan blastokista dinilai untuk morfologi dan
ekspansi ulang pada 2, 4, dan 16 jam di bawah terbalik mikroskop. Mereka yang memiliki
massa sel dalam yang utuh, trofektoderm, dan blastocoele yang diperluas kembali
dianggap masih hidup.

Pada warming tikus setelah penyimpanan cryo, embrio dihangatkan menggunakan

prosedur pengenceran tiga langkah dengan vitrifikasi (Geneocellideal, Iran). Secara
singkat, cryolock yang mengandung embrio dikeluarkan dari nitrogen cair dan dicelupkan
ke dalam larutan T1 (Geneocellideal, Iran) yang mengandung sukrosa 1,0 mol / L
pada suhu 37 o C. Setelah 1 menit kesetimbangan dalam larutan T1, embrio dipindahkan ke
dalam larutan T2 yang mengandung 0,5 Sukrosa M selama 3 menit. Kemudian embrio
dipindahkan ke larutan T3 yang mengandung sukrosa 0,25 M selama 3 menit. Akhirnya
embrio dicuci dengan media HTF (Nasrin et al. 2016).

Pembekuan adalah cara yang efektif untuk mengawetkan embrio yang diperoleh dari
fertilisasi in vitro yang dibekukan dan akan menghentikan proses metabolisme. Vitrifikasi
adalah salah satu metode untuk cryopreserve embrio. Salah satu keuntungan utama dari
vitrifikasi adalah tidak adanya kristalisasi yang menyebabkan kerusakan sel, sedangkan,
dalam metode pembekuan lainnya, kristalisasi terjadi. Untuk menghindari kristalisasi
yang merusak sel blastomer dalam vitrifikasi, metode ini membutuhkan penggunaan
cryoprotectant konsentrasi tinggi. ( Widjiati et al.2018)
 7

Viabilitas embrio yang dipanaskan ditentukan berdasarkan pada pemeriksaan visual

integritas membran embrio, zona pellucida dan normalitas sitoplasma dua jam setelah
pemanasan. Selama kultur in vitro, perkembangan embrio dievaluasi setiap hari.

2.6 Deteksi Apoptosis 

Derajat awal atau early apoptosis blastomer (EAB) dan perubahan apoptosis lambat
atau Low apoptosis balastomer (LAB), juga sebagai nekrotik blastomer (NB) dievaluasi
dalam blastokista mengalami pemanasan vitrifikasi prosedur, blastokista dikembangkan
dari vitrifikasi embrio yang dihangatkan, dan kontrol blastokista itu tidak
vitrifikasi. Rasio awal (EABR), terlambat (LABR) blastomer apoptosis dan nekrotik
(NBR) dihitung dari jumlah total tomere dihitung dalam blastokista.

Pewarnaan Annexin-V. Blastokista ternoda menggunakan untuk pewarnaan Annexin-

V (Invitrogen, USA) sesuai dengan instruksi pabrik, dengan modifikasi yang diterbitkan
oleh Anguita et al. (2007). Setelah dicuci di PBS ditambah dengan 0,5% BSA (PBS-BSA)
blastokista diinkubasi dalam gelap selama 15 menit pada 37 ° C dalam 50 μl tetesan yang
mengandung binding buffer, fluorescein isothiocyanate-conjugated Annexin-V,
propidium iodide (PI), and Hoechst 33342 (1 mg/ml). Setelah itu, embrio muncul dicuci
di PBS-BSA dan diamati di bawah epi-fluoresensi mikroskop terbalik Olympus IX 73
(Olympus Corp, Jepang). Blastomer dalam blastokistadiklasifikasikan sebagai berikut: (1)
blastomer yang aktif: inti positif Hoechst, (2) apoptosis awal blastomer (EAB): inti positif
Hoechst dengan sinyal positif Annexin-V dalam sitoplasma membran, dan (3) blastomer
nekrotik (NB ):Inti positif PI. Total jucell number (TCN) di blastokista dihitung
berdasarkan nukleus Hoechst pewarnaan menggunakan Dimensi sel cellSens Olympus
perangkat lunak. Setelah evaluasi, blastokista dicuci empat kali dalam PBS-BSA,
diperbaiki dalam paraformal 4% dehidrasi, dan disimpan dalam 4 ° C semalam untuk
TUNEL pewarnaan pada hari berikutnya.

