Nama : Rusydina Sabila

NPM : 260110160123
Tugas TDR 2

1. Jelaskan regulasi gen yang terjadi didalam sel E.coli BL21 (DE3)!
2. Desain suatu konstruksi gen pengkode insulin dengan menggunakan pET16b!

Jawab :

1. Sel E. coli BL21 (DE3) berbeda dengan sel E. coli BL21. Pada sel E. coli BL21
(DE3) terdapat T7 RNA Polymerase. T7 RNA Polymerase ini sangat berkaitan
erat dengan proses ekspresi gen sehingga harus kuat dan harus dalam keadaan
aktif. Selain itu, E.coli BL21 (DE3) memiliki keunggulan seperti defisiensi
enzim protease yang dapat mendegradasi protein target, dapat memelihara
vektor ekspresi secara stabil, dan memiliki kesesuaian genetik dengen sistem
ekspresi yang ada (Hadi dan Rintis, 2015).
Regulasi yang terjadi di dalam sel E. coli BL21 (DE3) berkaitan erat dengan
lac operon beserta inducernya. Untuk mengaktifkan T7 RNA Polymerase,
dibutuhkan suatu inducer seperti IPTG. IPTG ini merupakan senyawa yang
memiliki struktur mirip dengan alolaktosa. Pada awalnya, sebuah molekul
repressor berikatan pada controlling region di plasmid untuk mencegah
terjadinya ekspresi gen. Namun, ketika IPTG masuk ke dalam lingkungan sel,
ia akan berikatan dengan molekul repressor sehingga menyebabkan repressor
terlepas dari controlling region. Hal ini mengakibatkan RNA polymerase dapat
memulai transkripsi dari operon menghasilkan mRNA. mRNA tersebut
kemudian dibaca oleh ribosom dan dihasilkan 3 protein, yaitu β-galactosidase,
Permease, dan Transasetilase Thiogalaktosida. Permease kemudian menempel
pada membran sel dan berfungsi sebagai jalur untuk laktosa yang berada di luar
sel masuk ke dalam sel. Jika IPTG ini tidak ditambahakn pada media
pertumbuhan, maka T7 tidak akan aktif dan DNA insert tidak akan terekspresi
menghasilkan protein.
Berikut merupakan regulasi T7 sebelum terinduksi dan setelah terinduksi.

(Hyvonen, 2004).
2. Berikut merupakan peta vektor ekspresi pET16b

Desain konstruksi gen pengkode insulin :

Pertama-tama, DNA insert dan vektor ekspresi dipotong dengan enzim

restriksi yang sama. Dipilih dua enzim restriksi yaitu NdeI dan BamHI karena
kedua enzim tersebut terdapat dalam vektor pET-16b dan juga tidak
memotong DNA insert. Pada saat memasukkan DNA insert ke dalam vektor
ekspresi, sebelumnya ditambahkan start codon terlebih dahulu yaitu asam
amino metionin (ATG) agar DNA insert dapat segera diekspresikan. Selain
itu juga perlu ditambahkan His-tag dan stop codon karena His-tag dan stop
codon yang terdapat pada vektor ekspresi pET-16b terletak cukup jauh dari
daerah pemotongan.

Berikut ini adalah rancangan DNA insert untuk vektor pET-16b :

GAA GGT CGT [start codon] [gen pengkode insulin] [His-tag] [Stop Codon]
GGC TGC TAA
 Daftar Pustaka

Hadi, Sapto Nugroho dan Rintis Noviyanti. 2015. Strategi Kloning dan Ekspresi Gen
var2csa pada Sistem Escherichia coli sebagai Langkah Pendahuluan untuk
Ekspresi Gen pada Sistem Eukariot Tanaman. Agrin. Vol. 19: (1).

Hyvonen, M. 2004. E. coli Regulation System. Available at

https://rega.kuleuven.be/bac/economou/files/pdf/manuals/e-coli-expression-
systems.pdf (Diakses pada 3 April 2020).