Darmawan, 2012, Penetapan Kadar Kafein Dan Teobromin Dengan KCKT PDF

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PENETAPAN KADAR TEOBROMIN DAN KAFEIN DALAM EKSTRAK

SERBUK COKELAT MERK “X” MENGGUNAKAN METODE
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)
Program Studi Farmasi
The image cannot be display ed. Your computer may not hav e enough memory to open the image, or the image may
hav e been corrupted. Restart y our computer, and then open the file again. If the red x still appears, y ou may hav e to
d elete the image and then insert it again.
Oleh:
Melisa Darmawan
NIM : 088114162
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2012
i
ii
iii
HALAMAN PERSEMBAHAN
Kupersembahkan karyaku ini untuk:

Tuhan Yesus Kristus yang sangat luar biasa
Kedua orang tuaku tersayang
Kakak-kakakku tercinta
Sahabat dan teman-temanku
Almamater yang kubanggakan
iv
v
vi
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Kuasa atas
segala limpahan berkat dan kasih-Nya sehingga penelitian dan penyusunan skripsi
yang berjudul “Penetapan Kadar Teobromin dan Kafein dalam Ekstrak Serbuk
Cokelat Merk “X” Menggunakan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase
Terbalik” dapat diselesaikan dengan baik. Skripsi ini disusun sebagai salah satu
syarat untuk meraih gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) di Fakultas Farmasi,
Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Dalam pelaksanaan penelitian hingga selesainya penyusunan skripsi ini,
penulis mendapat banyak dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena
itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada:
1. Ipang Djunarko, M. Sc., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta.
2. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M. S., Apt. selaku dosen pembimbing yang
dengan sabar memberikan pengarahan, masukan, kritik dan saran baik selama
penelitian maupun penyusunan skripsi ini.
3. Jeffry Julianus, M. Si. selaku dosen penguji yang telah memberikan saran dan
kritik yang membangun dalam penyusunan skripsi dan dosen pembimbing
akademik atas bimbingan dan semangat yang telah diberikan.
4. Lucia Wiwid Wijayanti, M. Si. selaku dosen penguji yang telah memberikan
saran dan kritik yang membangun dalam penyusunan skripsi.
vii
5. Rini Dwiastuti, M. Sc, Apt. selaku Kepala Laboratorium Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
6. Seluruh Dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah
memberikan ilmu demi kemajuan mahasiswa dalam bidang farmasi.
7. Seluruh staf laboratorium kimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma:
Mas Bimo, Mas Parlan, Mas Kunto, Mas Otok, dan Pak Ketul yang telah
banyak membantu selama penelitian di laboratorium.
8. Perpustakaan Universitas Sanata Dharma atas koleksi buku-buku dan fasilitas
internet sehingga mempermudah penulis dalam memperoleh bahan-bahan
yang dibutuhkan dalam penulisan skripsi ini.
9. Keluargaku tercinta, Papa Iwan Darmawan, Mama Maria Ningrum D, Mam
Christiana, Tante Lian, Ci Fen2, Oh Rudy, Ci Cen2, yang tidak pernah
berhenti memberikan semangat dan doa sampai terselesaikannya skripsi ini.
10. Eka Riusinta Wati dan Monica Satya R. Y, teman seperjuangan, tempat
berbagi keluh kesah dan kegembiraan selama penelitian dan penyusunan
skripsi.
11. Keluarga kedua sekaligus sahabat-sahabatku Sari Tambunan, Novie Imoliana,
Ade Mauryn, Devi Sinaga, Mariana, Octo Rahadian Pius, Ana Sofiana, Agnes
Fajarwati, Cornelius Brian, Sisca Devi, dan Gary. Terima kasih untuk
semangat, kebersamaan, canda, tawa, suka, duka yang telah kita lalui bersama.
12. Grup “antistress” Yuni Rogan, Elisa Aster, Dhimas Bayu Kinasih, Rosita
Secoadi, Vinsencia Vica, Heppy, Paul, Adi Wirasaputra, Velly, Novie
viii
Imoliana, dan Meiske Munda. Terima kasih untuk diskusi dan
kebersamaannya selama penelitian di laboratorium.
13. Kelompok praktikum C2, Dian, Yuni, Elisa, Seco, Uchan, Satya, Vica, Asti,
dan Tika yang telah memberikan pengalaman berharga, keceriaan,
kebersamaan, suka duka selama praktikum serta telah memberikan semangat
dalam penyusunan dan ujian skripsi.
14. Sari Tambunan, Elya, Rika, Dina, Amel, Wiwik, There, Citra, Nona yang
telah berbagi pengalaman, informasi, masukan, serta telah memberikan
semangat dan dukungan secara moril.
15. Teman-teman FST A dan B atas kebersamaan, tawa, canda, cerita dan
kekompakan yang begitu indah dan tak terlupakan.
16. Keluarga besar kost “Sari Ayu I”, Ibu Anti, Opung Devi, Morin, Novie,
Marjan, Inang, Monik, Kak Yanti, Nina, Rotua, Yoestenia, Iness, Kak Ade,
Vina, Ika Lestari, dan Jolina atas semangat yang diberikan kepada penulis
dalam penyusunan dan ujian skripsi.
17. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu yang telah membantu
penulis dalam mewujudkan skripsi ini.
Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penyusunan
skripsi ini, sehingga segala kritik dan saran yang membangun sangat penulis
harapkan. Semoga skripsi ini membantu dan bermanfaat bagi pembaca pada
khususnya dan ilmu pengetahuan pada umumnya.
Penulis
ix
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ……………………………………………………… i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING …………………….……. ii
HALAMAN PENGESAHAN ……………………………………….…… iii
HALAMAN PERSEMBAHAN …………………………………….……. iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA …………………………………. v
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ….. vi
PRAKATA ………………………………………………………..………. vii
DAFTAR ISI ………………………………………………..…………….. x
DAFTAR TABEL ……………………………………………..………….. xiv
DAFTAR GAMBAR ………………………………………..…………….. xv
DAFTAR LAMPIRAN ………………………………………..………….. xvii
INTISARI ………………………………………………..………………... xviii
ABSTRACT …………………………………………………..……………. xix
BAB I. PENGANTAR …………………………………………..………... 1
A. Latar Belakang …………………………………………………..…….. 1
1. Permasalahan ………………………………………………..…….. 5
2. Keaslian Penelitian …………………………………………..……. 5
3. Manfaat Penelitian ……………………………………………..….. 6
B. Tujuan Penelitian ………………………………………………..…….. 6
BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA ……………………………………. 8
x
A. Cokelat (Theobroma cocoa) …...……………………………………… 8
B. Penyarian ……………………………………………………………… 9
1. Ekstrak …………………………………………………………….. 10
2. Cairan Penyari ………………………………...…………………... 10
3. Metode Ekstraksi secara Soxhletasi ………………………………. 11
C. Teobromin …………………………………………………………….. 13
D. Kafein ……………………………………………………………...….. 14
E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi …………………………………….. 16
1. Definisi dan Instrumentasi ………………………………………… 16
2. Pembagian Jenis Kromatografi ……………………………………. 17
3. Kromatografi Partisi ………………………………………………. 18
4. Pemisahan Puncak dalam Kromatografi ……...…………………... 23
5. Analisis Kualitatif dan Kuantitatif ………………………………… 25
F. Keterangan Empiris …………………………………………………… 26
BAB III. METODE PENELITIAN ………………………………………. 28
A. Jenis dan Rancangan Penelitian ……………………………………….. 28
B. Variabel Penelitian ……………………………………………………. 28
C. Definisi Operasional …………………………………………………... 29
D. Bahan Penelitian ………………………………………………………. 29
E. Alat Penelitian ………………………………………………………… 30
F. Tata Cara Penelitian …………………………………………………... 30
1. Pemilihan Sampel …………………………………………………. 30
2. Pembuatan Fase Gerak ……………………………………………. 31
xi
3. Pembuatan Larutan Stok Teobromin dan Kafein …………………. 31
4. Pembuatan Larutan Intermediet Teobromin dan Kafein ………….. 31
5. Pembuatan Seri Larutan Baku Campuran Teobromin dan Kafein ... 32
6. Penetapan Panjang Gelombang Maksimum Teobromin dan Kafein
dengan Spektrofotometer UV …………………………………….. 32
7. Pembuatan Kurva Baku Teobromin dan Kafein ………………….. 33
8. Pembuatan Larutan NaOH 0,1 M …………………………………. 33
9. Penetapan Jumlah Sirkulasi Ekstraksi dengan Metode Soxhletasi
yang Menghasilkan Kadar Teobromin dan Kafein Maksimum …... 33
10. Preparasi Sampel ………………………………………………….. 34
11. Penetapan Kadar Teobromin dan Kafein dalam Sampel dengan
Penambahan Larutan Baku Campuran Teobromin dan Kafein……. 35
12. Penetapan Kadar Campuran Teobromin dan Kafein dalam Sampel. 36
G. Analisis Hasil ………………………………………………………….. 37
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ………………………………… 38
A. Pemilihan Sampel ……………………………………………………... 38
B. Pembuatan Fase Gerak ………………………………………………... 40
C. Pembuatan Larutan Baku Teobromin dan Kafein …………………….. 42
D. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Teobromin dan Kafein
dengan Spektrofotometer UV …………………………………………. 44
E. Pembuatan Kurva baku Teobromin dan Kafein ………………………. 47
F. Preparasi Sampel Serbuk Cokelat dengan Ekstraksi secara Soxhletasi . 48
G. Jumlah Sirkulasi Ekstraksi Teobromin dan Kafein dalam Serbuk
xii
Cokelat yang Menghasilkan Kadar Maksimum ………………………. 53
H. Analisis Kuallitatif Berdasarkan Waktu Retensi (tR) Teobromin dan
Kafein …………………………………………………………………. 57
I. Penetapan Kadar Teobromin dan Kafein dalam Sampel dengan
Penambahan Larutan Baku Campuran Teobromin dan Kafein ……….. 61
J. Penetapan Kadar Teobromin dan Kafein dalam Ekstrak Serbuk
Cokelat ………………………………………………………………… 62
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN …………………………………. 64
A. Kesimpulan ……………………………………………………………. 64
B. Saran …………………………………………………………………... 64
DAFTAR PUSTAKA …………………………………………………….. 66
LAMPIRAN ………………………………………………………………. 70
BIOGRAFI PENULIS ……………………………………………………. 100
xiii
DAFTAR TABEL
Tabel I Indeks polaritas beberapa pelarut ……………………………….. 22
Tabel II Pembuatan larutan campuran teobromin dan kafein ……………. 36
Tabel III Persyaratan keseragaman bobot kemasan serbuk cokelat ………. 39
Tabel IV Kadar rata-rata teobromin pada penetapan jumlah sirkulasi

55
ekstraksi ………………………………………………………….
Tabel V Kadar rata-rata kafein pada penetapan jumlah sirkulasi ekstraksi. 56
Tabel VI Perhitungan kadar teobromin dan kafein dalam ekstrak serbuk
cokelat …………………………………………………………... 63
xiv
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1 Cokelat (Theobroma Cacao) ………………………………... 8
Gambar 2 Diagram Soxhlet extractor ………………………………...... 11
Gambar 3 Struktur teobromin ……………………………….................. 14
Gambar 4 Struktur kafein ……………………………...…….................. 14
Gambar 5 Peralatan KCKT ………………………………...................... 17
Gambar 6 Mekanisme pemisahan kromatografi partisi ………………... 18
Gambar 7 Reaksi silanasi ………………………………......................... 20
Gambar 8 Reaksi pembuatan kolom oktadesilsilan ……………………. 20
Gambar 9 Pemisahan dua senyawa ……………………………….......... 24
Gambar 10 Struktur trietilamin ……………………………….................. 42
Gambar 11 Interaksi trietilamin dengan residu silanol dalam kolom C18 .. 42
Gambar 12 Gugus kromofor dan auksokrom teobromin dan kafein …….. 45
Gambar 13 Spektra serapan teobromin dan kafein dalam pelarut
akuabides panas (suhu 80oC) dengan λmaks = 275 nm ………. 45
Gambar 14 Kurva hubungan antara jumlah teobromin dengan respon
AUC ………………………………………………………… 48
Gambar 15 Kurva hubungan antara jumlah kafein dengan respon AUC ... 48
Gambar 16 Reaksi pembasaan teobromin menggunakan larutan NaOH
0,1 M ………………………………....................................... 51
Gambar 17 Reaksi pembasaan kafein menggunakan larutan NaOH 0,1 M 51
Gambar 18 Kurva hubungan antara jumlah sirkulasi ekstraksi vs kadar
xv
teobromin (% b/b) pada penetapan jumlah sirkulasi ekstraksi. 54
Gambar 19 Kurva hubungan antara jumlah sirkulasi ekstraksi vs kadar
kafein (% b/b) pada penetapan jumlah sirkulasi ekstraksi ….. 55
Gambar 20 Kromatogram baku campuran teobromin (60 ppm) dan
kafein (30 ppm) ………………………………....................... 57
Gambar 21 Kromatogram sampel ekstrak serbuk cokelat ………………. 58
Gambar 22 Gugus non polar teobromin dan kafein ……………………... 59
Gambar 23 Interaksi teobromin dengan fase diam C18 melalui interaksi
van Der Waals ………………………………......................... 59
Gambar 24 Interaksi kafein dengan fase diam C18 melalui interaksi van
Der Waals ………………………………................................ 60
Gambar 25 Interaksi teobromin dengan fase gerak metanol :
akuabides/TEA 3% (40 : 60, v/v) melalui interaksi hidrogen . 60
Gambar 26 Interaksi kafein dengan fase gerak metanol : akuabides/TEA
3% (40 : 60, v/v) melalui interaksi hidrogen ………………... 61
xvi
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1 Sertifikat analisis teobromin ……………………………….. 71
Lampiran 2 Sertifikat analisis kafein …………………………………… 72
Lampiran 3 Penimbangan serbuk cokelat tiap kemasan untuk
perhitungan keseragaman bobot sampel serbuk cokelat……. 73
Lampiran 4 Penimbangan sampel serbuk cokelat ………………………. 74
Lampiran 5 Penimbangan bobot tetap ekstrak cokelat ………………….. 76
Lampiran 6 Kromatogram sampel penetapan jumlah sirkulasi ekstraksi .. 78
Lampiran 7 Kromatogram sampel menggunakan 34 kali sirkulasi ……... 86
Lampiran 8 Data kadar teobromin penentuan jumlah sirkulasi ………… 90
Lampiran 9 Data kadar kafein penentuan jumlah sirkulasi ……………... 92
Lampiran 10 Data kadar teobromin dan contoh perhitungan kadar
teobromin …………………………………………………... 94
Lampiran 11 Data kadar kafein dan contoh perhitungan kadar kafein …... 96
Lampiran 12 Perhitungan konversi kadar teobromin dan kafein dalam
kemasan (45 gram) ………………………………………… 98
Lampiran 13 Perhitungan CV teobromin dan kafein dalam sampel ……... 99
xvii
INTISARI
Teobromin dan kafein merupakan dua komponen yang terdapat dalam

serbuk cokelat. Kombinasi teobromin dan kafein dalam suatu sediaan dapat
meningkatkan efek farmakologis yang diberikan. Penelitian ini bertujuan untuk
mengetahui jumlah sirkulasi ektraksi yang menghasilkan kadar maksimum dan
menetapkan kadar teobromin dan kafein dalam ekstrak serbuk cokelat dengan
menggunakan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental deskriptif.
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik yang digunakan adalah
suatu sistem dengan kondisi optimal dan memenuhi parameter validasi. Sistem
KCKT fase terbalik yang optimal menggunakan fase diam Kromasil
Oktadesilsilan C-18 (100-5C18) merek KNAUER dimensi 250 mm x 4,6 mm,
ukuran partikel 5 µm, fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60, v/v),
kecepatan alir 0,8 mL/ menit dengan detektor UV pada λ maks 275 nm.
Jumlah sirkulasi ekstraksi yang memberikan kadar teobromin dan kafein
yang maksimum adalah sebanyak 37 kali sirkulasi. Kadar teobromin dan kafein
dalam serbuk cokelat yang diteliti, yaitu 0,11 % (b/b) dengan nilai CV = 2,10%
untuk teobromin dan 0,09 % (b/b) dengan nilai CV = 1,98% untuk kafein.
Kata kunci: teobromin, kafein, KCKT fase terbalik, soxhletasi, penetapan

kadar, serbuk cokelat
xviii
ABSTRACT
Theobromine and caffeine are two components in chocolate powder. The

combination of theobromine and caffeine in a product can increase the
pharmacologic effect. This study aims to determine the concentration maximum
extraction circulation and determine theobromine and caffeine in cocoa powder
extract using High Performance Liquid Chromatography (HPLC).
This study is an experimental descriptive. The reversed phase High
Performance Liquid Chromatography (HPLC) which is used is a system with
optimum condition and fulfill the validation parameters. The optimal conditions
of HPLC system is used stationary phase chromasil octadecylsylane C-18 (100-
5C-18) 5 µm merk KNAUER 250 mm x 4.6 mm, mobile phase methanol :
aquabides/TEA 3% (40 : 60, v/v), flow rate 0.8 mL/min with UV detector at
wavelength 275 nm.
The extraction circulation amount which provide the maximum
concentration of theobromine and caffeine is 37 circulations. The concentration
of theobromine and caffeine in chocolate powder are 0.11% (w/w) with the value
of CV = 2.10% for theobromine and 0.09% (w/w) with the value of CV = 1.98%
for caffeine.
Keywords: theobromine, caffeine, reverse phase HPLC, soxhletasi, determination,