 Blastokista dicuci dua kali dalam PBS-PVP (polyvinylpyrrolidone) (1 mg / ml) dan

permeabilised dalam Triton X-100 (0,5% dalam PBS) untuk 1 jam pada suhu
kamar. Untuk positif dan negatif Kontrol , sampel diinkubasi dengan 0,1 U / μl DNAse
selama 1 jam pada 37 ° C. Untuk pewarnaan TUNEL, Deteksi Kematian Sel Situ (Roche
11684795910; Roche, Swiss) digunakan mengikuti instruksi turer dengan modifikasi
yang dipublikasikan oleh Fabian et al. (2007). Semua eksperimental dan blastokista
kontrol positif diinkubasi dengan terminal deoxynucleotidyl transferase dan fluo- DUTP
 8

terkonjugasi rescein selama 1 jam pada suhu 37 ° C, sedangkan kontrol negatif diinkubasi
tanpa terminal deoxynucleotidyl transferase. Lalu semua embrio dicuci di PBS-BSA,
diimbangi dengan Hoechst 33342 (1 mg / ml) selama 15 menit pada suhu kamar perature,
dan dicuci di PBS-PVP sebelum pemasangan pada slide. Blastomer diklasifikasikan
menurut untuk morfologi nuklir mereka (keberadaan tipikal fragmentasi DNA) dan
intensitas sinyal fluoresen (berdasarkan intensitas sinyal pengukuran dalam kontrol
positif menggunakan Olym- perangkat lunak nan cellSens): (1) blastomer apoptosis
(LAB): TUNEL positif, fragmen nuklir hijau, dan (2) non-apoptosis: TUNEL negative,
Hoechst 33342 inti biru positif.

BAB III
METODE PENELITIAN

3.1 Desain Eksperimental

 9

Embrio 3 hari ( n = 200) dan hari 7 blastokista ( n = 39) diperoleh dari oosit ( n =
771), matang, dan dibuahi secara in vitro (45 ulangan, 15 ± 5 oosit per setiap ulangan). Di
bagian pertama percobaan, embrio terbagi menjadi kontrol ( n = 98) atau berpengalaman
kelompok mental ( n = 102), yang menjadi sasaran untuk vitrifikasi. Demikian pula, hari
ke 7 blastokista adalah dibagi menjadi kontrol ( n = 12) dan eksperimental ( n = 27)
kelompok, dan yang terakhir menjalani vitrifikation. Viabilitas pasca pencairan dievaluasi
berdasarkan kemampuan embrio untuk membelah dalam 24 jam setelah pemanasan dan
kemampuan blastocyst untuk berkembang kembali pada 2, 4, dan 16 jam pasca
pemanasan. Embrio yang dipanaskan dengan vitrifikasi dikembalikan ke EC untuk
melanjutkan pengembangan ke tahap blastokista dan blastokista dihangatkan digunakan
di bagian kedua percobaan. Di bagian kedua percobaan, kontrol, blastokista tanpa
vitrifikasi ( n = 12), dapat hidup, hari 7 blastokista setelah pemanasan vitrifikasi ( n = 15),
dan blastokista yang berkembang dari pemanasan vitrifikasi embrio ( n = 15) dikirim ke
Annexin-V dan pewarnaan TUNEL untuk mengevaluasi derajat perubahan apoptosis
awal dan akhir.

