the reaction mixture is loaded into a PCR plate which generally contains 96 Wells allowing the analysis

of several samples at the same time

Kemudian campuran reaksi dimasukkan ke dalam plate PCR yang umumnya memuat 96 lubang
dan memungkinkan analisis pada beberapa sampel disaat yang sama.

Next the plate is placed in a PCR machine which is essentially a thermal cycler
Selanjutnya plate ditempatkan di mesin PCR yang pada dasarnya adalah mesin pendaur panas

Real time RT-PCR is used for the detection of the new corona virus 2019 by the amplification of Target
Sequences in the Rdrp gene, the E Gene and the N Gene
Sebenarnya RT-PCR digunakan untuk mendeteksi virus corona baru 2019 dengan amplifikasi dari
urutan pada gen Rdrp, E Gene dan N Gene target

The choice of the target Gene depends on the primers and the probe sequences
Pilihan dari gen target tergantung pada primer dan urutan probe

The first step in RT-PCR is reverse transcription

Langkah pertama dalam RT-PCR adalah transkripsi balik (transkipsi reverse)

The first-strand complementary DNA synthesis is primed with the PCR reverse primer which hybridizes
to a complementary part of the virus RNA genome
Sintesis DNA Komplemen Untai pertama sediakan dengan PCR reverse primer yang berhibridasi
menjadi bagian komplementer dari genom RNA Virus.

Reverse transcriptase then adds DNA nucleotides onto the 3-prime end of the primer synthesizing DNA
complementary of the viral RNA
Transkripsi balik kemudian menambahkan nukleotida DNA ke ujung 3-prime ( 3 ’ ) dari primer
menSintesis DNA Komplemen dari RNA Virus.
The temperature and duration of this step depend on the primer, the target RNA and the reverse
transcriptase use
Suhu dan durasi dari langkah ini tergantung pada primer, target RNA dan penggunaan transkipsi
balik.
Next, an initial denaturation step is applied, causing denaturation of the RNA-DNA hybrids
Selanjutnya, langkah denaturasi awal dilaksanakan, menyebabkan denaturasi hibridasi RNA-DNA

This step is required for the activation of DNA polymerase and simultaneously the inactivation of reverse
transcriptase
Langkah ini diperlukan untuk aktivasi DNA polimerase dan secara bersamaan inaktivasi
transkripsi balik

PCR consists of a series of thermal Cycles, with each cycle consisting of denaturation, annealing, and
extension steps
PCR terdiri dari serangkaian Siklus termal, dengan setiap siklus terdiri dari langkah denaturasi,
penempelan, dan pemanjangan ( tambah jurnal )

Denaturation step consists of heating the reaction chamber to 95 degree Celsius, and it is used for
denaturation of the double-stranded DNA template
Langkah denaturasi terdiri dari pemanasan ruang reaksi hingga 95 derajat Celcius, dan digunakan
untuk denaturasi templat DNA untai ganda.

In The Next Step, the reaction temperature is lowered to 58 degree Celsius allowing a annealing of the
forward primer to its complementary part of the single-stranded DNA template
Pada langkah berikutnya, suhu reaksi diturunkan menjadi 58 derajat celsius yang memungikinkan
penempelan (annealing) dari primer forward ke bagian komplementer dari templet DNA untai
tunggal

The annealing temperature relies directly on length and composition of the primers
Suhu penempelan bergantung langsung pada panjang dan komposisi dari primer
In the extension step, the DNA polymerase synthesizes a new DNA strand complementary to the DNA
template strand by adding free nucleotides from the reaction mixture that are complementary to the
template in the 5 Prime ( 5’) to 3 Prime (3’) direction.
Pada tahap pemanjangan (extension) , DNA polimerase mensintesis untai DNA komplemen ke
untai DNA templet dengan menambahkan nukleotida bebas dari campuran reaksi komplemen ke
templet pada arah 5’ hingga 3’ .
the temperature at this step depends on the DNA polymerase used
suhu pada langkah ini tergantung pada DNA polimerase yang digunakan