cocoa powder
xix
BAB I
PENGANTAR
A. Latar Belakang
Cokelat merupakan makanan yang tidak asing lagi di tengah masyarakat
sekarang ini, bahkan cokelat merupakan makanan yang digemari segala usia
mulai dari anak-anak sampai orang tua. Perkembangan teknologi membuat
cokelat tidak hanya dinikmati dalam bentuk buah cokelat saja, namun sekarang ini
cokelat dapat diolah menjadi beranekaragam bentuk makanan, diantaranya cokelat
batangan, permen cokelat, biskuit cokelat, ice cream, minuman, dan serbuk
cokelat (Mutiara, 2011). Serbuk cokelat merupakan salah satu bentuk cokelat
yang sering digunakan sebagai campuran dalam pembuatan beranekaragam
makanan, antara lain roti cokelat, pudding cokelat, dan susu cokelat.
Banyak masyarakat menggemari berbagai makanan yang terbuat dari
cokelat, namun hanya sedikit orang yang mengetahui kandungan dalam cokelat
yang sering mereka konsumsi. Cokelat merupakan makanan yang terbuat dari biji
buah kakao (cacao) yang dijemur atau dikeringkan selanjutnya digiling dan
ditambahkan bahan-bahan lainnya seperti mentega, gula dan susu bubuk,
melewati beberapa proses produksi hingga menghasilkan batangan-batangan
cokelat (Utami, 2011).
Cokelat mengandung dua komponen utama, yaitu: teobromin dan kafein.
Efek farmakologis teobromin serupa dengan kafein, tetapi dalam jumlah yang
sama efek teobromin lebih kecil dibanding kafein. Cokelat lebih banyak
1
2
mengandung teobromin dibandingkan kafein. Walau tidak terdapat dasar yang
kuat, kebanyakan ilmuwan percaya bahwa efek stimulan kombinasi teobromin
dan kafein dalam cokelat adalah dua kali lebih besar dibanding kafein (Weinberg
el al., 2010).
Kafein yang selama ini dikenal oleh masyarakat luas menimbulkan efek
negatif, namun pada kenyataanya kafein bersama dengan teobromin mempunyai
daya kerja positif sebagai stimulan sistem syaraf pusat, stimulan otot jantung,
meningkatkan aliran darah melalui arteri koroner, relaksasi otot polos bronki, dan
aktif sebagai diuretika dengan tingkatan yang berbeda. Daya kerja sebagai
stimulan sistem syaraf pusat kafein sangat menonjol sehingga umumnya
digunakan sebagai stimulan sentral (Qiqi, 2001). Efek rangsangan yang dihasilkan
oleh cokelat berasal dari efek kombinasi teobromin dan kafein (Utami, 2011).
Kandungan teobromin dan kafein dalam cokelat, khususnya serbuk cokelat
akan menimbulkan dampak positif atau negatif, tergantung dari kadar yang ada
dalam serbuk cokelat. Kandungan teobromin dan kafein dalam serbuk cokelat
yang belum diketahui oleh masyarakat inilah yang seharusnya diketahui kadarnya
secara pasti supaya masyarakat lebih bijak dalam mengkonsumsi serbuk cokelat.
Masyarakat tidak hanya menjadikan cokelat sebagai makanan kegemaran, namun
cokelat akan menjadi makanan yang memberikan dampak positif bagi tubuh bila
digunakan secara tepat.
Penelitian ini juga ingin membuktikan apakah benar dalam serbuk cokelat
yang dianalisis mengandung teobromin dan kafein sebagai unsur utama, sehingga
3
dapat dipastikan bahwa produk cokelat yang dihasilkan mengandung teobromin
dan kafein tidak sekedar menggunakan pewarna cokelat.
Penetapan kadar teobromin dan kafein dalam serbuk cokelat harus melalui
beberapa tahap, antara lain dengan mengekstraksi serbuk cokelat supaya
didapatkan kandungan teobromin dan kafein yang terpisah dari komponen lain
yang tidak dikehendaki. Sistem ekstraksi yang dipilih adalah metode soxhletasi
karena lebih praktis, hanya kemungkinan kecil zat yang diekstraksi hilang selama
proses ekstraksi (Khopkar, 1990), cairan penyari yang diperlukan lebih sedikit
daripada metode ekstraksi lainnya sehingga diperoleh hasil ekstrak yang lebih
pekat (Mitra, 2003), dan senyawa teobromin dan kafein merupakan senyawa yang
tahan terhadap panas (Anonim, 1986). Proses soxhletasi serbuk cokelat akan
menggunakan penyari klorofom karena teobromin dan kafein mempunyai
kelarutan yang tinggi dalam klorofom. Metode soxhletasi juga memerlukan
penentuan jumlah sirkulasi ekstraksi, karena jumlah sirkulasi merupakan
parameter konstan yang dapat diamati, dengan menggunakan kondisi yang sama
(suhu, jenis dan jumlah pelarut) pada masing-masing proses ekstraksi. Hal ini
dilakukan supaya senyawa teobromin dan kafein dalam sampel serbuk cokelat
dapat terambil seluruhnya.
Ekstrak serbuk cokelat yang diperoleh dengan cara soxhletasi akan
ditetapkan kadarnya dengan menggunakan metode Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi (KCKT) fase terbalik karena teobromin dan kafein memiliki kepolaran
yang berbeda, sehingga dapat dipisahkan karena adanya interaksi antara
teobromin dan kafein dengan fase diam yang bersifat non polar dan fase gerak
4
yang bersifat polar. Selain itu, KCKT juga memiliki kelebihan yaitu cepat, sensitif
dan memiliki daya pisah yang baik (Jhonson and Stevenson, 1978). Metode
KCKT yang digunakan harus tervalidasi sebelumnya untuk memberikan jaminan
terhadap hasil penetapan kadar pada sampel sehingga dapat dipercaya
kebenarannya.
Penelitian ini mengacu dari penelitian sebelumnya yang telah dilakukan
oleh Wati (2012) tentang optimasi komposisi dan flow rate fase gerak pada
penentuan kadar teobromin dan kafein dalam serbuk cokelat dengan
menggunakan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi fase terbalik. Hasil
optimasi yang didapat pada sistem KCKT yang optimum menggunakan fase gerak
campuran metanol : akuabides/TEA 3% dengan komposisi 40 : 60 (v/v), fase
diam Kromasil Oktadesilsilan C-18 (100-5C18) merek KNAUER dimensi 250 mm
x 4,6 mm, ukuran partikel 5 µm dengan kecepatan alir 0,8 mL/menit. Selain itu,
penelitian ini juga mengacu pada penelitian yang telah dilakukan oleh Yunita
(2012) tentang validasi metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi fase terbalik
pada penetapan kadar teobromin dan kafein dalam serbuk cokelat merk “X” yang
memenuhi syarat parameter validitas yang baik, meliputi selektivitas, linearitas,
akurasi, dan presisi. Hal tersebut yang mendasari penelitian Penetapan Kadar
Teobromin dan Kafein dalam Ekstrak Serbuk Cokelat Merk “X” Menggunakan
Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik.

5
1. Permasalahan
Berdasarkan latar belakang di atas, maka dapat disusun permasalahan sebagai
berikut:
1. Berapakah jumlah sirkulasi ekstraksi serbuk cokelat merk “X” dengan
menggunakan metode soxhletasi yang menghasilkan kadar teobromin dan
kafein maksimum?
2. Berapakah kadar teobromin dan kafein dalam ekstrak serbuk cokelat merk
“X” hasil penetapan menggunakan metode KCKT fase terbalik?
2. Keaslian Penelitian
Sejauh penelusuran pustaka yang penulis lakukan, telah dilakukan
penetapan kadar teobromin dan kafein dalam berbagai produk kopi
menggunakan metode KCKT fase terbalik dengan fase gerak metanol :
akuabides/bufer ammonium asetat pH 7,5 dengan perbandingan 20 : 80 (v/v),
fase diam Phenomenex Kinetex 2.6 um XB C-18, kecepatan alir 1,0 mL/menit,
detektor UV pada panjang gelombang maksimum 272 nm oleh Czech et al.
(2011). Penetapan kandungan metilksantin dan polifenol dalam produk
cokelat pernah dilakukan menggunakan metode KCKT, dengan fase gerak
metanol : akuabides : asam asetat (20 : 79 : 1, v/v), fase diam µ-Bondapak 10
µm (30 cm x 4,0 mm), kecepatan alir 1,0 mL/min oleh Ramli et al. (2001).
Penelitian mengenai Penetapan Kadar Teobromin dan Kafein dalam
Ekstrak Serbuk Cokelat Merk “X” Menggunakan Metode Kromatografi Cair
Kinerja Tinggi Fase Terbalik belum pernah dilakukan.

6
3. Manfaat Penelitian
Penelitian yang dilakukan oleh penulis, diharapkan dapat bermanfaat
sebagai berikut:
a. Manfaat Teoritis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan
terhadap ilmu pengetahuan tentang penetapan jumlah sirkulasi ekstraksi
dengan metode soxhletasi dan tentang metode KCKT sehingga dapat
digunakan untuk menetapkan kadar teobromin dan kafein.
b. Manfaat Metodologis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan
informasi prosedur penetapan jumlah sirkulasi ekstraksi dengan metode
soxhletasi yang menghasilkan kadar maksimum dan penggunaan metode
KCKT fase terbalik dalam penetapan kadar teobromin dan kafein dalam
ekstrak serbuk cokelat merk “X”.
c. Manfaat Praktis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi
mengenai jumlah sirkulasi ektraksi menggunakan metode soxhletasi yang
memberikan kadar teobromin dan kafein yang maksimal dalam ekstrak
serbuk cokelat merk “X”.
B. Tujuan Penelitian
Berdasarkan latar belakang dan permasalahan yang ada, maka penelitian ini
bertujuan sebagai berikut:
1. Menetapkan jumlah sirkulasi ekstraksi serbuk cokelat merk “X” dengan
metode soxhletasi yang menghasilkan kadar teobromin dan kafein maksimum.

7
2. Menetapkan kadar teobromin dan kafein dalam ekstrak serbuk cokelat merk
“X” menggunakan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase
terbalik yang telah tervalidasi.

BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Cokelat (Theobroma cacao)
Gambar 1. Cokelat (Theobroma cacao)
Cokelat dihasilkan melalui serangkaian proses dari biji kakao. Biji kakao
ini berasal dari tanaman kakao, Theobroma cacao, yang tumbuh hanya di daerah
tropis. Istilah cokelat itu sendiri berasal dari xocolatl (bahasa suku Aztec) yang
berarti minuman pahit (Alexander et al., 2008).
Secara garis besar, cokelat mengandung lemak 31%, karbohidrat 14%, dan
protein 9%. Protein cokelat kaya akan asam amino triptofan, fenilalanin, dan
tirosin. Meski cokelat mengandung lemak tinggi namun relatif tidak mudah tengik
karena cokelat mengandung 6% polifenol, yang berfungsi sebagai antioksidan
pencegah tengik. Cokelat mengandung berbagai macam gula, pati, protein
sayuran, kalium, magnesium, kalsium, natrium, zat besi, krom, berbagai macam
vitamin (A, B1 tiamin, B2 riboflavin, D dan E), kafein dan feniletilamin (Mutiara,
2011).
8
9
B. Penyarian
Penyarian atau ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang
terlarut supaya terpisah dari bahan yang tidak larut dengan pelarut cair. Pada
proses penyarian terjadi perpindahan masa zat aktif yang semula berada di dalam
sel akan ditarik oleh cairan penyari. Proses penyarian dapat dibagi pada tahapan
pembuatan serbuk, penyarian, dan pemekatan. Hasil penyarian akan semakin baik
apabila serbuk semakin halus, karena permukaan serbuk simplisia yang
bersentuhan dengan penyari akan semakin luas. Akan tetapi pertimbangan ini
tidak selalu dapat dilaksanakan karena dengan semakin halus serbuk simplisia
juga akan mengganggu proses penyarian. Hal ini dikarenakan serbuk yang terlalu
halus tersebut dapat membentuk suspensi sehingga sulit dipisahkan dari hasil
penyarian. Faktor yang mempengaruhi kecepatan penyarian adalah kecepatan
difusi cairan penyari (Anonim, 1986).
Ekstraksi dilakukan untuk menyari zat-zat berkhasiat atau zat-zat aktif dari
bagian tanaman obat, hewan dan beberapa jenis ikan termasuk biota laut. Zat-zat
aktif terdapat di dalam sel, namun sel tanaman dan hewan berbeda demikian pula
ketebalannya, sehingga diperlukan metode ekstraksi dengan pelarut tertentu dalam
mengekstraksinya (Harbone, 1987).
Tujuan ekstraksi bahan alam adalah untuk menarik komponen kimia yang
terdapat pada bahan alam. Ekstraksi ini didasarkan pada prinsip perpindahan
massa komponen zat ke dalam pelarut, dimana perpindahan mulai terjadi pada
lapisan antar muka kemudian berdifusi masuk ke dalam pelarut (Anonim, 1986).
10
1. Ekstrak
Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi
senyawa aktif dari simplisia nabati atau hewani menggunakan pelarut yang
sesuai, kemudian semua atau hampir pelarut diuapkan menjadi ekstrak kental
atau ekstrak kering (Anonim, 1986).
Pembuatan ekstrak yang baik perlu memperhatikan beberapa tahap karena
akan mempengaruhi mutu ekstrak seperti keseragaman kandungan kimia, sifat
fisiknya, khasiat, dan keamanannya (Sidik dan Mudahar, 2000).
2. Cairan Penyari
Cairan penyari yang digunakan dalam proses pembuatan ekstrak adalah
pelarut yang optimal untuk senyawa kandungan yang berkhasiat atau aktif,
dengan demikian senyawa tersebut dapat terpisahkan dari bahan dan dari
senyawa kandungan lainnya. Diharapkan, ekstrak yang diperoleh hanya
mengandung sebagian besar senyawa yang diinginkan. Ekstrak kental
diperoleh jika cairan pelarut yang digunakan dapat melarutkan hampir semua
metabolit sekunder yang terkandung (Anonim, 2000).
Pemilihan cairan penyari harus mempertimbangkan banyak faktor. Cairan
penyari yang baik harus memenuhi kriteria berikut ini:
a. murah dan mudah diperoleh
b. stabil secara fisika dan kimia
c. bereaksi netral
d. mudah menguap dan tidak mudah terbakar
e. selektif yaitu hanya menarik zat berkhasiat yang dikehendaki

11
f. tidak mudah mempengaruhi zat berkhasiat
g. diperbolehkan oleh peraturan dengan pertimbangan keamanan/toksisitas
(Anonim, 1986).
Pelarut yang digunakan dalam ekstraksi harus dipilih berdasarkan
kemampuannya dalam melarutkan kandungan zat aktif yang maksimal dan
seminimal mungkin bagi unsur yang tidak diinginkan (Ansel, 1985).
3. Metode Ekstraksi secara Soxhletasi
Alat Soxhlet adalah suatu alat terbuat dari gelas yang bekerja secara
kontinyu dalam menyari. Pada proses ini sampel yang disari dimasukkan pada
alat Soxhlet, lalu dielusi dengan pelarut yang cocok sedemikian rupa sehingga
akan terjadi dua kali sirkulasi dalam waktu 30 menit (Harbone, 1987).
Gambar 2. Diagram soxhlet extractor (Mitra, 2003)
Soxhlet (gambar 2) merupakan alat yang digunakan untuk penyarian
berkesinambungan. Prinsipnya adalah pelarut di labu penampung diuapkan,
uap naik ke atas melalui pipa samping dan diembunkan kembali oleh
pendingin tegak, selanjutnya menetes turun ke tabung berisi serbuk simplisia
yang dibungkus kertas saring. Cairan penyari yang menetes akan melarutkan
zat aktif dan bila volumenya telah mencapai permukaan sifon, seluruh cairan
akan turun kembali lagi ke labu penampung dan diuapkan kembali. Proses
12
sirkulasi ini berlangsung terus-menerus sehingga zat aktif yang hendak
diekstraksi harus tahan terhadap pemanasan (Anonim, 1986). Ekstraksi
sempurna ditandai bila cairan sifon tidak berwarna atau sirkulasi ekstraksi
telah mencapai 20-25 kali (Utami, 2011).
Bahan yang akan diekstraksi diletakkan dalam sebuah kantong ekstrak
dalam sebuah alat ekstraksi dari gelas yang bekerja kontinyu. Wadah gelas
yang berisi sampel diletakkan diantara labu penampung dan suatu pendingin
aliran balik. Labu tersebut berisi bahan pelarut yang mudah menguap
mencapai ke pendingin aliran balik melalui pipa samping, berkondensasi di
dalamnya, menetes ke atas bahan yang akan diekstraksi dan membawa keluar
bahan yang diekstraksi. Larutan yang terkumpul di dalam wadah gelas dan
setelah mencapai tinggi maksimal secara otomatis dipindahkan ke dalam labu,
dengan demikian zat yang akan terektraksi terakumulasi melalui penguapan
bahan pelarut murni berikutnya. Pada cara ini cairan pengekstrak terus
diperbaharui, artinya bahan pelarut bebas bahan aktif akan menyari pada
sirkulasi berikutnya (Voigt, 1971).
Cara soxhletasi lebih praktis dan hanya kemungkinan kecil zat yang
diekstraksi hilang selama proses ekstraksi berlangsung. Efisiensi yang tinggi
pada soxhletasi dipengaruhi oleh viskositas cairan penyari dan faktor-faktor
yang mempengaruhi kecepatan tercapainya kesetimbangan (Khopkar, 1990).