3.2 Analisis Statistik

 Jumlah embrio vitrifikasi dan pemanasan yang bertahan hidup dicatat dan digunakan
untuk menghitung persentase yang bertahan. Perkembangan lebih lanjut dari embrio
vitrifikasi dibandingkan dengan kelompok kontrol, yang bukan vitrifikasi menggunakan
uji eksak Fisher. Jumlah dan porsi blastomer apoptosis awal dan akhir dan rasio jumlah
total blastomer dibandingkan dengan menggunakan analisis varian dua arah
(ANOVA). Perbedaan statistik yang signifikan adalah dicatat pada P <0,05

BAB IV

HASIL PENELITIAN
 10

Sebagian besar (84,3%) dari embrio vitrifikasi-menghangat adalah layak setelah

pemanasan dan lebih dari sepertiga dari mereka (36,3%) dikembangkan lebih lanjut untuk
morula. Bagaimana-pernah, hanya 14,7% mencapai tahap blastokista di EC setelah
pemanasan. Kelangsungan hidup keseluruhan vitrifikasi hari 7 blastokista adalah 55,6%
(Tabel 1). Jumlah blastomer di blastokista dikembangkan dari embrio vitrifikasi-hangat mirip
dengan kelompok kontrol (Tabel 2), tetapi secara signifikan berkurang pada hari 7 blastokista
mengalami vitrifikasi. Awal dan akhir perubahan apoptosis dan NB yang dicatat dalam
blastokista dari semua perawatan. kation Vitrifi- meningkat secara signifikan akhir apoptosis
dan perubahan nekrotik di blastosis mengalami pembekuan cepat dan perubahan apoptosis
awal kista blasto- dikembangkan dari embrio vitrifikasi-dicairkan. Dalam vitrifikasi hari 7
blastokista, jumlah blastomer apoptosis awal mirip dengan kelompok kontrol, sedangkan
jumlah akhir blastomer apoptosis dan NB lebih tinggi dari pada kelompok kontrol. Selain itu,
rasio blastomer apoptosis pada pagi hari 7 vitrifikasi blastokista adalah lar Serupa, sedangkan
rasio blastomer-an dan NB lebih tinggi, jika dibandingkan dengan kontrol. Di sisi lain,
blastokista dikembangkan dari vitrified- embrio menghangatkan terkandung signifikan lebih
awal blastomer apoptosis dibandingkan kelompok kontrol. Namun, rasio awal, blastomer
crotic terlambat, dan ne- di blastokista dikembangkan dari embrio vitrifikasi mirip dengan
blastosis dari kelompok kontrol (Tabel 2).

BAB V

PEMBAHASAN
 11

Penelitian ini mengevaluasi implikasi dari prosedur vitrifikasi-pemanasan terhadap

kejadian perubahan apoptosis awal dan akhir blastokista mengalami vitrifikasi dan blastokista
perkembangan dari embrio sebelumnya vitrifikasi. Hasil menunjukkan bahwa vitrifikasi-
pemanasan memiliki dampak negatif pada blastokista, yang meningkat perubahan apoptosis
akhir, serta jumlah NB. Sebaliknya, di blastokista dikembangkan dari embrio vitrifikasi-
menghangat, cryopreservation tidak mempengaruhi kejadian akhir perubahan apoptosis atau
nekrosis, namun peningkatan jumlah blastomer apoptosis awal. Tidak banyak laporan yang
tersedia pada kucing embrio kriopreservasi. Meskipun, vitrifikasi tampaknya lebih efisien,
lebih murah, dan lebih mudah daripada lambat pembekuan tingkat, prosedur ini belum juga
belum didirikan (Elnahas et al. 2010). tingkat keberhasilan yang dilaporkan dalam embrio
vitrifikasi pada kucing masih sangat terbatas (Tsujioka et al 2008;. Paus et al 2012.).

