Prinsip kerja dari spektrofotometer menganut hukum Lambert Beer. Dalam hukum ini jika cahaya monokromatik yang melewati satu media, maka sebagian cahaya lainnya akan diserap dan sebaian dipantulkan. Sementara sebagian lagi akan dipancarkan. Hukum Lambert Beer ini akan berjalan jika: a) Sinar yang masuk atau yang mengenai sel sampel berupa sinar dengan panjang gelombang monokromatis. b) Penyerapan sinar dalam larutan tidak dipengaruhi adanya larutan lain dalam satu larutan. c) Penyerapan dapat terjadi di dalam volume larutan yang memiliki luas penampang (cuvet) yang sama. d) Larutan yang diukur haruslah benar-benar jernih supaya tidak terjadi hamburan cahaya partikel koloid. e) Memiliki konsentrasi analit yang rendah, sebab jika konsentrasi analitnya tinggi maka akan mengganggu kelinearan grafik absorbansi.