LAMPIRAN

69
 70

LAMPIRAN
Lampiran 1. Surat Laik Etik
 71

Lampiran 2. Determinasi Semut Jepang (Ulomoides dermestoides)

 72

Lampiran 3. Surat Keterangan Ekstraksi Semut Jepang (Ulomoides

 73

dermestoides)

Lampiran 4. Hasil Uji Flavonoid dari Ekstrak Etanol Semut Jepang (Ulomoides
 74

dermestoides)

Lampiran 5. Hasil Uji Glukosa Darah Akhir

 75

Lampiran 6. Imunohistokimia Ekspresi TNF-α Pada Organ Pankreas

 76

A. Hasil Axio Vixion Setiap Ulangan

Kelompok Ulangan Rataan Kontrol

Perlakuan I II III IV TNF-α
K(1) 0,21 0,17 0,25 0,19 0,21±0,03a
K(2) 0,40 0,44 0,44 0,47 0,44±0,03b
P(1) 0,19 0,25 0,16 0,14 0,19±0,05a
P(2) 0,20 0,12 0,16 0,28 0,26±0,02a
P(3) 0,23 0,25 0,27 0,27 0,26±0,10a

B. Perhitungan Persen Area

1. Kontrol Negatif (K1)

Rataan Kontrol Negatif (K1) ─ Rataan Kontrol Negatif (K1) × 100%
= Rataan Kontrol Positif (K2)
0,21 ─ 0,21
= 0,44 × 100%
0%
=
2. Kontrol Positif (K2)
Rataan Kontrol Positif (K2) ─ Rataan Kontrol Negatif (K1) × 100%
= Rataan Kontrol Negatif (K1)
0,44 ─ 0,21
= 0,21 × 100%
109 %
=
3. Perlakuan 1 (2,3 mg/kg BB)
Rataan Kontrol Positif (K2) ─ Rataan Perlakuan 1
= Rataan Kontrol Positif (K2) × 100%
0,44 ─ 0,19
= 0,44 × 100%
56 %
=
4. Perlakuan 2 (4,6 mg/kg BB)
Rataan Kontrol Positif (K2) ─ Rataan Perlakuan 2
= Rataan Kontrol Positif (K2) × 100%
0,44 ─ 0,26
= 0,44 × 100%
41 %
=
5. Perlakuan 3 (9,2 mg/kg BB)
Rataan Kontrol Positif (K2) ─ Rataan Perlakuan 3
= × 100%
 77

Rataan Kontrol Positif (K2)

0,44 ─ 0,26
= 0,44 × 100%
41 %
=
C. Tabel Ekspresi Tumor Necrosis Factor (TNF-α) Pada Tikus Perlakuan

Peningkatan Penurunan
Rata-Rata
Kelompok Ekspresi TNF-α Ekspresi TNF-α
Ekspresi TNF-α
Perlakuan Terhadap Kontrol Terhadap Kontrol
(%) ± SD
Negatif (%) Positif (%)
K(1) 0,21±0,03a 0 ─
K(2) 0,44±0,03b 109 ─
P(1) 0,19±0,05a ─ 56
P(2) 0,26±0,02a ─ 41
P(3) 0,26±0,10a ─ 41

Lampiran 7. Skema Penelitian

Tikus Putih (Rattus novergicus)

 78

Kelompok K1 Kelompok K2 Kelompok P1 Kelompok P2 Kelompok P3

(Kontrol Negatif) (Kontrol Positif) (Perlakuan 1) (Perlakuan 2) (Perlakuan 3)

Adaptasi selama 7 hari

Pemberian Streptozotocin 20 mg/kg BB selama 5 hari

Proses Diabetes Mellitus Tipe 1 (DMT1) selama 14 hari

Pemberian Pemberian Pemberian

ekstrak semut ekstrak semut ekstrak semut
jepang 2,3 jepang 4,6 jepang 9,2
mg/kg BB mg/kg BB mg/kg BB
selama 14 selama 14 hari selama 14
hari hari

Dibedah pada hari ke-34

perlakuan

Pembedahan Tikus

Organ Pankreas

Pewarnaan HE Imunohistokimia

Histologis Pankreas Ekspresi TNF-α

Lampiran 8. Pembuatan Ekstrak Etanol Semut Jepang (Ulomoides dermestoides)
Semut Jepang
(Ulomoides
dermestoides)
 79

- ditimbang terlebih dahulu

- dikeringkan menggunakan oven dengan suhu 45oC
- digerus sampai menjadi serbuk
- dimasukkan ke dalam toples, diratakan dan ditambahkan pelarut
etanol 70% sampai terendam (pelarut yang digunakan minimal 2 kali
berat bahan)
- ditutup toples dengan rapat selama 72 jam
- diaduk diatas shaker digital dengan kecepatan 50 rpm
- disaring ekstrak cair dengan kertas saring
- ditampung dalam erlenmeyer
- diuapkan ekstrak cair dengan rotary evaporator dengan suhu 50oC
selama kurang lebih 1 jam 30 menit
- diuapkan kembali ekstrak di atas penangas air selama 2 jam