After the first cycle, the double-stranded DNA Target is obtained

Setelah siklus pertama, target DNA untai ganda diperoleh

Then the denaturation of this double-stranded DNA is performed yielding to single-stranded DNA
molecules
Kemudian, denaturasi ( pemisahan) dari DNA untai ganda ini menghasilkan molekul DNA untai
tunggal

The Next Step the reaction temperature is lowered, allowing annealing of the primers to each of the
single-stranded DNA templates and annealing of the Taq-man probe to its complementary part of the
target DNA
Langkah Selanjutnya suhu reaksi diturunkan, memungkinkan penempelan (annealing) primer
untuk masing-masing templet dna untai tunggal dan penempelan (annealing) Taq-man probe ke
bagian kompelem dari target DNA

Taq-man Probe consists of a fluorophore covalently attached to the (5’) 5 Prime end of the
oligonucleotide probe
Probe Taqman terdiri dari fluorofor yang secara kovalen melekat pada ujung (5 ') 5 dari probe
oligonukleotida

The Fluorescence is emitted by the fluorophore when it is excited by the cycler’s light source
Fluoresensi dipancarkan oleh fluorophore, ketika tereksitasi oleh sumber cahaya siklus

Also, this probe consists of a quencher at the 3 prime (3’) end

probe ini juga terdiri dari quencher pada ujung 3 prime (3 ')

The close proximity of the reporter to the quencher prevents detection of its fluorescence
Kedekatan antara reporter dengan quencher mencegah deteksi fluoresensi
In the extension step, DNA polymerase synthesizes new strands.
Pada langkah pemanjangan, DNA polimerase mensintesis untaian baru.

When the polymerase reaches a Taqman probe

Ketika polimerase mencapai probe Taqman

Its endogenous (5’) nuclease activity cleaves the probe, separating the dye from the quencher
Aktivitas nuklease endogen (5 ') nya memotong probe, memisahkan pewarna dari quencher

With each cycle of PCR, more dye molecules are released ,resulting in an increase in fluorescence
intensity proportional to the amount of amplicon synthesized
Dengan setiap siklus PCR, lebih banyak molekul zat warna dilepaskan, menghasilkan peningkatan
intensitas fluoresensi sebanding dengan jumlah amplikon yang disintesis.

this method allows the estimation of the amount of a given sequence present in the sample
metode ini memungkinkan esmitasi dari jumlah urutan yang diberikan dalam sampel
the number of double stranded DNA pieces is doubled in each cycle
jumlah potongan DNA untai ganda digandakan dalam setiap siklus

therefore, PCR can be used to analyze extremely small amounts of sample

Oleh karena itu, PCR dapat digunakan untuk menganalisis jumlah sampel yang sangat kecil

For the measurement of the fluorescence signal, a Tungsten-halogen lamp an excitation filter, mirrors,
lens, an emission filter and a charge-coupled device- CCD camera are used filtered light from the lamp is
reflected off mirror, passes through a condensing lens, and is focused into the center of each well,
Untuk pengukuran sinyal fluoresensi, lampu Tungsten-halogen sebagai filter eksitasi, kaca,lensa,
dan filter emisi dan perangkat muatan-berpasangan camera CCD digunakan cahaya yang
tersaring dari lampu yang terpantul cermin, melewati lenda kondensasi, dan difokuskan ke pusat
masing-masing lubang

then fluorescent light emitted from the wells reflects off the mirror, passes through an emission filter and
is detected by the CCD camera
kemudian lampu pijar yang dipancarkan dari lubang memantul dari cermin, melewati filter emisi
dan dideteksi oleh kamera CCD.
in each PCR cycle, light from excited fluorophore can be detected by the CCD camera
di setiap siklus PCR, cahaya dari fluorofor yang tereksitasi dapat dideteksi oleh kamera CCD

which converts the light that it captures into Digital Data

yang mengubah cahaya yang ditangkapnya menjadi Data Digital

this method is known as real time PCR

metode ini dikenal sebagai PCR waktu nyata

which allows the monitoring of the progress of the PCR reaction as it occurs in real time
yang memungkinkan pemantauan perkembangan reaksi PCR seperti yang terjadi secara real time