13
Kelebihan metode soxhletasi:
a. Uap panas tidak melalui serbuk simplisia tetapi melalui pipa samping.
b. Cairan penyari yang diperlukan lebih sedikit dibanding metode ekstraksi
lainnya dan menghasilkan ekstrak yang lebih pekat.
c. Serbuk simplisia disari dengan cairan penyari yang murni sehingga dapat
menyari zat aktif lebih banyak.
d. Penyarian dapat diteruskan sesuai keperluan tanpa menambah volume
cairan penyari. Hal ini sangat menguntungkan karena selain ekonomis,
akan diperoleh ekstrak yang lebih kental.
Kekurangan metode soxhletasi:
a. Larutan dipanaskan terus-menerus sehingga kurang cocok untuk zat aktif
yang tidak tahan pemanasan. Hal ini dapat diperbaiki dengan menambah
peralatan yang dapat mengurangi tekanan udara.
b. Cairan penyari dididihkan terus-menerus sehingga penyari yang baik harus
murni atau campuran azeotrop (Anonim, 1986).
C. Teobromin
Teobromin atau 3,7-dimetilksantin merupakan turunan ksantin yang
termasuk dalam golongan alkaloid, terdapat dalam biji Theobroma cacao. Berupa
serbuk kristal putih dengan rumus molekul C7H8N4O2 dan bobot molekul 180,2
g/mol yang memiliki titik lebur 290°C; bersifat basa dengan pKa 10,0 (25oC)
(Clarke, 1986). Teobromin mengandung tidak kurang dari 99,0% dan tidak lebih
14
dari 101,0% dari 3,7-dimetilksantin (Anonim, 2011). Serbuk cokelat kakao
mengandung teobromin antara 18-38 g/kg (Alexander et al., 2008).
Teobromin (gambar 3) memiliki kelarutan: 1 dalam 2000 air, 1 dalam 150
air panas, 1 dalam 2500 etanol, dan 1 dalam 6000 kloroform. Teobromin tidak
larut dalam pelarut eter. Teobromin dalam larutan dengan pH 9,4; serapan
%
maksimumnya 273 mµ ( = 550).
O CH 3
H N
N
N
O N
CH 3
Gambar 3. Struktur Teobromin
Metode analisis yang paling sering digunakan untuk menganalisis
kandungan teobromin dalam makanan adalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
(KCKT). Banyak metode lain yang dapat digunakan untuk menganalisis
teobromin, antara lain kromatografi gas-spektrofotometer massa atau
Spektrofotometer UV/Vis. Penyarian kandungan teobromin dalam makanan dapat
dilakukan menggunakan metode maserasi dengan pemanasan (Cezch et al., 2011).
D. Kafein
Kafein memiliki sinonim 1,3,7-trimetilksantin dengan rumus molekul
C8H10N4O2 dan bobot molekul 194,2 g/mol (Clarke, 1986); bersifat basa dengan
pKa 10,4 (Nadendla, 2005). Rumus bangun kafein dapat dilihat pada gambar 4.
O CH 3
H3C N
N
N
O N
CH3
Gambar 4. Struktur Kafein

15
Kafein berbentuk anhidrat atau hidrat yang mengandung satu molekul air.
Mengandung tidak kurang dari 98,5% dan tidak lebih dari 101,0% C8H10N4O2,
dihitung terhadap zat anhidrat. Pemerian berupa sebuk putih atau berbentuk jarum
mengkilat putih; biasanya menggumpal; tidak berbau; rasa pahit (Anonim, 1995).
Serbuk cokelat kakao mengandung kafein sebanyak 9,9 g/kg (Alexander et al.,
2008).
Sebanyak 1 gram kafein larut dalam: 46 mL air; 5,5 mL air (80oC); 1,5 mL
air mendidih; 66 mL alkohol; 22 mL alkohol (60oC); 50 mL aseton; 5,5 mL
kloroform; 530 mL eter; 100 mL benzene; 22 mL benzen mendidih; dan larut
dalam etil asetat (Anonim, 1989).
Kafein secara alami di dalam tanaman terdapat dalam bentuk garam.
Kafein bebas dalam bentuk basa tidak dapat larut dalam air, tetapi kafein dalam
bentuk garam yang dihasilkan dari reaksi dengan asam dapat larut dalam air.
Kafein bebas dalam bentuk basa larut dalam eter, kloroform atau pelarut organik
lain, tetapi garam kafein tidak larut (Robbers, 1996). Menurut Polp (1990), kafein
dapat larut dalam etanol dan klorofom.
Kafein merupakan alkaloid yang terdapat dalam teh, kopi, cokelat, kola,
dan beberapa minuman penyegar lainnya. Kafein dapat berfungsi sebagai stimulan
dan beberapa aktivitas biologis lainnya (Winarno, 1997). Derivat ksantin terdiri
dari kafein, teofilin, dan teobromin adalah alkaloid yang terdapat dalam
tumbuhan. Cocoa yang didapat dari biji Theobroma cacao mengandung kafein
dan teobromin yang terbukti berefek stimulasi (Sunaryo, 1995).

16
Kafein berkhasiat sebagai stimulan susunan saraf pusat dengan efek
menghilangkan rasa letih, lapar, rasa kantuk, meningkatkan daya konsentrasi,
kecepatan reaksi, dan memperbaiki suasana jiwa (Tjay dan Raharja, 2002). Kafein
mempunyai efek paling besar dalam menstimulasi pusat respirasi dan
meningkatkan kemampuan kerja otot dibandingkan dengan turunan ksantin
lainnya. Dosis letal kafein pada orang dewasa antara 5-10 g, namun reaksi yang
tidak diinginkan terlihat pada penggunaan 1 g (15 mg/kg/BB) (Wilmana, 1995).
Pada orang yang lelah, kafein dapat menghilangkan gejala kelelahan dan
meningkatkan kemampuan psikis (Mutschler and Ernst, 1986).
Kafein memiliki titik lebur yang tinggi antara 235-237°C dan titik
sublimasinya 178°C. Kafein mempunyai spektrum absorbansi pada UV. Kafein
dalam etanol mempunyai serapan maksimum pada panjang gelombang 273 nm

%
dengan = 519. Kafein dalam HCl 0,1 N mempunyai serapan maksimum
%
pada panjang gelombang 272 nm dengan = 470 (Clarke, 1986).
E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
1. Definisi dan Instrumentasi
Kromatografi adalah prosedur pemisahan senyawa campuran berdasarkan
perbedaan kecepatan migrasi, karena adanya perbedaan koefisiensi distribusi
masing-masing senyawa diantara dua fase yang saling bersinggungan dan
tidak saling campur, yang disebut sebagai fase gerak (mobile phase) yang
berupa zat cair atau zat gas, dan fase diam (stationary phase) yang berupa zat
cair atau zat padat (Noegrohati, 1994). Kromatografi bertujuan untuk

17
memisahkan komponen dari matriks sampel dan tetap dibiarkan dalam fase
diam kemudian ditentukan untuk analisis (Mulja dan Suharman, 1995).
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan salah satu metode
kromatografi cair yang fase geraknya dialirkan secara tepat dengan bantuan
tekanan dan hasil yang diperoleh dideteksi dengan instrumen (Williard et al.,
1988). Secara skematis, KCKT terlihat pada gambar 5. KCKT memiliki
sistem pompa tekanan tinggi dan detektor yang sensitif telah menyebabkan
perubahan kromatografi kolom cair menjadi suatu sistem pemisahan dengan
kecepatan dan efisiensi yang tinggi (Anonim, 1995).
Gambar 5. Peralatan KCKT

2. Pembagian Jenis Kromatografi
Secara umum kromatografi dapat dibagi menjadi lima jenis, yaitu:
a. Kromatografi cair-cair atau kromatografi partisi
Pada kromatografi partisi, fase diam bersifat polar atau non polar.
Bila fase diam bersifat polar dan fase gerak non polar disebut kromatografi
partisi fase normal, sedangkan bila fase diam bersifat non polar dan fase
gerak polar dinamakan kromatografi partisi fase terbalik (Munson, 1984).
b. Kromatografi adsorpsi
Kromatografi ini menggunakan fase diam padat dan fase gerak cair
atau gas. Solut diadsorpsi pada permukaan partikel padat (Harris, 1999).
18
c. Kromatografi pertukaran ion
Anion atau kation diikatkan secara kovalen pada fase diam padat,
biasanya resin. Ion-ion solut dengan muatan berlawanan menyerang fase
diam dengan kekuatan elektrostatik. Fase geraknya cair (Harris, 1999).
d. Kromatografi eksklusi
Pada kromatografi ini tidak ada interaksi tarik menarik antara fase
diam dan solut. Fase gerak cair atau gas melalui gel berpori. Ukuran pori
cukup kecil untuk mengeluarkan molekul solut yang besar. Molekul solut
yang kecil akan masuk ke dalam pori gel, sedangkan molekul yang besar
akan mengalir tanpa memasuki pori gel (Harris, 1999).
e. Kromatografi afinitas
Digunakan untuk interaksi spesifik antara satu jenis molekul solut
dan sebuah molekul lain yang secara kovalen terikat pada fase diam.
Misalnya pemisahan komponen protein (Harris, 1999).
3. Kromatografi Partisi
Prinsip kromatografi partisi analit diantara 2 fase yang tidak saling
campur, karena adanya perbedaan koefisien distribusi dari masing-masing
senyawa (Johnson and Stevenson, 1978). Mekanisme pemisahan pada
kromatografi partisi dapat digambarkan sebagai berikut (gambar 6):
Gambar 6. Mekanisme pemisahan kromatografi partisi (Munson, 1984)

19
Kecepatan migrasi analit fase diam ditentukan oleh perbandingan
distribusinya (K) yang tergantung pada afinitas analit pada fase gerak. Di
dalam kromatografi, K didefinisikan sebagai perbandingan konsentrasi analit
dalam fase diam (Cs) dan konsentrasi analit dalam fase gerak (Cm) (Rohman
dan Gandjar, 2007).
Cs
K=
Cm
Hal-hal yang harus diperhatikan dalam pemilihan metode kromatografi
partisi fase terbalik yaitu kolom, fase gerak, dan detektor.
a. Kolom
Fase diam pada KCKT berupa kolom kromatografi yang
merupakan bagian penting karena pemisahan komponen-komponen
sampel terjadi di dalam kolom. Keberhasilan pemisahan komponen-
komponen sampel sangat bergantung pada keadaan kolom sehingga
pemilihan kolom yang tepat sangatlah penting (Mulja dan Suharman,
1995).
Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang
dimodifikasi secara kimia, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-
polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan
sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Oktadesilsilan
(ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan
karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran rendah,
sedang, serta tinggi (Rohman, 2009).

20
Kolom yang digunakan dalam kromatografi partisi fase terbalik
adalah kolom dengan kemasan fase terikat yang memiliki sifat stabil
karena fase diamnya terikat secara kimia pada penyangga, sehingga tidak
mudah terbawa oleh fase gerak. Penyangga pada kemasan fase terikat
biasanya terbuat dari silika yang sudah diseragamkan, berpori, dan
umumnya partikel mempunyai diameter 3,5 atau 10 µm (Skoog et al.,
1998).
Pada KCKT partisi fase terbalik biasanya mengandung bahan
organik yang terikat secara kimia dengan gugus silanol pada silika. Bagian
organik tersebut umumnya hidrokarbon rantai panjang, sehingga fase
gerak umumnya polar. Gugus silanol permukaan dapat direaksikan dengan
berbagai cara menempelkan berbagai jenis gugus organik. Kemasan fase
terikat dengan tipe ikatan siloksan (Si-O-Si-O) dibuat dengan mereaksikan
organoklorosilan dengan gugus silanol pada permukaan silika gel. Reaksi
silanasi (gambar 7) sebagai berikut:
Gambar 7. Reaksi silanasi

Reaksi tersebut digunakan untuk membuat isian kolom oktadesilsilan
(ODS) gugus silanol dan oktadesiklorosilan (gambar 8) sebagai berikut:
Gambar 8. Reaksi pembuatan kolom oktadesilsilan

21
Gugus yang ditempelkan pada silanol pada umumnya adalah hidrokarbon
rantai panjang. Tertambatnya senyawa pada fase diam dipengaruhi
panjang pendeknya rantai karbon (Skoog et al., 1998).
b. Fase gerak
Kemampuan KCKT untuk memisahkan banyak senyawa terutama
tergantung pada keanekaragaman fase gerak yang sangat berpengaruh
terhadap tambatan dan pemisahan senyawa (Munson, 1984).
Fase gerak untuk analisis secara KCKT harus murni untuk
mencegah adanya peak pengganggu yang dapat tumpang tindih dengan
peak analit, tidak bereaksi atau mempengaruhi kolom, dapat melarutkan
analit, memiliki titik didih 20-50°C di atas temperatur kolom,
viskositasnya rendah (Skoog et al., 1998).
Fase gerak KCKT juga harus bebas dari gas terlarut karena dapat
mempengaruhi respon detektor sehingga memunculkan sinyal palsu dan
akan mempengaruhi kolom (Gritter dkk., 1985), maka fase gerak perlu
didegassing untuk menghilangkan gas terlarut (Dean, 1995).
Pada fase terbalik kandungan utama fase geraknya adalah air.
Pelarut yang dapat campur dengan air seperti metanol, etanol, asetonitril,
dan tetrahidrofuran ditambahkan untuk mengatur kepolaran fase gerak.
Kepolaran dinyatakan dalam indeks polaritas (P') yang dapat dihitung
dengan persamaan berikut:
P' = Φa P'a + Φb P'b

Φa dan Φb adalah fraksi pelarut a dan b dalam campuran,
sedangkan P'a dan P'b adalah angka P' pelarut murni (Gritter et al., 1985).
22
Indeks polaritas (P') beberapa pelarut yang sering digunakan dalam KCKT
disajikan dalam tabel I:
Tabel I. Indeks polaritas beberapa pelarut (Snyder et al., 1997)

Indeks Nilai Eluotropik UV Cut
Solvent
Polaritas Alumina C18 Silika off (nm)
Heksan 0,1 0,01 - 0,00 195
Sikloheksan 0,2 0,04 - - 200
Toluen 2,4 0,29 - 0,22 284
Tetrahidrofuran 4,0 0,45 3,7 0,53 212
Etil asetat 4,4 0,58 - 0,48 256
Aseton 5,1 0,56 8,8 0,53 330
Metanol 5,1 0,95 1,0 0,7 205
Asetonitril 5,8 0,65 3,1 0,52 190
Dimetilformida 6,4 - 7,6 - 268
Dimetilsulfoksida 7,2 0,62 - - 268
Air 10,2 - - - 190
c. Detektor
Menurut Johnson and Stevenson (1978), detektor diperlukan untuk
mendeteksi adanya komponen cuplikan yang terdapat dalam kolom serta
untuk mengukur jumlah komponen yang ada dalam cuplikan. Detektor
yang baik adalah detektor yang memenuhi persyaratan sensitivitas yang
tinggi dengan rentang sensitivitas 10-8-10-15 gram solut per detik,
kestabilan dan reprodusibilitas yang sangat baik, respon yang liniear
terhadap konsentrasi solut, dapat bekerja dari temperatur kamar sampai
400ºC, tidak dipengaruhi perubahan temperatur dan kecepatan pelarut
pengembang, selektif terhadap bermacam-macam linarut dalam pelarut
pengembang dan tidak merusak sampel (Mulja dan Suharman, 1995).
Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu:
a. Detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak
bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias
dan detektor spektrometri massa.

23
b. Detektor spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik
dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan
elektrokimia (Rohman, 2009).
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:
a. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel
b. Mempunyai sensitivitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut
pada kadar yang sangat kecil
c. Stabil dalam pengoperasiannya
d. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan
pelebaran pita
e. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada
kisaran yang luas (kisaran dinamis dan linier)
f. Tidak peka terhadap perubahan temperatur dan kecepatan aliran fase
gerak (Rohman, 2009).
4. Pemisahan Puncak dalam Kromatografi
Keberhasilan atau kegagalan analisis tergantung pada pemilihan kolom
dan kondisi kerja yang tepat. Ukuran kinerja kolom dapat dilihat dari
kemampuan kolom dalam memisahkan senyawa. Kolom yang efisien
mencegah pelebaran puncak atau menghasilkan puncak yang sangat sempit
(Johnson and Stevenson, 1978).
Resolusi (R) adalah ukuran pemisahan dua puncak berdekatan yang dapat
diukur dengan persamaan:
Δ
R= ( )
=( )
24
Nilai tR1 dan tR2 merupakan waktu retensi senyawa yang diukur pada titik
maksimum puncak, nilai w1 dan w2 merupakan lebar alas puncak (Johnson
and Stevenson, 1978). Pemisahan dua senyawa dapat digambarkan sebagai
berikut (gambar 9):
Gambar 9. Pemisahan dua senyawa (Johnson dan Stevenson, 1978)

Nilai R > 1,5 disebut baseline resolution, yaitu pemisahan sempurna dari
dua puncak dengan ukuran yang sama. Dalam prakteknya, pemisahan dengan
nilai R = 1,0 (kedua puncak berhimpit lebih kurang 2%) dianggap memadai
(Pescok et al., 1976). Untuk pemisahan yang baik R harus ≥ 1,5 karena
pemisahan kedua senyawa ≥ 99,7% (Sastrohamidjojo, 2002).
Waktu retensi (tR) atau waktu tambat (retention time) adalah selang waktu
yang diperlukan oleh analit mulai saat injeksi sampai keluar dari kolom dan
sinyalnya ditangkap detektor. Selain waktu tambat analit, dikenal pula waktu
tambat untuk pelarut pengembang atau pengembang campur yang dinyatakan
sebagai tM (Mulja dan Suharman, 1995).
Waktu tambat analit dikurangi waktu tambat pelarut pengembang atau
pelarut pengembang campur disebut waktu tambat yang terkoreksi yang
dinyatakan sebagai tR' (Mulja dan Suharman, 1995). Jika nilai K
(perbandingan distribusi) kecil maka analit akan lebih banyak di dalam fase
25
gerak atau (Cm > Cs) yang berarti analit akan lebih lama tinggal di dalam fase
gerak dan memiliki waktu retensi lebih cepat (Mulja dan Suharman, 1995).
5. Analisis Kualitatif dan Kuantitatif
KCKT digunakan untuk analisis kuantitatif suatu sampel atau cuplikan.
Hasil pemisahan adalah kromatogram. Informasi yang diperoleh dari
kromatogram yaitu mengenai waktu retensi suatu senyawa (Noegrohati,
1994).
Waktu retensi menunjukkan identitas suatu senyawa dan merupakan
selang waktu yang diperlukan oleh senyawa mulai pada saat injeksi sampai
keluar dari kolom dan sinyalnya ditangkap oleh detektor (Gritter et al., 1985).
Masing-masing senyawa memiliki waktu retensi yang spesifik pada kondisi
tertentu seperti kolom, suhu, dan laju sehingga dapat digunakan sebagai salah
satu dasar uji kualitatif (Noegrohati, 1994). Analisis kualitatif dilakukan
dengan cara membandingkan waktu retensi senyawa murni dengan waktu
retensi senyawa yang dimaksud dalam sampel (Gritter et al., 1985).
Analisis kuantitatif dilakukan berdasarkan perbandingan tinggi atau luas
puncak kromatogram senyawa sampel terhadap senyawa standar. Bila variasi
keadaan kolom tidak menyebabkan pelebaran puncak, maka analisis
berdasarkan tinggi puncak dapat memberikan ketelitian tinggi. Analisis luas
puncak tidak dipengaruhi oleh pelebaran puncak. Oleh karena itu, cara ini
lebih disukai dalam perhitungan kuantitatif (Noegrohati, 1994).