Namun, dalam penelitian sebelumnya (Ochota et al. 2016) menunjukkan bahwa

kelangsungan hidup blastokista setelah pemanasan itu sangat dipengaruhi oleh gree de-
ekspansi, mendukung dipadatkan (75% viabilitas pasca-pemanasan) vs blastocyst diperluas
(47% pasca-pemanasan kelangsungan hidup). Dalam studi saat ini, blastosis menjalani
vitrifikasi pada hari ke 7 kembali berapapun dari tingkat ekspansi, yang dapat mempengaruhi
hasil. Dalam penelitian kami, 55% dari blastocyst selamat vitrifikasi, yang sesuai dengan
hasil Tsujoka et al. (2008) untuk hari 7 blastokista. Meskipun, Tsujoka et al. (2008) tidak
menemukan perbedaan statistik antara hari 6 vs hari 7 blastokista kelangsungan hidup pasca-
vitrifikasi, hasil mereka juga menunjukkan kecenderungan resistensi yang lebih baik untuk
suhu di bawah nol kurang diperluas (hari 6) blastosis. yang sesuai dengan hasil Tsujoka et al.
(2008) untuk hari 7 blastokista.

Dalam studi Tsujioka et al. (2008), mereka juga memeriksa jumlah sel total
blastokista sub menolaknya untuk vitrifikasi dan tidak menemukan perbedaan antara segar
dan vitrifikasi blastokista, yang berbeda dengan penelitian kami di mana vitrifikasi
blastokista memiliki signifikan kurang blastomer dibandingkan dengan non-vitrifikasi,
blastosis kontrol . diamati, lebih rendah TCN dalam blastosis vitrifikasi kemungkinan akibat
dari kerusakan yang disebabkan oleh cold storage, karena kita juga mengamati peningkatan
pada akhir perubahan apoptosis dan nekrotik dibandingkan dengan kelompok kontrol.
Penurunan total jumlah sel di blastokista setelah cryostorage juga dilaporkan di spesies lain
dan dijelaskan sebagai gangguan pasca-pemanasan ity activ- mitosis dan proliferasi tertunda
(Marquez-Alvarado et al 2004;. Chrenek et al 2014.). Hal itu juga terbukti dalam blastokista
babi vitrifikasi bahwa setelah budaya 24 jam, 2/3 dari embrio menunjukkan normal,
 12

morfologi ated regener- dan peningkatan TCN (Fabian et al. 2005a). Menariknya, apoptosis
di awal blastokista mengalami vitrifikasi tidak berbeda dari kontrol, menunjukkan sion
progres-apoptosis awal menuju tahap selanjutnya dalam menanggapi prosedur vitrifikasi-
pemanasan tanpa terjadi baru, perubahan awal apoptosis. Sebaliknya, blastokista
dikembangkan dari embrio vitrifikasi memiliki kualitas yang sama dalam hal TCN sebagai
kelompok kontrol. menyarankan sion progres- apoptosis awal menuju tahap selanjutnya
dalam menanggapi prosedur vitrifikasi-pemanasan tanpa terjadi baru, perubahan awal
apoptosis. Sebaliknya, blastokista dikembangkan dari embrio vitrifikasi memiliki kualitas
yang sama dalam hal TCN sebagai kelompok kontrol. menyarankan sion progres- apoptosis
awal menuju tahap selanjutnya dalam menanggapi prosedur vitrifikasi-pemanasan tanpa
terjadi baru, perubahan awal apoptosis. Sebaliknya, blastokista dikembangkan dari embrio
vitrifikasi memiliki kualitas yang sama dalam hal TCN sebagai kelompok kontrol.

Kematian sel terprogram merupakan proses fisiologis yang terjadi secara spontan di
banyak populasi sel (Fabian et al. 2005b). Selama embriogenesis memainkan peran penting
dalam menghilangkan normal, merugikan, atau sel berlebihan dan kontrol-ling jumlah embrio
blastomer (Handyside dan Hunter 1986).