Hasil

Lampiran 9. Perhitungan Dosis Terapi Ekstrak Etanol Semut Jepang (Ulomoides

dermestoides)
 80

Perhitungan dosis terapi adalah diasumsikan bahwa berat seluruh tikus putih

(Rattus novergicus) usia tua yaitu 200 gram. Setiap kelompok perlakuan terdapat 4

ekor tikus putih (Rattus novergicus) dan setiap tikus putih (Rattus novergicus)

disonde dengan ekstrak etanol semut jepang (Ulomoides dermestoides) sebanyak 1

mL. Pembuatan dosis Ekstrak semut jepang (Ulomoides dermestoides) dilebihkan 1

ekor tikus putih (Rattus novergicus), sehingga menjadi 5 ekor tikus. Hal ini bertujuan

untuk mengantisipasi ekstrak yang tertinggal di dalam disposable syringe, sehingga

diharapkan dosis yag masuk tetap sesuai dengan perhitungan. Rincian perhitungan

dosis ekstrak etanol semut jepang (Ulomoides dermestoides) yang digunakan adalah

sebagai berikut :

Dosis 1

Dosis Ekstrak Semut Jepang (Ulomoides dermestoides) 2,3 mg/kg BB

D1 = Berat badan × dosis × jumlah tikus putih (Rattus novergicus)

= 0,2 kg × 2,3 mg/kg BB × 5 ekor

= 2,3 mg
Ekstrak Semut Jepang
(Ulomoides
dermestoides)

- ditimbang sebanyak 2,3 mg

- dimasukkan ke dalam erlemeyer
- ditambah pengencer hingga volume menjadi 5 mL
- diaduk hingga homogen

Hasil

Dosis 2

Dosis Ekstrak Semut Jepang (Ulomoides dermestoides) 4,6 mg/kg BB

 81

D2 = Berat badan × dosis × jumlah tikus putih (Rattus novergicus)

= 0,2 kg × 4,6 mg/kg BB × 5 ekor

= 4,6 mg
Ekstrak Semut Jepang
(Ulomoides
dermestoides)

- Ditimbang sebanyak 4,6 mg

- Dimasukkan ke dalam erlemeyer
- Ditambah pengencer hingga volume menjadi 5 mL
- Diaduk hingga homogen

Hasil

Dosis 3

Dosis Ekstrak Semut Jepang (Ulomoides dermestoides) 9,2 mg/kg BB

D3 = Berat badan × dosis × jumlah tikus putih (Rattus novergicus)

= 0,2 kg × 9,2 mg/kg BB × 5 ekor

= 9,2 mg
Ekstrak semut jepang
(Ulomoides
dermestoides)

- Ditimbang sebanyak 9,2 mg

- Dimasukkan ke dalam erlemeyer
- Ditambah pengencer hingga volume menjadi 5 mL
- Diaduk hingga homogen

Hasil

Lampiran 10. Pembuatan Preparat Histologis Pankreas dengan Pewarnaan HE

Fiksasiorgan dimasukkan dalam formaldehid

 82

Dehidrasi alkohol bertingkat dari konsentrasi 70% 24

jam, etanol 80% 2 jam, etanol 90% , 95%, dan etanol
absolut 20 menit

Penjernihan  rendam jaringan dalam larutan xylol I

selama 20 menit dan xylol II selama 30 menit

Infiltrasi dan embeeding blok parafin pada

inkubator bersuhu 56-58oC

Cetakan dijepit dalam mikrotom dan jaringan dipotong

ketebalan 5 μm. Sediaan disimpan dalam inkubator suhu
38-40oC 24 jam
.

Deparafinasixylol I dan II

Rehidrasietanol absolut,
95%, 90%, 80%, 70%

Dicuci air mengalir

Pewarnaan Hematoxylin 10 menit

Ducuci air mengalir

Pewarnaan eosin 5 menit

DehidrasiEtanol absolut, Mountain dengan Pengamatan histopatologi

95%, 90%, 80%, 70% entellan

Lampiran 11. Metode Imunohistokimia

 83

Deparafinisasi (xylol I, xylol II) dan Redehidrasi

(alkohol bertingkat 100%, 95%, 90%, 80%, 70%)

3% H2O2 selama 15 menit

Pencucian dengan DW/MQ 100 µl 5-10 menit

Dicuci PBS 100 µl 5-10 menit

Normal serum 10% dalam PBS (lalu ditutup rapat dan inkubasi suhu ruang selama 30-60 menit)