26
F. Keterangan Empiris
Cokelat mengandung dua komponen yang dapat menjadi suplemen, yaitu:
teobromin dan kafein. Efek farmakologis teobromin serupa dengan kafein, tetapi
dalam jumlah yang sama efek teobromin lebih kecil dibanding kafein. Cokelat
lebih banyak mengandung teobromin dibanding kafein.
Komposisi penyusun serbuk cokelat secara umum adalah lemak,
karbohidrat, protein, alkaloid (teobromin dan kafein), gula, dan polifenol. Pada
produk makanan, produsen tidak mencantumkan pada label kemasan berapa kadar
teobromin dan kafein yang digunakan. Pengambilan senyawa teobromin dan
kafein dalam serbuk cokelat memerlukan suatu metode soxhletasi yang
maksimum supaya teobromin dan kafein dalam serbuk cokelat dapat terambil
semaksimal mungkin.
Teobromin dan kafein memiliki panjang gelombang pada daerah
spektrofotometri UV. Teobromin dan kafein memiliki kromofor, ausokrom, dan
perbedaan interaksi terhadap fase diam dan fase gerak yang digunakan sehingga
metode yang dapat digunakan untuk pemisahan campuran dan menganalisis
secara kuantitatif yaitu metode KCKT fase terbalik menggunakan detektor UV.
Kelebihan metode ini yaitu memiliki sensitivitas dan selektivitas yang tinggi
dalam memisahkan campuran senyawa yang memiliki kepolaran yang hampir
sama.
Teobromin dan kafein dapat dipisahkan dan ditetapkan kadarnya dengan
metode KCKT fase terbalik karena fase diam yang digunakan bersifat non polar
27
dan fase gerak yang bersifat polar. Perbedaan interaksi antara teobromin dan
kafein dengan fase diam dan fase gerak pada sistem KCKT menyebabkan
teobromin dan kafein akan terpisah dan dapat dihitung kadarnya dengan metode
KCKT fase terbalik.
Penelitian ini bersifat eksperimental deskriptif yang bertujuan untuk
mendapatkan informasi tentang jumlah sirkulasi ekstraksi serbuk cokelat merk
“X” dengan menggunakan metode soxhletasi yang menghasilkan kadar teobromin
dan kafein maksimum, serta untuk mengetahui besarnya kadar teobromin dan
kafein dalam serbuk cokelat.

BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian yang dilakukan mengikuti jenis penelitian eksperimental
karena pada penelitian ini ada perbedaan perlakuan terhadap subyek uji dalam hal
perbedaan jumlah sikulasi ekstraksi.
B. Variabel Penelitian
1. Variabel bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah sediaan dan ekstrak serbuk cokelat
merk “X” yang mengandung teobromin dan kafein.
2. Variabel tergantung
Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah kadar teobromin dan kafein
dalam ekstrak serbuk cokelat merk “X”.
3. Variabel pengacau terkendali
Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah:
a. Kemurnian pelarut yang digunakan, untuk mengatasinya digunakan
pelarut yang memiliki kemurnian tinggi yaitu pelarut pro analysis.
b. Keragaman sampel serbuk cokelat merk “X”, sehingga digunakan serbuk
cokelat merk “X” dengan nomor kode produksi yang sama.
28
29
C. Definisi Operasional
1. Serbuk cokelat merk “X” merupakan sedian cokelat dalam bentuk serbuk yang
memiliki nomor kode produksi yang sama.
2. Kadar teobromin dan kafein maksimum adalah kondisi dimana seluruh
kandungan teobromin dan kafein dalam serbuk cokelat merk “X” sudah
terektraksi seluruhnya.
3. Sistem Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik yang
digunakan adalah seperangkat alat KCKT dengan fase diam Kromasil
ukuran partikel 5 µm, fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% dengan
perbandingan komposisi 40 : 60 (v/v), kecepatan alir 0,8 mL/menit, dan
panjang gelombang pada detektor UV yaitu 275 nm.
4. Kadar campuran teobromin dan kafein dalam serbuk cokelat merk “X”
ditetapkan dalam jumlah % (b/b).
D. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan adalah baku teobromin kualitas Non-compendial
primary reference standard dengan Certificate of Analysis dari Sigma-Aldrich,
baku kafein kualitas working standard dengan Certificate of Analysis dari
Brataco, metanol (p.a., E. Merck), Akuabides (Laboratorium Kimia Analisis
Instrumental Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta),
trietilamin (p.a., E. Merck), organic dan anorganic solvent membrane filter
(Whatman) ukuran pori 0,45 µm; diameter 47 mm, petroleum eter (titik didih 40-
30
60oC) (p.a., E. Merck), kloroform teknis, Natrium hidroksida, dan serbuk cokelat
merk “X”.
E. Alat Penelitian
Alat yang digunakan adalah penyaring Milipore, indikator pH,
mikropipet Socorex, neraca analitik (Ohaus PAJ1003), ultrasonikator (Retsch tipe
T460 no V935922013 Ey), vacuum (Gaast model DOA-P104-BN),
spektrofotometer UV/Vis (Optima SP 3000), sistem KCKT (isokratik, model LC-
2010C HT, CAT No.228-46703-38, SERIAL No. C21254706757 LP, Shimadzu
Corporation), kolom Kromasil Oktadesilsilan C-18 (100-5C18) merek KNAUER
dimensi 250 mm x 4,6 mm, ukuran partikel 5 µm, seperangkat computer (merk
Dell B6RDZ1S Connexant System RD01-D850 A03-0382 JP France S.A.S,
printer HP Deskjet D2566 HP-024-000 625 730), satu set alat Soxhlet, batu didih,
penangas air, hot-plate, dan alat-alat gelas yang umum digunakan laboratorium
analisis (Pyrex).
F. Tata Cara Penelitian
1. Pemilihan Sampel
Sampel yang dipilih adalah sediaan serbuk cokelat merk “X”. Sampel
yang digunakan sebanyak 40 kemasan dengan nomor kode produksi yang
sama, tiap kemasan berisi 45 gram bahan. Sampel diperoleh dengan membeli
di sebuah supermarket di Yogyakarta.

31
2. Pembuatan Fase Gerak
Fase gerak yang digunakan dalam penelitian ini terdiri atas campuran
metanol : akuabides/TEA 3% dengan perbandingan 40 : 60 (v/v). Masing-
masing fase gerak disaring menggunakan organic solvent membrane filter
(Whatman) untuk metanol, dan anorganic solvent membrane filter (Whatman)
untuk akuabides TEA 3% dengan bantuan pompa vakum. Fase gerak tersebut
lalu didegassing selama 15 menit menggunakan ultrasonicator.
3. Pembuatan Larutan Stok Teobromin dan Kafein
a. Larutan stok teobromin 1000 ppm. Lebih kurang 25,0 mg baku teobromin
ditimbang seksama, kemudian dilarutkan menggunakan akuabides panas
(80oC) dalam labu takar 25 mL hingga tanda batas.
b. Larutan stok kafein 1000 ppm. Lebih kurang 25,0 mg baku kafein
ditimbang seksama, kemudian dilarutkan menggunakan akuabides panas
4. Pembuatan Larutan Intermediet Teobromin dan Kafein
a. Larutan Intermediet teobromin 500 ppm. Larutan stok teobromin dipipet
seksama sebanyak 12,5 mL kemudian diencerkan dengan akuabides panas
b. Larutan Intermediet kafein 500 ppm. Larutan stok kafein dipipet seksama
sebanyak 12,5 mL kemudian diencerkan dengan akuabides dalam panas
(80oC) labu takar 25 mL hingga tanda batas.

32
5. Pembuatan Seri Larutan Baku Campuran Teobromin dan Kafein
Larutan intermediet teobromin dipipet sebanyak 0,4; 0,8; 1,2; 1,6; 2,0;
dan 2,4 mL kemudian dimasukkan dalam labu takar 10 mL. Larutan
intermediet kafein dipipet sebanyak 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; dan 1,2 mL
kemudian masing-masing dimasukkan ke dalam labu takar yang telah berisi
larutan intermediet teobromin yang telah diambil sebelumnya. Masing-
masing labu takar diencerkan dengan akuabides sampai tanda batas sehingga
didapat seri konsentrasi 20; 40; 60; 80; 100; dan 120 ppm teobromin serta 10;
20; 30; 40; 50; dan 60 ppm kafein.
6. Penetapan λ Maksimum Teobromin dan Kafein dengan
Spektrofotometer UV
Larutan baku campuran teobromin dan kafein masing-masing dengan
konsentrasi 5; 10; dan 15 ppm yang telah dibuat, discan absorbansinya pada
panjang gelombang 200-300 nm terhadap blanko akuabides, sehingga dapat
diketahui absorbansi masing-masing larutan pada berbagai panjang
gelombang. Berdasarkan spektra absorbansi dapat diketahui panjang
gelombang yang menghasilkan absorbansi maksimum pada masing-masing
konsentrasi. Spektra absorbansi teobromin dan kafein yang diperoleh
ditumpangtindihkan untuk mengetahui panjang gelombang pengamatan pada
detektor dengan sistem KCKT fase terbalik.

33
7. Pembuatan Kurva Baku Teobromin dan Kafein
Masing-masing larutan seri baku campuran teobromin dan kafein
disaring menggunakan millipore kemudian didegassing menggunakan
ultrasonikator selama 15 menit. Sejumlah 10 L masing-masing seri larutan
baku tersebut diinjeksikan ke sistem KCKT dengan fase diam Kromasil
ukuran partikel 5 µm, menggunakan fase gerak metanol : akuabides/TEA 3%
dengan perbandingan 40 : 60 (v/v) dengan kecepatan alir fase gerak 0,8
mL/menit dan dideteksi pada λ 275 nm. Replikasi dilakukan 3 kali dan dipilih
persamaan kurva baku teobromin dan kafein yang paling baik dilihat dari nilai
koefisisen korelasinya (r  0,999), intersep paling kecil, dan slope paling
besar.
8. Pembuatan Larutan NaOH 0,1 M
Natrium hidroksida (NaOH) ditimbang sebanyak 4 g dan dimasukkan
dalam labu takar 1000,0 mL larutkan dan encerkan dengan akuabides hingga
tanda batas.
9. Penetapan Jumlah Sirkulasi Ekstraksi dengan Metode Soxhletasi yang
Menghasilkan Kadar Teobromin dan Kafein Maksimum
Sampel diambil 20 kemasan dari batch yang sama dan dicampur hingga
homogen. Serbuk cokelat ditimbang seksama kurang lebih 30 g sebanyak 15
kali kemudian dimasukkan ke dalam masing-masing kantong ekstraksi.

34
Masing-masing serbuk cokelat diekstraksi dengan alat Soxhlet menggunakan
100 mL petroleum eter (40-60oC) selama 4 jam untuk penghilangan lemak
yang terdapat dalam sampel serbuk cokelat. Kantong ekstraksi kemudian
direndam menggunakan larutan NaOH 0,1 M selama 5 menit. Proses ekstraksi
dilanjutkan menggunakan pelarut klorofom teknis sampai didapatkan 25; 28;
31; 34; dan 37 kali sirkulasi. Masing-masing tahapan sirkulasi dilakukan
sebanyak 3 replikasi. Larutan hasil ekstraksi dimasukkan ke dalam cawan
porselin yang sudah ditimbang terlebih dahulu. Klorofom teknis diuapkan
sehingga didapatkan ekstrak cokelat dengan bobot tetap (Anonim, 1979).
Masing-masing ekstrak cokelat diambil 25 mg dan dilarutkan dengan metanol
p.a. Ekstrak cokelat yang didapatkan disaring menggunakan kertas saring.
Larutan dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL dan diencerkan dengan
metanol p.a hingga tanda batas. Larutan sampel disaring menggunakan
milipore dan didegassing selama 15 menit. Larutan sampel masing-masing
diinjeksikan ke sistem KCKT adalah 10 µL dengan fase diam Kromasil
ukuran partikel 5 µm, fase gerak dengan komposisi metanol : akuabides/TEA
3% dan kecepatan alir 0,8 mL/menit, dideteksi dengan UV-275 nm. Respon
kadar teobromin dan kafein dipilih yang paling maksimal.
10. Preparasi Sampel
Sampel diambil 20 kemasan dari batch yang sama dan dicampur hingga
homogen. Serbuk cokelat ditimbang seksama kurang lebih 30 g kemudiaan

35
dimasukkan ke dalam kantong ekstraksi. Serbuk cokelat diekstraksi dengan
alat Soxhlet menggunakan 100 mL petroleum eter (titik didih 40-60oC) untuk
penghilangan lemak yang terdapat dalam sampel serbuk cokelat selama 4 jam.
Kantong ekstraksi kemudian direndam menggunakan larutan NaOH 0,1 M
selama 5 menit. Proses ekstraksi dilanjutkan menggunakan pelarut klorofom
teknis sebanyak 37 kali sirkulasi, yang memberikan kadar maksimum. Larutan
hasil ektraksi dimasukkan ke dalam cawan porselin yang sudah ditimbang
terlebih dahulu. Klorofom teknis diuapkan sehingga didapatkan ekstrak
cokelat dengan bobot tetap, kemudian ekstrak cokelat diambil 25 mg dan
dilarutkan dengan metanol p.a. Ekstrak cokelat yang didapatkan disaring
menggunakan kertas saring. Larutan dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL
dan diencerkan dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan sampel
disaring menggunakan milipore dan didegassing selama 15 menit. Replikasi
dilakukan 6 kali.
11. Penetapan Kadar Teobromin dan Kafein dalam Sampel dengan
Penambahan Larutan Baku Campuran Teobromin dan Kafein
Sebanyak 10 mg ekstrak cokelat kental yang telah diperoleh kemudian
dispike dengan seri larutan baku campuran teobromin dan kafein pada 3 level
konsentrasi (lihat tabel II). Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali untuk masing-
masing level konsentrasi. Masing-masing larutan sampel yang telah dispike
kemudian disaring dengan millipore dan didegassing selama 15 menit.
Sejumlah 10 L diinjeksikan ke sistem KCKT dengan fase diam Kromasil

36
ukuran partikel 5 µm menggunakan fase gerak metanol : akuabides/TEA 3%
(40 : 60, v/v) dengan kecepatan alir fase gerak 0,8 mL/menit. Nilai AUC
sampel yang diperoleh dimasukkan ke persamaan kurva baku teobromin dan
kafein, maka akan didapatkan kadar teobromin dan kafein dalam sampel. Data
disajikan dengan satuan % b/b.
Tabel II. Pembuatan larutan campuran teobromin dan kafein

Ambil dari
Konsentrasi larutan
intermediet
Teobromin 20 ppm 0,4 mL Add dengan
Rendah akuabides hingga
Kafein 10 ppm 0,2 mL
tanda dalam labu
Teobromin 60 ppm 1,2 mL
Tengah takar 10 mL
Teobromin 120 ppm 2,4 mL
Tinggi
12. Penetapan Kadar Campuran Teobromin dan Kafein dalam Sampel
Larutan sampel diinjeksikan dalam sistem KCKT dengan fase diam
Kromasil Oktadesilsilan C-18 (100-5C18) merek KNAUER dimensi 250 mm x
4,6 mm, ukuran partikel 5 µm, fase gerak dengan komposisi metanol :
akuabides/TEA 3% 40 : 60 (v/v) dan kecepatan alir 0,8 mL/menit. Injeksikan
10 µL dan detektor diatur pada λ 275 nm. Amati kromatogram masing-masing
yang dihasilkan. Nilai AUC sampel yang diperoleh dimasukkan ke persamaan
kurva baku teobromin dan kafein, maka akan didapatkan kadar teobromin dan
kafein dalam sampel. Data disajikan dengan satuan % b/b.

37
G. Analisis Hasil
Analisis kualitatif dilakukan dengan membandingkan waktu retensi (tR)
senyawa sampel dengan senyawa baku. Analisis kuantitatif yang dilakukan adalah
penetapan kadar teobromin dan kafein berdasarkan dengan data AUC masing-
masing baku. Lalu diperoleh persamaan regresi linier Y= bX + a yang merupakan
hubungan antara kadar teobromin dan kafein dengan luas area yang dihasilkan
pada penginjeksian KCKT. Data AUC senyawa sampel dimasukkan ke dalam
persamaan regresi linier baku sebagai y, kemudian dihitung kadar teobromin dan
kafein dalam ekstrak cokelat dinyatakan dalam % (b/b).