Percobaan ini mencatat peningkatan yang signifikan dari blastomer-an dan nekrotik di
blastocyst vitrifikasi dan awal apop- blastomer totic di blastokista dikembangkan dari embrio
vitrifikasi. Berdasarkan hasil tersebut, dapat diasumsikan bahwa prosedur vitrifikasi
menyebabkan perkembangan lebih lanjut dari perubahan apoptosis awal blastokista,
mengubah mereka blastomer menjadi yang terlambat apoptosis dan nekrotik. Di sisi lain, di
blastokista dikembangkan dari embrio vitrifikasi, jumlah blastomer apoptosis awal lebih
tinggi, tetapi rasio sel apoptosis dini untuk jumlah sel tidak berbeda dari kelompok kontrol.
Ini menunjukkan bahwa perkembangan embrio pasca vitrifikasi tidak terpengaruh oleh
vitrifikasi, dan embrio vitrifikasi mampu mengembangkan menjadi kualitas blastocyst yang
baik, mampu membatasi apoptosis pada tahap awal. itu bisa diasumsikan bahwa prosedur
vitrifikasi menyebabkan perkembangan lebih lanjut dari perubahan apoptosis awal
blastokista, mengubah mereka blastomer menjadi yang terlambat apoptosis dan nekrotik. Di
sisi lain, di blastokista dikembangkan dari embrio vitrifikasi, jumlah blastomer apoptosis
awal lebih tinggi, tetapi rasio sel apoptosis dini untuk jumlah sel tidak berbeda dari kelompok
kontrol. Ini menunjukkan bahwa perkembangan embrio pasca vitrifikasi tidak terpengaruh
oleh vitrifikasi, dan embrio vitrifikasi mampu mengembangkan menjadi kualitas blastocyst
yang baik, mampu membatasi apoptosis pada tahap awal. itu bisa diasumsikan bahwa
 13

prosedur vitrifikasi menyebabkan perkembangan lebih lanjut dari perubahan apoptosis awal
blastokista, mengubah mereka blastomer menjadi yang terlambat apoptosis dan nekrotik. Di
sisi lain, di blastokista dikembangkan dari embrio vitrifikasi, jumlah blastomer apoptosis
awal lebih tinggi, tetapi rasio sel apoptosis dini untuk jumlah sel tidak berbeda dari kelompok
kontrol. Ini menunjukkan bahwa pasca vitrifikasi perkembangan embrio tidak terpengaruh
oleh vitrifikasition, dan embrio vitrifikasi dapat berkembang menjadi blastokista berkualitas
baik, mampu membatasi apoptosis pada tahap awal.

Masalah utama blastokista pra-beku adalah komposisi cairan dalam rongga

blastocoel. Rongga ini menyebabkan keterbatasan untuk membekukan akses zat di dalam sel
dan dapat menyebabkan pembentukan es kristal . Untuk menghindari pembentukan es kristal,
diperlukan cryoprotectant konsentrasi tinggi. Cryoprotectant konsentrasi tinggi dapat
membahayakan embrio dan dapat menyebabkan kerusakan sel .Penelitian sebelumnya
menunjukkan bahwa proses vitrifikasi dan proses pemanasan memiliki efek merusak pada
massa sel dala eberapa peneliti menunjukkan bahwa menambahkan media cryopreservasi
dengan antioksidan mengurangi stres oksidatif dan meningkatkan tingkat kelangsungan hidup
embrio. Shehan et al menambahkan askorbat ke larutan kriopreservasi sebagai antioksidan,
kemudian mencit kembali embrio tikus pada tahap pronuklear, tahap 2-sel, tahap 8-sel dan
tahap blastokista dan melaporkan bahwa vitrifikasi ulang embrio tidak mempengaruhi tingkat
kelangsungan hidup dan tingkat degenerasi embrio . Perawatan antioksidan dapat bermanfaat
untuk perkembangan embrio dan diferensiasi sel. Dihipotesiskan bahwa antioksidan dapat
mengais radikal bebas, yang dapat merusak DNA dan membran fosfolipid embrio.