Dicuci PBS 100 µl 5 menit

Antibodi primer TNF-α dan inkubasi pada suhu 40 C semalam

Dicuci PBS 100 µl 10 menit

Antibodi sekunder universal dan inkubasi pada
suhu ruang 30-60 menit (dalam suanana gelap)

Dicuci PBS 100 µl 5 menit

Kromagen DAB (diamino benzidine) 10 gram dakam tris buffer 50

cc yang dicampur H202 50 µl, lalu ditutup selama 25 menit

Dicuci atau dimasukkan dalam DW/MQ

Counterstain dengan Hematoksilin
10-15 menit

Dehidrasi dengan alkohol bertingkat, lalu clearing dengan xylol I, II

dan III, dan Mounting

Pengamatan di bawah mikroskop

Lampiran 12. Hasil Analisa Statistika Ekspresi TNF-α (P>0,05)

 84

A. Uji Normalitas Data

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test

Ekspresi TNF-
Perlakuan alpha

N 20 20
a,b
Normal Parameters Mean 3,00 ,256260
Std. Deviation 1,451 ,1048507
Most Extreme Differences Absolute ,155 ,186
Positive ,155 ,186
Negative -,155 -,124
Test Statistic ,155 ,186
c,d
Asymp. Sig. (2-tailed) ,200 ,068c

a. Test distribution is Normal.

b. Calculated from data.
c. Lilliefors Significance Correction.
d. This is a lower bound of the true significance.

B. Statistika Deskriptif

Descriptives
Ekspresi TNF-alpha

95% Confidence Interval for Mean

N Mean Std. Deviation Std. Error Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum

Kontrol Negatif 4 ,207875 ,0336442 ,0168221 ,154340 ,261410 ,1734 ,2522

Kontrol Positif 4 ,439400 ,0257278 ,0128639 ,398461 ,480339 ,4064 ,4688
Pemberian 2,3 mg/Kg BB
4 ,186550 ,0487657 ,0243829 ,108953 ,264147 ,1366 ,2508
Ekstrak Semut Jepang
Pemberian 4,6 mg/Kg BB
4 ,191875 ,0718994 ,0359497 ,077467 ,306283 ,1182 ,2866
Ekstrak Semut Jepang
Pemberian 9,2 mg/Kg BB
4 ,255600 ,0208838 ,0104419 ,222369 ,288831 ,2300 ,2752
Ekstrak Semut Jepang
Total 20 ,256260 ,1048507 ,0234453 ,207188 ,305332 ,1182 ,4688

C. Uji Homogenitas Data

 85

Test of Homogeneity of Variances

Ekspresi TNF-alpha

Levene Statistic df1 df2 Sig.

1,615 4 15 ,222

D. Uji One Way ANOVA

ANOVA
Ekspresi TNF-alpha

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between Groups ,180 4 ,045 22,954 ,000

Within Groups ,029 15 ,002
Total ,209 19

E. Uji Lanjutan (Posthoc Test) menggunakan Uji Tukey

Multiple Comparisons
Dependent Variable: Ekspresi TNF-alpha
Tukey HSD

Mean Difference 95% Confidence Interval

(I) Perlakuan (J) Perlakuan Std. Error Sig.
(I-J) Lower Bound Upper Bound

Kontrol Positif -,2315250* ,0312692 ,000 -,328082 -,134968

Pemberian 2,3 mg/Kg BB

,0213250 ,0312692 ,957 -,075232 ,117882
Ekstrak Semut Jepang
Kontrol Negatif Pemberian 4,6 mg/Kg BB
,0160000 ,0312692 ,985 -,080557 ,112557
Ekstrak Semut Jepang

Pemberian 9,2 mg/Kg BB

-,0477250 ,0312692 ,562 -,144282 ,048832
Ekstrak Semut Jepang
Kontrol Negatif ,2315250* ,0312692 ,000 ,134968 ,328082
Pemberian 2,3 mg/Kg BB
,2528500* ,0312692 ,000 ,156293 ,349407
Ekstrak Semut Jepang
Kontrol Positif Pemberian 4,6 mg/Kg BB
,2475250* ,0312692 ,000 ,150968 ,344082
Ekstrak Semut Jepang
Pemberian 9,2 mg/Kg BB
,1838000* ,0312692 ,000 ,087243 ,280357
Ekstrak Semut Jepang
Kontrol Negatif -,0213250 ,0312692 ,957 -,117882 ,075232
 86