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penetapan kadar teobromin dan kafein dalam ekstrak kental serbuk cokelat
dapat dianalisis menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT)
fase terbalik yang telah dioptimasi dan divalidasi (Wati dan Yunita, 2012).
Pada tahap optimasi diperoleh kondisi optimum yaitu kolom fase diam
Kromasil Oktadesilsilan C-18 (100-5C18) merek KNAUER dimensi 250 mm x 4,6
mm, ukuran partikel 5 µm dan fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% dengan
perbandingan 40 : 60 (v/v), kecepatan alir 0,8 mL/menit, detektor UV pada
panjang gelombang maksimum 275 nm dengan nilai resolusi 2,942; tailing factor
1,67; jumlah lempeng teoritis 690,6 (teobromin); 1752,3 (kafein); dan nilai HETP
0,04 (teobromin); 0,01 (kafein) (Wati, 2012).
Pada tahap validasi metode diperoleh bahwa metode KCKT fase terbalik
memenuhi parameter validasi meliputi selektivitas dengan nilai resolusi (Rs) 2,06,
linearitas dengan nilai koefisien korelasi (r) = 0,9998 untuk baku teobromin dan r
= 0,9999 untuk baku kafein. Metode KCKT fase terbalik ini memenuhi kriteria
validasi metode pada rentang konsentrasi 20-120 ppm teobromin dan 10-60 ppm
kafein (Yunita, 2012).
A. Pemilihan Sampel
Teobromin dan kafein merupakan kombinasi zat aktif yang terdapat dalam
sediaan serbuk cokelat. Sampel yang diperoleh terdiri dari 20 kemasan dengan
38
39
nomor batch yang sama. Pengambilan sampel dari nomor batch yang sama untuk
mendapatkan kriteria homogenitas karena diasumsikan bahwa sampel dengan
nomor batch sama mengalami satu proses produksi yang sama. Selain itu, serbuk
cokelat yang dianalisis memiliki ukuran partikel yang kecil sehingga memiliki
homogenitas yang tinggi. Kriteria lainnya yang harus dipenuhi yaitu representatif,
yakni sampel yang dianalisis benar-benar mencerminkan populasi yang
diwakilinya, dengan 20 kemasan dan dilakukan replikasi 6 kali diharapkan telah
memenuhi persyaratan tersebut. Kriteria representatif pengambilan sampel
dikendalikan dengan pengadukan sampel hingga homogen dan pengambilan
sampel dari berbagai sisi wadah sampel.
Tabel III. Keseragaman bobot kemasan serbuk cokelat
Bobot sampel serbuk cokelat terukur (g)

48,227 47,286 45,395 46,301
48,094 45,345 48,418 48,165
45,386 48,137 47,335 45,262
46,321 46,219 49,341 47,384
49,458 46,325 45,480 46,278
Bobot rata-rata sampel = 47,008 g
Penyimpangan 10% 47,008 ± 4,700785
Penyimpangan 15% 47,008 ± 7,051178
Keseragaman bobot dilakukan pada 20 kemasan serbuk cokelat sebagai tahap
awal identifikasi untuk mengetahui keseragaman kandungan dari sampel serbuk
cokelat. Berdasarkan Farmakope Indonesia edisi III untuk sedian obat berupa
serbuk, hasil penimbangan 20 bungkus kemasan, penyimpangan antara
penimbangan satu per satu terhadap bobot isi rata-rata tidak boleh lebih dari 15%
tiap 2 bungkus dan tidak lebih dari 10% tiap 18 bungkus. Keseragaman bobot
serbuk cokelat yang dilakukan mengacu pada FI III karena tidak ada peraturan
40
secara khusus terhadap keseragaman bobot serbuk makanan. Data uji
keseragaman bobot yang diperoleh tidak ada satu kemasan pun yang menyimpang
dari persyaratan keseragaman bobot. Hal ini menunjukkan, dari 20 kemasan
serbuk cokelat memiliki keseragaman bobot yang baik.
B. Pembuatan Fase Gerak
Metode KCKT yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode KCKT
dengan fase terbalik, sehingga fase diam yang digunakan lebih non polar
dibandingkan dengan fase geraknya. Metode KCKT fase terbalik dipilih karena
senyawa yang dianalisis (teobromin dan kafein), memiliki bobot molekul kurang
dari 2000 g/mol yaitu bobot molekul teobromin = 180,2 g/mol dan kafein =
194,19 g/mol (Clarke, 1986). Kedua senyawa tersebut juga cenderung lebih larut
dalam pelarut organik karena sifatnya yang cenderung kurang polar dan juga
memiliki sifat basa.
Fase diam yang digunakan adalah Kromasil Oktadesilsilan C-18 (100-
5C18) merek KNAUER dimensi 250 mm x 4,6 mm, ukuran partikel 5 µm yang
bersifat non polar dan fase geraknya adalah campuran metanol : akuabides/TEA
3% dengan perbandingan 40 : 60 (v/v) yang bersifat lebih polar dibandingkan fase
diamnya. Sistem yang digunakan adalah sistem isokratik dimana pencampuran
kedua kompisisi fase gerak dilakukan di dalam alat KCKT.
Metanol digunakan sebagai campuran fase gerak karena senyawa
teobromin dan kafein mempunyai kelarutan yang baik dalam pelarut alkohol,
maka digunakan metanol. Selain itu, metanol merupakan pelarut organik yang
41
umum dan sering digunakan pada sistem KCKT fase terbalik karena viskositasnya
lebih rendah dibanding alkohol yang lain.
Sistem KCKT pada penelitian ini menggunakan metanol sebagai pelarut
dan fase gerak dikarenakan viskositas metanol lebih kecil dibanding viskositas
etanol. Viskositas yang terlalu besar dapat meningkatkan tekanan pompa pada
KCKT dan mempengaruhi keawetan kolom yang digunakan. Selain itu, juga
digunakan akuabides untuk mendapatkan indeks polaritas yang sesuai, sehingga
dihasilkan profil kromatogram yang diinginkan dan memenuhi syarat yang
ditetapkan. Pencampuran masing-masing komponen fase gerak dilakukan dalam
instrumen KCKT (sistem isokratik). Pencampuran fase gerak menggunakan
sistem isokratik karena dapat meningkatkan efisiensi waktu dalam proses analisis
dan didukung oleh kemampuan instrumen KCKT yang memadai.
Fase gerak yang sudah dibuat terlebih dahulu disaring menggunakan
penyaring Whatman untuk menyaring partikel yang dapat menyumbat kolom.
Gelembung udaranya yang terdapat dalam fase gerak juga harus dihilangkan
dengan menggunakan ultrasonicator, karena adanya gelembung udara dapat
mengganggu tekanan pompa instrumen KCKT, akibatnya tekanan pompa menjadi
tidak stabil dan dapat mengganggu proses pembacaan sinyal dalam instrumen
KCKT.
Penggunaan TEA 3% yang bersifat basa dalam campuran fase gerak
berfungsi untuk menutup residu silanol (bersifat asam) yang terdapat dalam kolom
C18. Covering menggunakan TEA ini diperlukan karena teobromin dan kafein
merupakan senyawa yang bersifat basa yang akan terikat kuat dengan residu
42
silanol pada kolom C18 sehingga kromatogram yang dihasilkan akan mengalami
tailing. TEA dipilih sebagai campuran fase gerak karena merupakan amina tersier
sehingga memiliki halangan sterik yang cukup besar untuk menghalangi senyawa
teobromin dan kafein yang akan berinteraksi dengan residu silanol.
Trietilamin (TEA) digunakan sebagai campuran dalam fase gerak untuk
dapat menurunkan tailing factor yang dialami oleh senyawa-senyawa yang
bersifat basa (Choo et al., 1996). Penambahan TEA 3% (gambar 10) pada fase
gerak berperan sebagai kompetitor senyawa basa yang dapat menurunkan
kemampuan interaksi antara residu silanol pada kolom C18 dengan senyawa analit
melalui mekanisme covering (gambar 11), sehingga dapat menurunkan tailing
yang terjadi. Efisiensi dari kolom juga akan meningkat dengan semakin kecilnya
tailing yang terjadi (Long et al., 2007).
CH2CH3
H3CH2C N
CH2CH3
Gambar 10. Struktur Trietilamin

Si O(CH2)17 CH3
O H 3CH2C
Si OH N
CH2CH3
O H3CH2C
Si O(CH2)17 CH 3
Gambar 11. Interaksi Trietilamin dengan Residu Silanol dalam Kolom C18
C. Pembuatan Larutan Baku Campuran Teobromin dan Kafein
Baku teobromin diperoleh dari Sigma-Aldrich, memiliki kemurnian 99,7%
dengan Certificate of Analysis (COA) untuk menjamin kemurnian teobromin dan

43
baku kafein yang digunakan memiliki kualitas farmasetis, tingkat kemurniannya
99,58% dengan COA untuk menjamin kemurniannya. Pembuatan larutan baku ini
digunakan sebagai pembanding atau reference standard untuk memastikan bahwa
dalam sampel benar-benar terdapat analit yang dimaksud.
Larutan baku teobromin dan kafein dibuat dalam konsentrasi tertentu
dengan menggunakan pelarut akuabides panas dengan suhu 80oC karena kedua
senyawa tersebut larut dalam akuabides panas. Selain itu, digunakan akuabides
sebagai pelarut dikarenakan akuabides merupakan komponen terbesar fase gerak
sehingga senyawa teobromin dan kafein mudah terelusi dengan fase gerak.
Pemilihan pelarut sangat penting karena bertujuan untuk melarutkan analit yang
akan dianalisis, yang merupakan syarat utama dari pelarut. Selain itu, pelarut
harus murni, inert, dan dapat bercampur dengan fase gerak (Johnson and
Stevenson, 1978).
Larutan baku yang dibuat dalam penelitian ini terdiri dari dua macam,
yaitu larutan stok dan larutan intermediet. Larutan stok teobromin dan kafein
dibuat dengan konsentrasi masing-masing 1000 ppm, sedangkan larutan
intermediet dibuat dengan konsentrasi masing-masing 500 ppm. Larutan seri baku
campuran teobromin dan kafein dibuat dalam enam konsentrasi yang berbeda,
yaitu 20; 40; 60; 80; 100; dan 120 ppm teobromin serta 10; 20; 30; 40; 50; dan 60
ppm kafein. Sebelum dianalisis, larutan baku disaring dengan millipore untuk
menjamin bahwa tidak ada serabut atau partikel pengotor yang dapat mengganggu
pengukuran. Larutan baku kemudian didegassing dengan ultrasonicator selama
15 menit untuk menghilangkan gelembung udara, karena adanya gelembung gas

44
dapat mengganggu tekanan pompa instrumen KCKT, akibatnya tekanan pompa
menjadi tidak stabil sehingga dapat mempengaruhi detektor dan menghasilkan
sinyal palsu (Gritter et al., 1985). Selain itu, gelembung gas juga dapat
meningkatkan tekanan kolom sehingga dapar mengurangi efisiensi kolom.
D. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Teobromin dan kafein
dengan Spektrofotometer UV
Penentuan panjang gelombang pengamatan dilakukan dengan mengukur
panjang gelombang kedua analit terlebih dahulu secara terpisah. Pengukuran
panjang gelombang maksimum ini dilakukan dengan menggunakan
spektrofotometer UV karena secara teoritis, kedua senyawa ini memiliki panjang
gelombang maksimum antara 200-300 nm. Masing-masing spektra panjang
gelombang zat analit, selanjutnya dilakukan overlapping untuk mengetahui
panjang gelombang dimana teobromin dan kafein memberikan serapan secara
bersamaan dan optimal pada detektor KCKT yaitu detektor ultraviolet.
Pada penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan dengan
mengamati panjang gelombang pada rentang tersebut menggunakan tiga tingkat
konsentrasi untuk masing-masing analit. Konsentrasi yang digunakan adalah 5,
10, dan 15 ppm. Penggunaan tiga tingkat konsentrasi ini adalah untuk meyakinkan
bahwa panjang gelombang yang digunakan dalam pengamatan benar-benar
berasal dari panjang gelombang maksimum teobromin dan kafein. Selain itu, juga
bertujuan untuk melihat bahwa semakin meningkatnya konsentrasi senyawa analit
akan diikuti dengan peningkatan absorbansi.

45
Senyawa dapat dianalisis menggunakan spektorfotometer ultraviolet harus
memiliki gugus kromofor dan auksokrom. Teobromin dan kafein memiliki gugus
kromofor dan auksokrom sehingga dapat memberikan serapan pada panjang
gelombang ultraviolet. Gugus kromofor pada suatu senyawa bertanggung jawab
pada penyerapan cahaya ultraviolet, sedangkan gugus auksokrom bertanggung
jawab pada pergeseran panjang gelombang dan intensitas serapan maksimum
teobromin dan kafein. Berikut adalah gambar gugus kromofor dan auksokrom
teobromin dan kafein:
(a) (b)
Gambar 12. Gugus kromofor dan auksokrom pada teobromin (a) dan kafein (b)
Keterangan : = kromofor
= auksokrom
Hasil pengukuran panjang gelombang maksimum di ketiga tingkat
konsentrasi teobromin dan kafein dapat dilihat pada gambar spektra berikut:
Teobromin
Kafein
46
Teobromin
Kafein
Teobromin
Kafein
Gambar 13. Spektra serapan teobromin dan kafein dalam pelarut akuabides panas
(suhu 80oC) dengan maks= 275 nm
Keterangan : A = Konsentrasi 5 ppm (konsentrasi rendah); B = Konsentrasi 10 ppm
(konsentrasi tengah); C = Konsentrasi 15 ppm (konsentrasi tinggi)
Berdasarkan gambar 13, dapat dilihat bahwa ketiga seri kadar teobromin
dan kafein dalam pelarut akuabides panas (80oC) memiliki serapan maksimum
pada 275 nm. Teobromin dan kafein dalam pelarut metanol memiliki serapan
maksimum pada panjang gelombang 273 nm (Clarke, 1969). Adanya perbedaan
penggunaan panjang gelombang maksimum teobromin dan kafein karena pelarut
yang digunakan berbeda. Pada pengamatan panjang gelombang maksimum lebih
digunakan pelarut akuabides panas (80oC) dibanding pelarut metanol karena
kelarutan teobromin dan kafein lebih tinggi dalam akuabides panas (80oC).
Panjang gelombang pengamatan untuk campuran senyawa teobromin dan
kafein menggunakan panjang gelombang overlapping. Namun, karena pada kedua
senyawa analit teobromin dan kafein memiliki spektra yang hampir sama dan
47
panjang gelombang maksimumnya sama yaitu 275 nm, maka digunakan panjang
gelombang pengamatan pada 275 nm. Pada panjang gelombang pengamatan ini,
baik teobromin dan kafein memiliki serapan yang optimum pada detektor UV
yang digunakan dalam sistem KCKT. Teobromin dan kafein memiliki spektra
yang hampir mirip, karena keduanya memiliki gugus kromofor yang sama.
Namun memiliki gugus auksokrom yang berbeda sehingga yang membedakan
adalah intensitas penyerapannya.
E. Pembuatan Kurva Baku Teobromin dan Kafein
Pembuatan kurva baku bertujuan untuk memperoleh persamaan regresi
linear yang selanjutnya akan digunakan untuk menghitung kadar teobromin dan
kafein dalam sampel serbuk cokelat. Persamaan regresi linier yang diperoleh
menyatakan hubungan linier antara konsentrasi (jumlah) analit pada beberapa seri
baku dengan respon Area Under Curve (AUC). Parameter yang dilihat untuk
menentukan linearitas adalah keofisien korelasi (r) yang menyatakan korelasi
antara jumlah analit dengan AUC yang dihasilkan. Pemilihan kurva baku yang
nantinya akan digunakan untuk perhitungan kadar dari teobromin dan kafein
didasarkan pada nilai koefisien korelasi (r) > 0,999; terutama untuk analisis
komponen utama dalam sampel (Snyder et al., 1997), dan juga nilai slope serta
intersep.
Persamaan kurva baku yang digunakan untuk menetapkan kadar
teobromin yaitu y = 1,0993x + 3,6825 yang memiliki nilai r = 0,99978 serta

48
untuk menetapkan kadar kafein digunakan persamaan y = 1,0180x + 1,4254 yang
memiliki nilai r = 0,99989 (Yunita, 2012).
Konsentrasi vs AUC
150
100
AUC
y = 1,0993x + 3,6825
50 r = 0,99978
0
0 50 100 150
Konsentrasi Teobromin (ppm)
Gambar 14. Kurva hubungan antara jumlah teobromin dengan respon AUC
Konsentrasi vs AUC
80
60
AUC
40 y = 1,0180x + 1,4254
20 r = 0,99989
0
0 20 40 60 80
Konsentrasi Kafein (ppm)
Gambar 15. Kurva hubungan antara jumlah kafein dengan respon AUC
Berdasarkan kurva baku teobromin dan kafein di atas menunjukkan
hubungan linear antara jumlah analit dengan respon AUC. Kurva tersebut
menggambarkan terjadinya peningkatan respon AUC proporsional dengan
meningkatnya jumlah analit di dalam sampel.
F. Preparasi Sampel Serbuk Cokelat dengan Ekstraksi secara Soxhletasi
Dua puluh kemasan sampel serbuk cokelat dihomogenkan terlebih dahulu.
Proses homogenisasi dilakukan dengan mencampurkan semua sampel menjadi
satu ke dalam suatu wadah tertentu dan dihomogenkan. Sampel kemudian