Kehadiran antioksidan dalam larutan kriopreservasi mungkin penjelasan untuk

perbedaan antara hasil kami dan data Shehan. Gayar et al melaporkan bahwa laju
perkembangan in vitro dan in vivo tikus blastosis yang di-vitrifikasi sekali atau dua kali, tidak
menunjukkan perbedaan yang signifikan dengan embrio segar. Selain itu, viabilitas embrio
setelah vitrifikasi tunggal atau berulang, hampir identik. Namun, vitrifikasi yang ketiga tidak
ditoleransi oleh mayoritas embrio. Ini mungkin merupakan indikasi embrio mengalami stres
selama prosedur vitrifikasi berturut-turut. Dilaporkan bahwa embrio tikus pembekuan
berulang tanpa intervensi waktu kultur antara setiap siklus setelah pencairan mengandung
jumlah sel rata-rata yang lebih rendah pada saat penetasan dibandingkan dengan embrio yang
tidak beku .Mekanisme dasar degenerasi oosit dan fragmentasi embrio adalah apoptosis.
 14

Oleh karena itu, penurunan kemampuan perkembangan embrio yang dire-vitrifikasi,

memiliki hubungan dengan regulasi jalur apoptosis. Mirip dengan penelitian saat ini, Dhali el
al melaporkan bahwa kelangsungan hidup yang lebih rendah dan pengembangan zigot
vitrifikasi dan embrio 2-sel dapat dikaitkan dengan kejadian dan regulasi apoptosis
embrionik. Hasil penelitian Dalhi, jelas menunjukkan hubungan yang kuat antara kompetensi
perkembangan yang dikompromikan dan kegiatan transkripsi yang diubah dari gen Bax , Bcl-
2 , dan p53 dalam embrio yang dirawat .

Akibatnya, pembekuan kembali blastokista telah menghasilkan kelahiran yang

sukses. Sebagai kesimpulan, temuan saat ini dengan jelas menunjukkan bahwa embrio yang
di-vitrifikasi dan vitrifikasi memiliki kesamaan dalam tingkat perkembangan dan ekspresi
gen Bax, Bcl2, dan ErbB4 . Namun, laju blastokista dan ekspresi gen Bax,
Bcl2, dan ErbB4 berbeda secara signifikan antara embrio yang dire vitrifikasi dengan embrio
segar. Dampak dari temuan saat ini harus dievaluasi lebih lanjut pada hasil obstetri dan tindak
lanjut jangka panjang dari anak-anak yang dilahirkan setelah vitrifikasi ulang.

BAB VI

PENUTUP
 15

6.1 KESIMPULAN

Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa prosedur pemanasan vitrification-

menghasilkan embrio yang mampu pengembangan lebih lanjut in vitro ke tahap
blastokista dan blastokista yang layak. Dalam embrio vitrifikasi, perubahan apoptosis
tidak mempengaruhi pembentukan blastosit. Padahal, di blastokista, prosedur vitrifikasi
menyebabkan perkembangan perubahan apoptosis dalam beberapa blastomer, namun hal
itu tidak mempengaruhi kelangsungan hidup blastokista secara keseluruhan. Meskipun
vitrifikasi tampaknya aman untuk embrio kucing dan blastokista, masih ada kebutuhan
untuk perbaikan lebih lanjut. Berbeda dengan pembekuan sperma, di mana jutaan
spermatozoa yang tersedia, masing-masing membawa potensi pemupukan yang sama,
embrio dan blastokista mengandung sejumlah sel masing-masing dengan fungsi biologis
yang berbeda. oleh karena itu, kerusakan beberapa sel dalam embrio dapat mempengaruhi
kelangsungan hidup secara keseluruhan, mengurangi hasil kriopreservasi, dan, yang
paling penting, mencegah perkembangan lebih lanjut dari embrio tersebut.

6.2 Saran

Berdasarkan uraian yang telah dijelaskan diatas diharapkan pembaca dapat

memahami benar apa itu apoptosis pada warming embrio. Sehingga nantinya pembaca
dapat menambah pendapatnya atau memperbaiki makalah jika perlu.