Kontrol Positif -,2528500* ,0312692 ,000 -,349407 -,156293

Pemberian 2,3 mg/Kg Pemberian 4,6 mg/Kg BB
-,0053250 ,0312692 1,000 -,101882 ,091232
BB Ekstrak Semut Ekstrak Semut Jepang
Jepang Pemberian 9,2 mg/Kg BB
-,0690500 ,0312692 ,229 -,165607 ,027507
Ekstrak Semut Jepang
Kontrol Negatif -,0160000 ,0312692 ,985 -,112557 ,080557
Kontrol Positif -,2475250* ,0312692 ,000 -,344082 -,150968
Pemberian 4,6 mg/Kg
Pemberian 2,3 mg/Kg BB
BB Ekstrak Semut ,0053250 ,0312692 1,000 -,091232 ,101882
Ekstrak Semut Jepang
Jepang
Pemberian 9,2 mg/Kg BB
-,0637250 ,0312692 ,296 -,160282 ,032832
Ekstrak Semut Jepang
Kontrol Negatif ,0477250 ,0312692 ,562 -,048832 ,144282

Kontrol Positif -,1838000* ,0312692 ,000 -,280357 -,087243

Pemberian 9,2 mg/Kg
Pemberian 2,3 mg/Kg BB
BB Ekstrak Semut ,0690500 ,0312692 ,229 -,027507 ,165607
Ekstrak Semut Jepang
Jepang
Pemberian 4,6 mg/Kg BB
,0637250 ,0312692 ,296 -,032832 ,160282
Ekstrak Semut Jepang

*. The mean difference is significant at the 0.05 level.

Ekspresi TNF-alpha
a
Tukey HSD

Subset for alpha = 0.05

Perlakuan N 1 2

Pemberian 2,3 mg/Kg BB

4 ,186550
Ekstrak Semut Jepang
Pemberian 4,6 mg/Kg BB
4 ,191875
Ekstrak Semut Jepang
Kontrol Negatif 4 ,207875
Pemberian 9,2 mg/Kg BB
4 ,255600
Ekstrak Semut Jepang
Kontrol Positif 4 ,439400
Sig. ,229 1,000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 4,000.

Lampiran 13. Hasil Pengukuran Kadar Glukosa Darah Tikus

 87

Kadar Glukosa Darah Tikus (Sebelum Diinduksi Streptozotocin)

No. K1 K2 P1 P2 P3
1. 82 mg/dL 108 mg/dL 133 mg/dL 141 mg/dL 119 mg/dL
2. 113 mg/dL 131 mg/dL 128 mg/dL 127 mg/dL 121 mg/dL
3. 101 mg/dL 129 mg/dL 100 mg/dL 71 mg/dL 136 mg/dL
4. 78 mg/dL 113 mg/dL 117 mg/dL 134 mg/dL 142 mg/dL

Kadar Glukosa Darah Tikus (Setelah 7 Hari Diinduksi Streptozotocin)

No. K1 K2 P1 P2 P3
1. ─ 211 mg/dL 215 mg/dL 248 mg/dL 317 mg/dL
2. ─ 243 mg/dL 273 mg/dL 263 mg/dL 267 mg/dL
3. ─ 208 mg/dL 294 mg/dL 278 mg/dL 253 mg/dL
4. ─ 253 mg/dL 281 mg/dL 216 mg/dL 298 mg/dL

Kadar Glukosa Darah Tikus (Setelah 14 Hari Pemberian Terapi)

No. K1 K2 P1 P2 P3
1. ─ ─ 176 mg/dL 213 mg/dL 398 mg/dL
2. ─ ─ 197 mg/dL 237 mg/dL 233 mg/dL
3. ─ ─ 195 mg/dL 227 mg/dL 260 mg/dL
4. ─ ─ 121 mg/dL 205 mg/dL 252 mg/dL

Keterangan :

= Peningkatan

= Penurunan

Berdasarkan data berikut diketahui terjadi peningkatan kadar glukosa darah

tikus putih (melebihi batas ambang 200 mg/dL), setelah tikus diinduksi

Streptocotocin yang menandakan bahwa tikus putih telah menderita Diabetes

Mellitus Tipe 1. Kemudian, penurunan kadar glukosa darah kembali terjadi

mendekati normal setelah tikus putih diberi terapi ekstrak etanol semut jepang.
 88

Sehingga dapat dibuktikan bahwa pemberian terapi ekstrak semut jepang efektif

untuk menurunkan kadar glukosa darah tikus model Diabetes mellitus Tipe 1.

Lampiran 14. Gambaran Hasil Presentase Area Ekspresi TNF-α pada Semua
Perlakuan Menggunakan Software ImmunoRatio dengan Metode
IHK
 89

A B C

D E

Keterangan : (A) tikus kontrol negatif (K1); (B) tikus kontrol positif (K2); (C) tikus
dengan dosis terapi 2,3 mg/kg BB (P1); (D) tikus dengan dosis terapi
4,6 mg/kg BB (P2); (E) tikus dengan dosis terapi 9,2 mg/kg BB (P3)