49
ditimbang sebanyak 30 gram dan dimasukkan ke dalam kantong Soxhlet lalu
dilakukan proses soxhletasi.
Metode ekstraksi yang digunakan adalah soxhletasi. Metode soxhletasi
ini menggunakan pemanasan yang dilakukan terus menerus, teobromin dan kafein
termasuk senyawa yang tahan terhadap pemanasan, titik didih teobromin dan
kafein cukup tinggi, yakni 290°C dan 235-237°C (Clarke, 1986) sehingga metode
soxhletasi dapat digunakan untuk ekstraksi teobromin dan kafein. Alasan lain
dalam pemilihan metode soxhletasi karena pengerjaannya mudah dan cairan
penyari yang digunakan lebih sedikit dibandingkan metode ekstraksi lainnya
(Anonim, 1986).
Prinsip kerja adalah ekstraksi secara kontinyu dengan pemanasan dan
pendinginan berulang (refluks). Pemanasan menyebabkan pelarut menguap. Uap
yang terbentuk akan segera mencair kembali akibat adanya pendinginan. Serbuk
cokelat yang dibungkus dengan kertas saring dimasukkan ke dalam tabung, cairan
penyari dipanaskan hingga mendidih. Uap cairan penyari naik ke atas melalui pipa
samping, kemudian diembunkan kembali melalui pendinginan tegak. Cairan turun
ke labu melalui tabung yang berisi serbuk cokelat.
Sampel serbuk cokelat dibungkus menggunakan kertas saring karena
pori-pori kertas saring lebih kecil dibandingkan serbuk cokelat yang diekstraksi
sehingga butiran serbuk cokelat tidak keluar dari kantong Soxhlet selama proses
ekstraksi. Kertas saring juga dapat menyerap pelarut dengan baik sehingga pelarut
dapat bebas keluar masuk ke dalam pembungkus dan mengekstrak butiran serbuk
cokelat yang berada di dalamnya. Bila konsentrasi di zona kertas saring tinggi
50
maka pelarut akan dialirkan ke konsentrasi yang rendah di dalam tabung sifon,
setiap tetesan yang jatuh membasahi kertas saring akan beradaptasi untuk
mendapatkan konsentrasi yang sama dengan pelarut yang lebih dulu jatuh
membasahi kertas saring. Larutan tersebut kemudian akan memenuhi tabung
kapiler yang berada di sebelah tabung sifon sampai ketinggian tertentu, kemudian
larutan akan mengalir dan jatuh ke dalam labu alas bulat yang menjadi tempat
teobromin dan kafein terakumulasi.
Sampel serbuk coklat pertama-tama disoxhletasi dengan menggunakan
pelarut petroleum eter (titik didih 40-60oC) selama 4 jam dengan menjaga suhu
penangas air ± 50-65oC untuk menghilangkan lemak dalam sampel. Proses
pengilangan lemak dalam sampel menggunakan petroleum eter (titik didih 40-
60oC) perlu dilakukan karena di dalam sampel serbuk cokelat banyak terdapat
senyawa-senyawa lemak, karbohidrat, protein, serat dan mineral (Baba et al.,
2007) yang dapat mengganggu pada saat analisis teobromin dan kafein. Proses
penghilangan lemak dilakukan selama 4 jam supaya senyawa-senyawa lemak
yang terdapat di dalam serbuk cokelat sebagai pengganggu dalam proses
penetapan kadar teobromin dan kafein dapat dihilangkan dengan sempurna,
ditandai dengan tidak berwarnanya cairan sifon. Kandungan lemak dalam sampel
cokelat dianggap sebagai pengganggu dalam proses analisis kuantitatif karena
molekulnya yang besar dapat menyumbat kolom sehingga dapat mengganggu
pengukuran dan juga dapat mengakibatkan ketidakstabilan tekanan pompa.
Sampel serbuk cokelat yang telah dihilangkan lemaknya kemudian
direndam dengan NaOH 0,1 M selama ± 5 menit supaya teobromin dan kafein
51
tetap dalam bentuk molekul yang utuh karena teobromin (pKa = 10) dan kafein
(pKa = 10,4) termasuk senyawa alkaloid basa (Nadendla, 2005); sehingga perlu
dilakukan perendaman dengan suasana basa (pH = 13) supaya teobromin dan
kafein tetap dalam bentuk molekul yang utuh. Menurut Kazakevich and LoBrutto
(2007), pH bufer yang digunakan ± 2 unit dari nilai pKa analit agar analit berada
dalam bentuk tunggal yakni bentuk terion atau bentuk molekul utuh.
Teobromin dan kafein dalam sampel serbuk cokelat berada dalam bentuk
garam karena berikatan dengan asam-asam organik. Fungsi perendaman dengan
NaOH 0,1 M adalah untuk melepas teobromin dan kafein yang semula berbentuk
garam yang larut air menjadi teobromin dan kafein berbentuk basa sehingga dapat
larut dalam kloroform. Reaksi pembasaan teobromin dan kafein menggunakan
larutan NaOH 0,1 M (gambar 16 dan 17) adalah sebagai berikut:
O CH3 O CH3
H N H N
N N
+ NaOH + NaX + H20
N. HX N
O N O N
CH3 CH3
Teobromin dalam bentuk garam Teobromin dalam bentuk basa (molekul utuh)
(larut dalam air) (larut dalam pelarut organik)
Keterangan : HX adalah asam-asam organik

Gambar 16. Reaksi pembasaan teobromin menggunakan larutan NaOH 0,1 M
O CH 3 O CH 3
H3C N H 3C N
N N
+ NaOH + NaX + H 20
N. HX N
O N O N
CH3 CH3
Kafein alam bentuk garam Kafein dalam bentuk basa (molekul utuh)
(larut dalam air) (larut dalam pelarut organik)
Keterangan : HX adalah asam-asam organik

Gambar 17. Reaksi pembasaan kafein menggunakan larutan NaOH 0,1 M
52
Cairan penyari yang digunakan pada penelitian ini adalah kloroform
teknis. Klorofom dapat melarutkan alkaloid basa, sehingga zat pengganggu yang
larut hanya terbatas (Anonim, 1986). Teobromin dan kafein termasuk golongan
alkaloid basa, selain itu teobromin dan kafein juga sangat larut dalam kloroform
(Anonim, 1989).
Jumlah kloroform teknis sebagai cairan penyari yang digunakan adalah
100 mL, lebih dari dua kali sirkulasi. Satu kali sirkulasi dihitung ketika cairan
naik sampai penuh di tabung Soxhlet dan turun kembali menuju labu alas bulat.
Penggunaan cairan penyari minimal sebanyak dua kali sirkulasi dilakukan untuk
menjaga kondisi ekstraksi apabila sudah terjadi satu kali sirkulasi masih ada
pelarut yang tertinggal di labu.
Metode soxhletasi dapat dikatakan lebih hemat dalam hal jumlah pelarut,
karena sejumlah pelarut yang telah menarik teobromin dan kafein akan
tertampung di dalam labu alas bulat dan pelarut akan menguap kembali tanpa
membawa teobromin dan kafein untuk ikut teruap, dan setelah pelarut menguap,
pelarut akan didinginkan oleh pendingin sehingga mengalami kondensasi
kemudian menetes kembali sebagai kloroform yang baru kemudian membasahi
ulang kertas saring yang berisi serbuk cokelat, begitu seterusnya hingga pelarut
dalam tabung sifon kantong Soxhlet bening/tidak berwarna secara visual. Bila
larutan penyari telah bening maka seluruh komponen serbuk cokelat yang terlarut
dalam kloroform telah habis terekstraksi.
Keuntungan ekstraksi dengan soxhletasi yaitu penarikan kandungan
kimianya dapat optimal karena pelarutnya selalu baru, pelarutnya diuapkan dan
53
dengan adanya pendinginan maka uap yang ada berubah menjadi tetes-tetes
pelarut lagi dan turun mengenai serbuk, demikian seterusnya hingga waktu yang
telah ditentukan selesai.
Ekstrak cair yang didapatkan kemudian ditampung dalam cawan porselin
yang telah ditimbang sebelumnya, sehingga dapat diketahui berat ekstrak cokelat
yang diperoleh. Ekstrak cair hasil dari ekstraksi soxhletasi mengandung cairan
penyari klorofom yang masih banyak (encer), sehingga perlu diubah menjadi
ekstrak kental. Proses pengentalan dilakukan dengan penguapan menggunakan
waterbath, karena dengan menggunakan waterbath, suhu dapat diatur dan
pemanasan di setiap bagian waterbath sama (keseragaman suhu). Suhu yang
digunakan pada waterbath dijaga sekitar 65-75°C dengan pengamatan suhu pada
termometer yang dipasang pada statif, suhu ini berada di atas titik didih
kloroform, yaitu 61°C (Clarke, 1986).
G. Jumlah Sirkulasi Ekstraksi Teobromin dan Kafein dalam Serbuk Cokelat
yang Menghasilkan Kadar Maksimum
Tujuan penetapan jumlah sirkulasi ekstraksi teobromin dan kafein dalam
serbuk cokelat untuk mendapatkan jumlah sirkulasi ekstraksi yang maksimum
sehingga teobromin dan kafein terekstraksi seluruhnya. Metode yang digunakan
untuk penelitian ini adalah soxhletasi karena pengerjaannya mudah, cepat, cairan
penyari yang digunakan lebih sedikit daripada metode ekstraksi lain dan secara
langsung diperoleh hasil ekstraksi yang lebih pekat (Anonim, 1986).

54
Variasi penetapan jumlah sirkulasi ekstraksi pada penelitian ini adalah 25,
28, 31, 34, dan 37 kalli sirkulasi dan masing-masing tahapan sirkulasi dilakukan
replikasi sebanyak 3 kali untuk mengetahui reprodusibilitas kadar sampel yang
diperoleh. Jumlah 25 kali sirkulasi digunakan sebagai jumlah sirkulasi terendah
karena menurut Utami (2011), ekstraksi telah sempurna ditandai bila cairan sifon
tidak berwarna atau sirkulasi ekstraksi telah mencapai 20-25 kali.
Ekstrak kental dari masing-masing jumlah sirkulasi ditampung dalam
cawan poselin yang sudah ditimbang sebelumnya, sehingga dapat diketahui berat
ekstrak cokelat yang diperoleh. Respon AUC yang diperoleh kemudian
dimasukkan ke dalam persamaan baku yang diperoleh sehingga didapatkan kadar
sampel. Hasil kromatogram yang diperoleh:
Jumlah Sirkulasi vs Kadar Teobromin

0,12
Kadar Teobromin (% b/b)
0,10
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
20 25 30 35 40
Jumlah Sirkulasi Ekstraksi (kali)
Gambar 18. Kurva hubungan antara jumlah sirkulasi ekstraksi vs kadar teobromin (% b/b)
pada penetapan jumlah sirkulasi ekstraksi

55
Jumlah Sirkulasi vs Kadar Kafein

Kadar Kafein (% b/b) 0,10
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
20 25 30 35 40
Jumlah Sirkulasi Ekstraksi (kali)
Gambar 19. Kurva hubungan antara jumlah sirkulasi ekstraksi vs kadar kafein (% b/b)
pada penetapan jumlah sirkulasi ekstraksi
Berdasarkan hasil yang diperoleh pada gambar 18 dan 19 menunjukkan
terjadinya peningkatan kadar teobromin dan kafein seiring dengan terjadinya
peningkatan jumlah sirkulasi ekstraksi. Penarikan senyawa teobromin dan kafein
dari serbuk cokelat dalam penelitian ini ditujukan untuk keperluan analisis,
sehingga diharapkan senyawa teobromin dan kafein yang terambil dapat
semaksimal mungkin/seluruhnya.
Berdasarkan kurva pada gambar 18 dan 19, pada jumlah sirkulasi ekstraksi
yang ke 37 kali, didapatkan kadar teobromin dan kafein yang paling maksimum.
Namun, pada penelitian ini menggunakan jumlah sirkulasi ekstraksi 34 kali dan
proses sirkulasi tidak dilanjutkan, maka tidak ada jaminan pasti bahwa senyawa
teobromin dan kafein dalam ekstrak serbuk cokelat sudah terambil seluruhnya.
Tabel IV. Kadar rata-rata teobromin pada penetapan jumlah sirkulasi ekstraksi
Jumlah AUC Konsentrasi Berat Kadar Teobromin CV
SD
Sirkulasi Teobromin/40000 Teobromin (ppm) Ekstrak (g) (% b/b) (%)
25 47,4309 39,7966 0,8391 0,0444 0,0016 3,6909
28 49,6496 41,8148 1,0319 0,0575 0,0020 3,4426
31 53,0399 44,8989 1,3429 0,0804 0,0012 1,4704
34 58,9038 50,2331 1,5812 0,1057 0,0013 1,2000
37 60,1241 51,3432 1,5674 0,1073 0,0023 2,1482
56
Tabel V. Kadar rata-rata kafein pada penetapan jumlah sirkulasi ekstraksi

Jumlah AUC Kafein/ Konsentrasi Berat Kadar Kafein CV
SD
Sirkulasi 40000 Kafein (ppm) Ekstrak (g) (% b/b) (%)
25 26,6944 24,8222 0,8391 0,0276 0,0022 7,9438
28 29,4566 27,5356 1,0319 0,0379 0,0013 3,4598
31 23,7187 23,7187 1,3429 0,0425 0,0010 2,3486
34 44,9447 42,7498 1,5812 0,0899 0,0006 0,7220
37 46,0802 43,8653 1,5674 0,0917 0,0017 1,8403
Masing-masing sirkulasi ekstraksi diulangi sebanyak 3 kali
Menurut Gonzales and Herrador (2007), nilai %CV dari AOAC PVM
yang masih diperbolehkan untuk konsentrasi analit 100 ppm adalah 5,3%.
Pengukuran kadar teobromin pada penetapan jumlah sirkulasi ekstraksi yang
mempunyai konsentrasi dibawah 100 ppm, masing-masing tahapan sirkulasi
mempunyai nilai %CV lebih kecil 5,3%. Nilai %CV menurut ketentuan Horwitz,
konsentrasi analit 100 ppm adalah 8%. Pengukuran kadar kafein pada penetapan
jumlah sirkulasi ekstraksi yang mempunyai konsentrasi di bawah 50 ppm,
masing-masing tahapan sirkulasi mempunyai nilai %CV lebih kecil 8%.
Presisi adalah suatu ukuran kedekatan nilai data satu dengan data lainnya
dalam suatu pengukuran pada kondisi analisis yang sama (keterulangan hasil
pengukuran). Presisi dinyatakan dengan persen Relative Standard Deviation
(RSD) atau Coefficient of Variation (CV). Semakin kecil nilai CV maka
presisinya akan semakin baik.
Nilai %CV yang diperoleh di masing-masing tahap jumlah sirkulasi
ekstraksi menandakan bahwa kadar teobromin dan kafein yang diperoleh
mempunyai keterulangan yang baik sehingga kadar teobromin dan kafein yang
diperoleh dapat dipercaya dan dapat dipertanggungjawabkan.

57
H. Analisis Kualitatif Berdasarkan Waktu Retensi (tR) Teobromin dan

Kafein
Waktu retensi atau waktu tambat yang dinyatakan dalam satuan waktu
(menit) merupakan parameter analisis kualitatif dalam KCKT. Waktu retensi
adalah waktu yang dibutuhkan analit saat diinjek sampai keluar dari kolom dan
terdeteksi oleh detektor (Mulja dan Suharman, 1995).
Analisis kualitatif dilakukan dengan membandingkan waktu retensi
sampel (tR) dengan waktu retensi (tR) baku pembanding. Analisis kualitatif ini
dilakukan untuk membuktikan bahwa di dalam sampel serbuk cokelat yang diuji
terdapat teobromin dan kafein. Hal tersebut ditunjukkan dengan adanya kemiripan
waktu retensi sampel (tR) dengan waktu retensi (tR) baku pembanding. Hasil
kromatogram yang diperoleh sebagai berikut:
Teobromin
Kafein
Parameter KCKT:
Kolom : Kromasil Oktadesilsilan C-18 (100-5C18) merek KNAUER

dimensi 250 mm x 4,6 mm, ukuran partikel 5 µm
Fase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60, v/v)
Kecepatan alir : 0,8 mL/menit
Detektor UV : 275 nm
Volume injeksi : 10 µL
Gambar 20. Kromatogram baku campuran teobromin (60 ppm) dan kafein (30 ppm)
58
Teobromin
Kafein
Gambar 21. Kromatogram sampel ekstrak serbuk cokelat
Parameter KCKT sama dengan kromatogram pada gambar 20
Berdasarkan kromatogram yang dihasilkan, antara baku teobromin dan
kafein memiliki waktu retensi yang tidak jauh berbeda dengan sampel. Waktu
retensi baku teobromin adalah 2,260 menit dan waktu retensi baku kafein adalah
3,681 menit. Waktu retensi kedua senyawa pada sampel adalah 2,231 menit untuk
teobromin dan kafein memiliki waktu retensi 3,616 menit.
Waktu retensi teobromin dan kafein dipengaruhi oleh adanya perbedaan
interaksi antara kedua senyawa dengan fase diam dan fase gerak yang digunakan.
Pada penelitian ini, sistem KCKT yang digunakan yaitu sistem KCKT fase
terbalik dimana fase gerak yang digunakan bersifat lebih polar dibanding dengan
fase diamnya. Fase diam yang digunakan adalah oktadesilsilan (C18) dan fase
gerak yang digunakan yaitu campuran metanol dan akuabides/TEA 3% dengan
komposisi 40 : 60 (v/v). Pada sistem KCKT ini, senyawa yang lebih polar akan
terelusi terlebih dahulu dibandingkan dengan senyawa yang lebih non polar. Hal
ini terjadi karena senyawa yang lebih polar akan lebih kuat berinteraksi dengan
fase gerak dibandingkan interaksinya dengan fase diam, sehingga akan lebih
mudah terelusi melewati fase diamnya. Senyawa yang lebih non polar akan
59
cenderung berinteraksi lebih kuat pada fase diamnya maka akan tertinggal di
kolom lebih lama dan memiliki waktu retensi yang lebih lama dibanding senyawa
yang bersifat lebih polar. Berikut adalah gambar gugus non polar teobromin dan
kafein:
A O B O
CH3 CH3
H3 C N
N
HN N
N N
O N O N
CH3 CH3
Gambar 22. Gugus non polar teobromin (A) dan kafein (B)
= Gugus non polar
Dilihat dari strukturnya, kafein memiliki gugus non polar yang lebih
banyak dibandingkan dengan teobromin sehingga teobromin lebih bersifat polar
dibanding kafein. Gugus non polar akan berinteraksi dengan fase diam melalui
interaksi van Der Waals, sedangkan gugus polar akan berinteraksi dengan fase
gerak melalui interaksi hidrogen. Berikut ini adalah gambar interaksi teobromin
dan kafein dengan fase diam oktadesilsilan dan fase gerak metanol : akuabides
TEA 3% (40 : 60, v/v):

O
CH3
N
HN
N
O N
CH3
H3C
Si
O CH3
H3C
Gambar 23. Interaksi teobromin dengan fase diam C18 melalui interaksi van Der Waals
= interaksi van Der Waals
60
O
CH3
H3C
N
N
N
O N
CH3
H3C
Si
O CH3
H3C
Gambar 24. Interaksi kafein dengan fase diam C18 melalui interaksi van Der Waals
= interaksi van Der Waals
Pada gambar 23 dan 24 menunjukkan interaksi antara gugus non polar
teobromin dan kafein dengan fase diam oktadesilsilan (C18). Berdasarkan gambar
di atas terlihat kafein lebih banyak memiliki gugus non polar yang berinteraksi
dengan fase diam oktadesilsilan dibanding teobromin. Pada teobromin dan kafein
interaksi yang terjadi adalah interaksi van Der Waals, interaksi ini menyebabkan
kafein tertahan lebih lama di dalam kolom sehingga waktu retensi kafein lebih
lama dibanding waktu retensi teobromin.
H O H O CH3
H O CH3
H3C O H O H N
N H
H
N H O H O CH3
H3C O H O H O N
H CH3
Gambar 25. Interaksi teobromin dengan fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60,
v/v) melalui interaksi hidrogen
- - - - - = interaksi hidrogen
61
H O H O CH3
O CH3
H3C N
N H
N H O H O CH3
H3C O H O H O N
H CH3
Gambar 26. Interaksi kafein dengan fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60, v/v)
melalui interaksi hidrogen
- - - - - = interaksi hidrogen
Gambar 25 dan 26 di atas menunjukkan bahwa gugus polar senyawa
teobromin memiliki kemungkinan interaksi hidrogen yang lebih banyak dibanding
kafein sehingga teobromin memiliki waktu retensi yang lebih singkat dibanding
kafein, karena semakin banyak jumlah interaksi hidrogen maka interaksi antara
zat analit dengan fase gerak akan semakin kuat sehingga analit akan terelusi
terlebih dahulu.
I. Penetapan Kadar Teobromin dan Kafein dalam Sampel dengan
Penambahan Larutan Baku Campuran Teobromin dan Kafein
Penetapan kadar teobromin dan kafein dalam sampel yang telah ditambah
baku teobromin dan kafein diperlukan karena matriks baku teobromin dan kafein
yang digunakan tidak sama dengan matriks sampel yang akan dianalisis, sehingga
penggunaan kurva baku teobromin dan kafein saja dianggap belum cukup.
Penetapan kadar teobromin dan kafein dalam sampel dimaksudkan untuk
menentukan akurasi dan presisi baku teobromin dan kafein yang dispike ke dalam
matriks sampel.
62
Penetapan kadar teobromin dan kafein untuk menentukan akurasi dan
presisi menggunakan 3 level konsentrasi dan masing-masing konsentrasi
direplikasi sebanyak 3 kali. Konsentrasi teobromin yang digunakan 20, 60, dan
120 ppm, sedangkan kafein menggunakan konsentrasi 10, 30, dan 60 ppm.
Sebagai blanko digunakan sampel yang tidak dispike dengan senyawa baku.
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh Yunita (2012), masing-
masing level konsentrasi memiliki akurasi dan presisi yang baik, sesuai kriteria
yang diperbolehkan oleh Gonzales and Herrador (2007). Hal ini menunjukkan
bahwa dalam aplikasi penetapan kadar sampel dalam ekstrak cokelat dapat
menggunakan level konsentrasi teobromin 20, 60, dan 120 ppm, sedangkan
konsentrasi kafein 10, 30, dan 60 ppm karena masing-masing memberikan akurasi
dan presisi yang baik.
J. Penetapan Kadar Teobromin dan Kafein dalam Ekstrak Serbuk Cokelat
Analisis kuantitatif dilakukan dengan menghitung kadar teobromin dan
kafein yang terdapat dalam ekstrak serbuk cokelat. Penetapan kadar teobromin
dan kafein dalam ekstrak serbuk cokelat dihitung berdasarkan persamaan kurva
baku yang diperoleh dari validasi. Presisi yang dinyatakan dengan nilai koefisien
variasi (CV) merupakan parameter dalam mengukur suatu metode untuk
mendapatkan hasil yang reprodusibel. Perhitungan kadar teobromin dan kafein
dari sampel pada tabel berikut:

63
Tabel VI. Perhitungan kadar teobromin dan kafein dalam ekstrak serbuk cokelat
Teobromin Kafein
Sampel Konsentrasi Konsentrasi
Kadar % (b/b) Kadar % (b/b)
(ppm) (ppm)
1 52,0529 0,1112 44,0743 0,0941
2 51,9809 0,1093 43,8285 0,0921
3 52,0574 0,1068 44,1145 0,0905
4 51,8908 0,1057 43,9573 0,0896
5 52,0032 0,1070 44,1166 0,0907
6 51,9757 0,1052 44,1076 0,0893
x 0,1075 x 0,0911
SD 0,0023 SD 0,0018
CV (%) 2,1038 CV (%) 1,9807
Data penetapan kadar diperoleh rata-rata kadar teobromin dalam ekstrak
serbuk cokelat adalah 0,11 % (b/b) dengan nilai CV = 2,10% dan kadar kafein
adalah 0,09 % (b/b) dengan nilai CV = 1,98. Mengingat bahwa sampel serbuk
cokelat diproduksi dalam tiap kemasan yang berisi 45 gram, maka kadar
teobromin dapat dinyatakan sebanyak 48,38 mg/kemasan dan kadar kafein dapat
dinyatakan sebanyak 41,0 mg/kemasan.

BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
1. Jumlah sirkulasi ekstraksi serbuk cokelat merk “X” dengan metode soxhletasi
yang menghasilkan kadar teobromin dan kafein maksimum adalah 37 kali
sirkulasi.
2. Kadar teobromin dan kafein dalam serbuk cokelat merk “X” hasil penetapan
dengan metode KCKT fase terbalik yang telah tervalidasi yaitu 0,11 % (b/b)
untuk teobromin dan 0,09 % (b/b) untuk kafein. Coefficient of Variation (CV)
kadar teobromin yaitu 2,10% dan CV kadar kafein yaitu 1,98%.
B. Saran
1. Perlu dilakukan optimasi penggunaan petroleum eter dalam proses ektraksi,
sehingga proses penghilangan lemak dapat berjalan dengan optimal.
2. Perlu dilakukan penelitian dengan metode ekstraksi yang lain untuk penetapan
kadar teobromin dan kafein agar didapatkan kadar teobromin dan kafein yang
optimal.
3. Perlu dilakukan optimasi jumlah sirkulasi ekstraksi sampai didapatkan kadar
teobromin dan kafein maksimum, sehingga kadar teobromin dan kafein yang
diperoleh dapat mencerminkan kandungan teobromin dan kafein dalam
sampel serbuk cokelat yang sebenarnya.
64
65
4. Perlu dilakukan penetapan kadar teobromin dan kafein dalam sediaan serbuk
cokelat dengan menggunakan sampel yang lebih luas, sehingga hasil yang
diperoleh dapat diperbandingkan.

DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 1986, Sedian Galenik, Departemen Kesehatan Republik Indonesia,

Jakarta, pp. 5-25.
Anonim, 1989, The Merck Index, 11th Ed., Merck and Co., Inc., Rahway, N. J.,
USA, pp. 39, 164.
Anonim, 1990, Official Method of Analysis of AOAC International, 15th ed, vol
III, Chapter 29, AOAC International, Arlington, Virginia, USA, pp.
754.
Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi IV, Departemen Kesehatan Republik
Indonesia, Jakarta, pp. 254-255, 649, 753, 1067.
Anonim, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Cetakan I,
Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 1-12.
Alexander, J., Benford, D., Cockburn, A., Cravedi, J. P., Dogliotti, E., et al., 2008,
Theobromine as undesirable substances in animal feed Scientific
Opinion of the Panel on Contaminants in the Food Chain, The EFSA J.,
725, pp. 1-66.
Anonim, 2011, British Pharmacopoeia 2011, volume IV, The Stationery Office,
London, pp. 2115.
Ansel, H. C., 1985, Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi, Edisi Keempat,
diterjemahkan oleh Farida Ibrahim, Universitas Indonesia Press,
Jakarta, pp. 48.
Baba, S., Osakabe, N., Kato, Y., Natsume M., Yasuda, A., Kido T., Fukuda K.,
Muto Y., and Kondo K., 2007, Continuous intake of polyphenolic
compounds containing cocoa powder reduces LDL oxidative
susceptibility and has beneficial effects on plasma HDL-cholesterol
concentrations in humans, Am J. Clin Nutr., pp. 709-717
Choo, Khor Swan and Tee E-Siong, 1996, Development of a HPLC method for
the simultaneous determination of several B-vitamins and absorbic acid,
Malay. J. Nutrition., 2, pp. 49-65.
Clarke, E. G. C., 1986, Isolation and Identification of Drugs in Pharmaceutical,
Body Fluid and Post-Mortem Material, 2nd edition, The Pharmaceutical
Press, London, pp. 540-541, 1010-1011.
Czech, K., Johnson, A., and Rodeberg, N., 2011, Simultaneous determination of
caffeine and theobromine in local area coffee brews, Concordia College
J. Anal Chem., 2, pp. 17-22.
Dean, A. J.,1995, Analytical Chemistry Handbook, Mc Graw Hill, USA, pp.463.
Gandjar, I. G. dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, cetakan kedua,
Penerbit Pustaka Pelajar, Yogyakarta, pp. 385-386,390.
66
67
Gonzales, A. G., and Herrador, M. A., 2007, A practical guide to analytical

method validation, including measurement uncertainty and accuracy
proﬁles, Trend in Anal. Chem., 26, pp. 227-238.
Gritter, R. J., Bobbit, J. M., and Schwarting, A. E., 1985, Introduction to
Chromatography, diterjemahkan oleh Kosasih Padwawinata, edisi II,
Penerbit ITB, Bandung, pp. 205-219.
Harborne, J.B., 1987, Phitochemical methods, diterjemahkan oleh Padmawinata,
Kosasih dan Soediro, Iwang, Penerbit ITB, Bandung, pp. 19-21.
Harris. D. C., 1999, Quantitative Chemical Analysis, 2nd ed., W. H. Freeman and
Company, New York, pp. 648.
Helmenstine, A. M., 2010, Theobromine Chemistry: Theobromine Is Chocolate’s
Caffeine Relative, www.chemistry.about.com, diakses tanggal 13
Desember 2010
Johnson, E. L., and Stevenson, R., 1978, Basic Liquid Chromatography,
diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, Penerbit ITB, Bandung, pp.
2-11, 17-25, 90-91, 99-103.
Kazakevich, Y., dan LoBrutto R., 2007, HPLC for Pharmaceutical Scientists,
John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, pp. 15, 192.
Khopkar S. M., 1990, Konsep Dasar Kmia Analitik, UI Press, Jakarta, pp. 85-102.
Loong, William J. and Henderson, Jhon W. Jr., 2007, Chromatography of
Nitrogen Containing Compounds Without Triethylamine, Agilent
Technology.
Mitra, S., 2003, Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry, Wiley,
New York, pp. 143.
Mulja, M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Universitas Airlangga,
Surabaya, pp. 31-34.
Munson, J. W., 1984, Pharmaceutical Analysis Modern Methods, diterjemahkan
oleh Harjana Parwa B., Airlangga University Press, Surabaya, pp. 14-
16.
Mutiara, 2011, Cokelat, http://za0l.multiply.com/journal/item/240?&show
interstitial=1&u=%2Fjournal%2Fitem, diakses tanggal 18 Oktober
2011
Mutschler and Ernst., 1986, Arzneimettelwirkungen, diterjemahkan oleh Widianto
M. B., dan Ranti A. S., edisi IV, Penerbit Institut Teknologi Bandung,
Bandung, pp. 158-159.
Nadendla, R. R., 2005, Principles of Organic Medical Chemistry, New Age
International, New Delhi, pp. 19.
Noegrohati, S., 1994, Pengantar Kromatografi, UGM, Yogyakarta, pp. 6-17.
68
Pescok, R. L., Shields, L. D., and Caims, T., 1976, Modern Methods of Chemical
Analysis, 2nd ed, John Wiley & Sons, Canada, pp. 51.
Popl, M., 1990, Chromatographic Analysis of Alkaloids, Marcel Dekker Inc., New
York, pp. 43.
Qiqi, 2001, Kafein dan Minuman Kesehatan,
http://www.suaramerdeka.com/harian/0610/30/ragam04.htm, diakses
tanggal 18 Oktober 2011
Ramli, N., Yatim, A. M., Said, M., and Hok, H. C., 2001, HPLC Determination of
Methylxanthines and Polyphenols Levels In Cocoa and Chocolate
Products, Malaysian J. Anal. Sci., 7(2), pp. 377-386.
Robbers, J. E. 1996, Pharmacognosy and Pharmacobiotecnology, Lea & Febiger,
Pennsylvania, pp. 146-147, 184.
Rohman, A., 2009, Kromatografi untuk Analisis Obat, edisi pertama, cetakan
pertama, Penerbit Graha Ilmu, Yogyakarta, pp. 217-230.
Sastrohamidjojo, H., 2002, Spektroskopi, Penerbit Liberty, Yogyakarta, pp. 11.
Sidik dan Mudahar. H., 2000, Ekstraksi Tumbuhan Obat, Metode dan Faktor-
Faktor yang Mempengaruhi Produksi, dalam seminar PERHIBA
Pemanfaatan Bahan Obat Alam III, Fakultas Farmasi Universitas 17
Agustus 1945, Jakarta
Skoog, D. A., Holler, F., J., and Nieman, T. A., 1998, Principles of Instrumental
Analysis, 5th ed, Harcourt Bace Collage, Philadelphia, pp. 329-351.
Snyder, L. R., Kirkland, J.J., and Glajch, J.L., 1997, Pratical HPLC Method
Development, 2nd edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, pp.687.
Sunaryo, 1995, Farmakologi dan Terapi: Perangsang Susunan Saraf Pusat, edisi
IV, editor Sulistia G. Ganiswara, Bagian Farmakologi Fakultas
Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta, pp. 223, 227.
Tjay, T. H. dan Rahardja, K., 2002, Obat-Obat Penting, Edisi 5, PT. Elex Media
Komputindo, Jakarta, pp. 298, 351.
Utami, S., 2011, Mengapa Kepala Pusing Jika Mendadak Menghentikan
Kebiasaan Minum Kopi?, http://utamizufar.guru-
indonesia.net/artikel_detail-11195.html, diakses tanggal 18 Oktober
2011
Voigt, 1971, Buku Pembelajaran Teknologi Farmasi, Edisi Pertama,
diterjemahkan oleh Soendani Noerono, Gajah Mada University Press,
Yogyakarta, pp. 163-164.
Wanyika, H. N., Gatebe, E. G., Gitu, L. M., Ngumba E. K., and Maritim C. W.,
2010, Determination of Caffein Content of Tea and Isntant Coffe
Brands Found in The Kenyan Market, African J. of Food Science, 4(6),
pp. 353-358.
69
Wati, E. R., 2012, Optimasi Komposisi dan Flow Rate Fase Gerak pada
Penentuan Kadar Teobromin dan Kafein dalam Serbuk Cokelat dengan
Menggunakan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik,
Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Weinberg, Bennett Alan dan Bealer, Bonnie K., 2010, The Miracle of Caffein
Manfaat Tak Terduga Kafein Berdasarkan Penelitian Paling Mutakhir,
Qanita, Bandung, pp. 49.
Willard, H. H., Merrit, Jr., Dean, J.A., and Settle, Jr F. A., 1988, Instrumental
Methods of Analysis, 7th ed, Wardwoth Publishing Company,
California, pp. 580.
Wilmana, P. F., 1995, Analgesik-Antipiretik Anti-inflamasi Non Steroid dan Obat
Pirai dalam Farmakologi dan Terapi, firth Ed, Bagian Farmakologi
Fakuktas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta, pp. 207-215.
Winarno, F. G., 1997, Kimia Pangan dan Gizi, PT Gramedia Pustaka Utama,
Jakarta, pp. 231.
Yunita, M. S. R., 2012, Validasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
(KCKT) Fase Terbalik pada Penetapan Kadar Teobromin dan Kafein
dalam Serbuk Cokelat Merk “X”, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma, Yogyakarta.
70
LAMPIRAN
70
71
Lampiran 1. Sertifikat analisis teobromin

72
Lampiran 2. Sertifikat analisis kafein

73
Lampiran 3. Penimbangan serbuk cokelat tiap kemasan untuk perhitungan
keseragaman bobot sampel serbuk cokelat
Bobot sampel Bobot sampel pada Selisih bobot selisih bobot

No
terukur (g) kemasan (g) sampel (g) sampel (%)
1 48,227 45 3,227 6,8648
2 48,094 45 3,094 6,5819
3 45,386 45 0,386 0,8211
4 46,321 45 1,321 2,8102
5 49,458 45 4,458 9,4835
6 47,286 45 2,286 4,8630
7 45,345 45 0,345 0,7339
8 48,137 45 3,137 6,6734
9 46,219 45 1,219 2,5932
10 46,325 45 1,325 2,8187
11 45,395 45 0,395 0,8403
12 48,418 45 3,418 7,2711
13 47,335 45 2,335 4,9673
14 49,341 45 4,341 9,2346
15 45,480 45 0,480 1,0211
16 46,301 45 1,301 2,7676
17 48,165 45 3,165 6,7329
18 45,262 45 0,262 0,5574
19 47,384 45 2,384 5,0715
20 46,278 45 1,278 2,7187
× 47,008 45 2,00785 4,2713
Penyimpangan 10% 47,008 ± 4,700785
Penyimpangan 15% 47,008 ± 7,051178
74
Lampiran 4. Penimbangan sampel serbuk cokelat
1. Penimbangan sampel 25 kali sirkulasi ekstraksi
Replikasi I Replikasi II Replikasi III

Penimbangan
(g) (g) (g)
Berat beker glass 101,217 101,599 105,219
Berat beker glass + zat 131,226 131,621 135,239
Berat beker glass + sisa 101,221 101,613 105,225
Berat zat 30,005 30,008 30,014

Penimbangan
(g) (g) (g)
Berat zat 30,003 29,996 30,002

Penimbangan
(g) (g) (g)
Berat zat 29,996 30,006 29,996

Penimbangan
(g) (g) (g)
Berat zat 29,994 30,003 30,201

Penimbangan
(g) (g) (g)
Berat zat 30,001 29,999 30,001
75
6. Penimbangan sampel penetapan kadar (34 kali sirkulasi ekstraksi)
Berat beker glass Berat beker Berat beker Berat

Penimbangan
(g) glass + zat (g) glass + sisa (g) zat (g)
Replikasi I 104,043 134,059 104,050 30,009
Replikasi II 101,643 131,656 101,649 30,007
Replikasi III 105,284 135,292 105,290 30,002
Replikasi IV 101,639 131,644 101,647 29,997
Replikasi V 108,554 138, 562 108,561 30,001
Replikasi VI 103,977 133,979 103,983 29,996
Rata-rata 30,002
76
Lampiran 5. Penimbangan bobot tetap ekstrak cokelat
1. Penimbangan bobot ekstrak sampel 25 kali sirkulasi ekstraksi

Penimbangan
(g) (g) (g)
Berat cawan porselin 60,1557 56,2101 53,6462
Berat cawan porselin + ekstrak I 61,0580 57,0174 54,4538
Berat cawan porselin + ekstrak II 61,0583 57,0178 54,4540
Berat ekstrak 0,9023 0,8073 0,8076

Penimbangan
(g) (g) (g)
Berat ekstrak 1,0726 1.0154 1,0078

Penimbangan
(g) (g) (g)
Berat ekstrak 1,3751 1,3514 1,3022

Penimbangan
(g) (g) (g)
Berat ekstrak 1,5878 1,5634 1,5923

Penimbangan
(g) (g) (g)
Berat ekstrak 1,5423 1,5726 1,5874
77
6. Penimbangan bobot ekstrak sampel penetapan kadar (34 kali sirkulasi
ekstraksi)
Berat cawan Berat cawan Berat

Berat cawan
Penimbangan porselin + ekstrak I porselin + ekstrak II ekstrak
porselin (g)
(g) (g) (g)
Replikasi I 58,4752 60,0775 60,0777 1,6023
Replikasi II 55,5128 57,0899 57,0902 1,5771
Replikasi III 54,0787 55,6179 55,6179 1,5392
Replikasi IV 60,1530 61,6811 61,6814 1,5281
Replikasi V 46,6210 48,1638 48,1638 1,5428
Replikasi VI 57,8940 59,4124 59,4126 1,5184
Rata-rata 1,5513
78
Lampiran 6. Kromatogram sampel penentuan jumlah sirkulasi ekstraksi
Kromatogram sampel 25 kali sirkulasi
Replikasi I
Parameter KCKT:
Kolom : Kromasil Oktadesilsilan C-18 (100-5C18) merek KNAUER dimensi

250 mm x 4,6 mm, ukuran partikel 5 µm
79
Replikasi II
Parameter KCKT sama dengan kromatogram sampel 25 kali sirkulasi, replikasi I
Replikasi III

80
Replikasi I
Replikasi II

81
Replikasi III
Replikasi I

82
Replikasi II
Replikasi III

83
Replikasi I
Replikasi II

84
Replikasi III
Replikasi I

85
Replikasi II
Replikasi III

86
Lampiran 7. Kromatogram sampel menggunakan 34 kali sirkulasi
1. Kromatogram sampel replikasi 1
Parameter KCKT:
Kolom : Kromasil Oktadesilsilan C-18 (100-5C18) merek KNAUER dimensi

250 mm x 4,6 mm, ukuran partikel 5 µm
87

88

89

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 90
Lampiran 8. Data kadar teobromin penentuan jumlah sirkulasi
Konsentrasi Kadar
Sampel 25 kali AUC AUC Berat Berat sampel CV
Teobromin teobromin SD
sirkulasi Teobromin Teobromin/40000 ekstrak (g) (g) (%)
(ppm) (% b/b)
Replikasi I 1820317 45,5079 38,0473 0,9023 30,0050 0,0458
Replikasi II 1887226 47,1807 39,5690 0,8073 30,0080 0,0426
0,0016 3,6909
Replikasi III 1984170 49,6043 41,7736 0,8076 30,0940 0,0448
Rata-rata 1897237,6667 47,4309 39,7966 0,8391 30,0357 0,0444
Konsentrasi Kadar
(ppm) (% b/b)
Replikasi I 1986317 49,6579 41,8225 1,0726 30,0030 0,0598
Replikasi II 1985939 49,6485 41,8139 1,0154 29,9960 0,0566 0,0020 3,4426
Replikasi III 1985691 49,6423 41,8082 1,0078 30,0020 0,0562
Rata-rata 1985982,3333 49,6496 41,8148 1,0319 30,0003 0,0575
Konsentrasi Kadar
(ppm) (% b/b)
Replikasi I 2057940 51,4485 43,4513 1,3751 29,9960 0,0797
Replikasi II 2142013 53,5503 45,3633 1,3514 30,0060 0,0817
0,0012 1,4704
Replikasi III 2164830 54,1208 45,8822 1,3022 29,9960 0,0797
Rata-rata 2053732,5556 53,0399 44,8989 1,3429 29,9993 0,0804
Konsentrasi Kadar
(ppm) (% b/b)
Replikasi I 2369067 59,2267 50,5269 1,5878 29,9940 0,1070
Replikasi II 2351063 58,7766 50,1174 1,5634 30,0030 0,1045 0,0013 1,2000
Replikasi III 2348321 58,7080 50,0551 1,5923 30,2010 0,1056
Rata-rata 1897237,6667 58,9038 50,2331 1,5812 30,0660 0,1057
Konsentrasi Kadar
(ppm) (% b/b)
Replikasi I 2389744 59,7436 50,9971 1,5423 30,0010 0,1049
Replikasi II 2403954 60,0989 51,3202 1,5726 29,9990 0,1076 0,0023 2,1482
Replikasi III 2421196 60,5299 51,7124 1,5874 30,0010 0,1094
Rata-rata 1897237,6667 60,1241 51,3432 1,5674 30,0003 0,1073
Lampiran 9. Data kadar kafein penentuan jumlah sirkulasi
Konsentrasi
Sampel 25 kali AUC Berat ekstrak Berat sampel Kadar kafein
AUC Kafein Kafein SD CV (%)
sirkulasi Kafein/40000 (g) (g) (% b/b)
(ppm)
Replikasi II 911324 22,7831 20,9801 0,9023 30.0050 0,0252
Replikasi II 1112924 27,8231 25,9309 0,8073 30.0080 0,0279 0,0022 7,9438
Replikasi III 1179081 29,4770 27,5556 0,8076 30.0940 0,0296
Rata-rata 1067776,3333 26,6944 24,8222 0,8391 30.0357 0,0276
Konsentrasi
(ppm)
Replikasi II 1178629 29,4657 27,5445 1,0726 30,0030 0,0394
Replikasi II 1178625 29,4656 27,5444 1,0154 29,9960 0,0373 0,0013 3,4598
Replikasi III 1177539 29,4385 27,5178 1,0078 30,0020 0,0370
Rata-rata 1177539 29,4566 27,5356 1,0319 30,0003 0,0379
Konsentrasi
(ppm)
Replikasi II 995066 24,8767 23,0366 1,3751 29,9960 0,0422
Replikasi II 1041277 26,0319 24,1714 1,3514 30,0060 0,0435 0,0010 2,3486
Replikasi III 1032183 25,8046 23,9481 1,3022 29,9960 0,0416
Rata-rata 1032183 25,5711 23,7187 1,3429 29,9993 0,0425
Konsentrasi
(ppm)
Replikasi II 1788254 44,7064 42,5157 1,5878 29,9940 0,0900
Replikasi II 1800305 45,0076 42,8116 1,5634 30,0030 0,0892 0,0006 0,7220
Replikasi III 1804809 45,1202 42,9222 1,5923 30,2010 0,0905
Rata-rata 1804809 44,9447 42,7498 1,5812 30,0660 0,0899
Konsentrasi
(ppm)
Replikasi II 1834166 45,8542 43,6432 1,5423 30,0010 0,0897
Replikasi II 1851835 46,2959 44,0771 1,5726 29,9990 0,0924 0,0017 1,8403
Replikasi III 1843628 46,0907 43,8755 1,5874 30,0010 0,0929
Rata-rata 1843628 46,0802 43,8653 1,5674 30,0003 0,0917
Lampiran 10. Data kadar teobromin dan contoh perhitungan kadar teobromin
AUC Konsentrasi
AUC Berat ekstrak Berat sampel Kadar teobromin CV
Sampel Teobromin/ Teobromin SD
Teobromin (g) (g) (%b/b) (%)
40000 (ppm)
Replikasi I 2436170 60,9043 52,0529 1,6023 30,009 0,1112
Replikasi II 2433003 60,8251 51,9809 1,5771 30,007 0,1093
Replikasi III 2436368 60,9092 52,0574 1,5392 30,002 0,1068
0,0023 2,1038
Replikasi IV 2429044 60,7261 51,8908 1,5281 29,997 0,1057
Replikasi V 2433986 60,8497 52,0032 1,5428 30,001 0,1070
Replikasi VI 2432774 60,8194 51,9757 1,5184 29,996 0,1052
Rata-rata 2433557 60,8389 51,9935 1,5513 30,002 0,1075
Contoh perhitungan kadar teobromin (replikasi I)
Persamaan kurva baku teobromin  y = 1,0993x + 3,6825
Konsentrasi sampel  y = 1,0993x + 3,6825
60,9043 = 1,0993x + 3,6825
1,0993x = 60,9043 - 3,6825
1,0993x = 57,2218
x = 52,0529 ppm = 52,0529 µg/mL
= 520,529 µg/10 mL
= 0,520529 mg/10 mL
Berat ekstrak = 1,6023 g

, /
Kadar sampel = 100% = 2,08212% = 2,08%
/
,
Kadar teobromin dalam ekstrak = 1,6023 = 0,033361772 g
= 33,3618 mg
Berat sampel = 30,009 g

,
Kadar teobromin = 100% = 0,1112% b/b
,
Lampiran 11. Data kadar kafein dan contoh perhitungan kadar kafein
Konsentrasi
AUC AUC Berat Berat Kadar Kafein CV
Sampel Kafein SD
Kafein Kafein/40000 ekstrak (g) sampel (g) (% b/b) (%)
(ppm)
Replikasi I 1851722 46,2931 44,0743 1,6023 30,0090 0,0941
Replikasi II 1841713 46,0428 43,8285 1,5771 30,0070 0,0921
Replikasi III 1853359 46,3340 44,1145 1,5392 30,0020 0,0905
0,0018 1,9807
Replikasi IV 1846957 46,1739 43,9573 1,5281 29,9970 0,0896
Replikasi V 1853445 46,3361 44,1166 1,5428 30,0010 0,0907
Replikasi VI 1853078 46,3270 44,1076 1,5184 29,9960 0,0893
Rata-rata 1850046 46,2511 44,0331 1,5513 30,0020 0,0911
Contoh perhitungan kadar kafein (replikasi I)
Persamaan kurva baku kafein  y = 1,0180x + 1,4254
Konsentrasi sampel  y = 1,0180x + 1,4254
46,2931= 1,0180x + 1,4254
1,0180x = 46,2931 - 1,4254
1,0180x = 44,8677
x = 44,0744 ppm = 44,0744 µg/mL
= 440,744 µg/10 mL
= 0,440744 mg/10 mL
Berat ekstrak = 1,6023 g

, /
Kadar sampel = 100% = 1,762976% = 1,76%
/
,
Kadar kafein dalam ekstrak = 1,6023 = 0,028248164 g
= 28,2482 mg
Berat sampel = 30,009 g

,
Kadar kafein = 100% = 0,0941% b/b
,
98
Lampiran 12. Perhitungan konversi kadar teobromin dan kafein dalam
kemasan (45 gram)
1. Kadar rata-rata teobromin = 0,1075 % b/b
= 0,1075 g/100 g
,
Konversi  =
x = 48,375 mg/45 g
Kadar teobromin dalam tiap kemasan = 48,375 mg
2. Kadar rata-rata kafein = 0,0911 % b/b
= 0,0911 g/100g
,
Konversi  =
x = 40,995 mg/45 g
Kadar kafein dalam tiap kemasan = 40,995 mg

99
Lampiran 13. Perhitungan CV teobromin dan kafein dalam sampel
CV =
,
Teobromin = x 100% = 2,1435%
,
,
Kafein = x 100% = 1,9759%
,
BIOGRAFI PENULIS
Penulis skripsi berjudul “Penetapan Kadar Teobromin
dan Kafein dalam Ekstrak Serbuk Cokelat Merk “X”
Menggunakan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Fase Terbalik” memiliki nama lengkap Melisa
Darmawan. Penulis lahir di Semarang, Provinsi Jawa
Tengah pada tanggal 29 Mei 1990 sebagai anak keempat
dari pasangan Iwan Darmawan dan Maria Ningrum Darmawan. Pendidikan
formal yang pernah ditempuh penulis adalah TK Sinar Matahari (1995-1996), SD
Kebon Dalem (1996-2002), SMP Kebon Dalem (2002-2005), SMA Kebon Dalem
(2005-2008), kemudian tahun 2008 penulis melanjutkan kuliah di Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama kuliah, penulis aktif
dalam berbagai kegiatan dan organisasi antara lain panitia “Tiga Hari Temu
Akrab Farmasi/Titrasi” (2009), Panitia Seminar “Herbal Medicine” (2008),
panitia Baksos “Pengobatan Gratis” JMKI (2009), panitia “Farmasi untuk Sekolah
Dasar” ISMAFARSI USD (2009), panitia penyuluhan “Farmasi untuk Indonesia”
ISMAFARSI Joglosepur (2009). Selain kegiatan akademik, penulis juga pernah
mengikuti berbagai kegiatan non akademik dengan menjadi pemain basket putri
dalam Kejurnas Liga Basket Mahasiswa (LIBAMA) Divisi I 2009, menjuarai liga
basket regional Yogyakarta 2009, dan dalam Pharmacy Event Cup 2008.
100

Darmawan, 2012, Penetapan Kadar Kafein Dan Teobromin Dengan KCKT PDF

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Darmawan, 2012, Penetapan Kadar Kafein Dan Teobromin Dengan KCKT PDF

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PENETAPAN KADAR TEOBROMIN DAN KAFEIN DALAM EKSTRAK

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Kupersembahkan karyaku ini untuk:

Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Dalam pelaksanaan penelitian hingga selesainya penyusunan skripsi ini,

itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada:

1. Ipang Djunarko, M. Sc., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta.

penelitian maupun penyusunan skripsi ini.

kritik yang membangun dalam penyusunan skripsi dan dosen pembimbing

akademik atas bimbingan dan semangat yang telah diberikan.

saran dan kritik yang membangun dalam penyusunan skripsi.

5. Rini Dwiastuti, M. Sc, Apt. selaku Kepala Laboratorium Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

6. Seluruh Dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah

memberikan ilmu demi kemajuan mahasiswa dalam bidang farmasi.

7. Seluruh staf laboratorium kimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma:

banyak membantu selama penelitian di laboratorium.

8. Perpustakaan Universitas Sanata Dharma atas koleksi buku-buku dan fasilitas

internet sehingga mempermudah penulis dalam memperoleh bahan-bahan

yang dibutuhkan dalam penulisan skripsi ini.

9. Keluargaku tercinta, Papa Iwan Darmawan, Mama Maria Ningrum D, Mam

Christiana, Tante Lian, Ci Fen2, Oh Rudy, Ci Cen2, yang tidak pernah

berhenti memberikan semangat dan doa sampai terselesaikannya skripsi ini.

berbagi keluh kesah dan kegembiraan selama penelitian dan penyusunan

11. Keluarga kedua sekaligus sahabat-sahabatku Sari Tambunan, Novie Imoliana,

Secoadi, Vinsencia Vica, Heppy, Paul, Adi Wirasaputra, Velly, Novie

Imoliana, dan Meiske Munda. Terima kasih untuk diskusi dan

kebersamaannya selama penelitian di laboratorium.

dan Tika yang telah memberikan pengalaman berharga, keceriaan,

kebersamaan, suka duka selama praktikum serta telah memberikan semangat

dalam penyusunan dan ujian skripsi.

telah berbagi pengalaman, informasi, masukan, serta telah memberikan

semangat dan dukungan secara moril.

kekompakan yang begitu indah dan tak terlupakan.

dalam penyusunan dan ujian skripsi.

penulis dalam mewujudkan skripsi ini.

Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penyusunan

khususnya dan ilmu pengetahuan pada umumnya.

HALAMAN JUDUL ……………………………………………………… i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING …………………….……. ii

HALAMAN PENGESAHAN ……………………………………….…… iii

HALAMAN PERSEMBAHAN …………………………………….……. iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA …………………………………. v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ….. vi

PRAKATA ………………………………………………………..………. vii

DAFTAR ISI ………………………………………………..…………….. x

DAFTAR TABEL ……………………………………………..………….. xiv

DAFTAR GAMBAR ………………………………………..…………….. xv

DAFTAR LAMPIRAN ………………………………………..………….. xvii

INTISARI ………………………………………………..………………... xviii

ABSTRACT …………………………………………………..……………. xix

BAB I. PENGANTAR …………………………………………..………... 1

A. Latar Belakang …………………………………………………..…….. 1

2. Keaslian Penelitian …………………………………………..……. 5

3. Manfaat Penelitian ……………………………………………..….. 6

B. Tujuan Penelitian ………………………………………………..…….. 6

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA ……………………………………. 8

A. Cokelat (Theobroma cocoa) …...……………………………………… 8

2. Cairan Penyari ………………………………...…………………... 10

3. Metode Ekstraksi secara Soxhletasi ………………………………. 11

E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi …………………………………….. 16