Nama : Tyara Salsabila A.

P
NIM : 171810301004
Kelas : Teknik Penelitian Biokimia

TUGAS REVIEW
ISOLASI DNA, ISOLASI DNA PLASMID DAN ISOLASI RNA

Isolasi DNA
Isolasi DNA adalah salah satu teknik dasar dalam biologi molekuler yang dapat
dikembangkan menjadi penelitian-penelitian yang kompleks mengenai informasi genetic
yang telah dimiliki oleh suatu organisme. Genom adalah suatu sel lengkap dari materi genetic
(DNA) yang dimiliki oleh organisme dan telah terorganisasi menjadi kromosom. DNA dapat
diisolasi pada manusia, tumbuhan, hewan ataupun mikroorganisme. Infomasi yang terdapat
pada DNA tersimpan dalam bentuk basa nukleotida yaitu adenine (A), guanine (G), cytosine
(C) dan timin (T).
Isolasi DNA yang akan dilakukan yaitu isolasi DNA Salmonella sp. . Salmonella sp.
adalah salah satu patogen yang dapat menyebabkan suatu penyakit pada manusia. Salmonella
sp. ini tergolong dalam bakteri Gram negative yang tidak memiliki spora, bergerak dengan
flagel peritrik, bersifat intraseluler fakultatik dan fakultatik anaerob. Umumnya isolasi
Salmonella sp. pada suatu sampel yang mengandung >107 sel bakteri membutuhkan media
pengaya yang selektif untuk mendukung pertumbuhan Salmonella sp. dan akan menghambat
pertumbuhan mikroorganisme lainnya.
Bahan yang digunakan pada isolasi DNA Salmonella sp. ini yaitu membutuhkan
kultur Salmonella sp. yang ditumbuhkan di dalam medium Luria Bertani (LB), kemudian
dikocok semalam pada suhu 37oC, proteinase K, buffer lisis, fenol, etanol 70% dan buffer
TBE. Metode isolasi DNA pada Salmonella sp. ini yaitu pertama Salmonella sp. diinokulasi
pada media Luria Bertani (LB) dan digojok semalam pada suhu 37oC. Sebanyak 15 mL kultur
disentrifus dengan kecepatan 12000 rpm selama 5 menit pada suhu ruang. Supernatan
dibuang lalu ditambahkan dengan 750 μL buffer lisis pada pellet kemudian divotex.
Proteinase K ditambahkan sebanyak 10 μL yang setara dengan 10 mg/m. Campuran
kemudian dikocok selama 15 menit, setelah semua bahan tercampur secara homogen lalu
diinkubasi pada suhu 55oC selama 30 menit. Campuran yang telah diinkubasi kemudian
disentrifus kembali dengan kecepatan 12000 rpm selama 10 menit pada suhu ruang, lalu
ditambahkan dengan fenol sebanyak 700-750 μL atau dengan perbandingan 1:1 dengan
sampel kemudian dikocok kembali secara perlahan selama 15 menit dan disentrifus selama
10 menit. Lapisan atas yang terbentuk dipindahkan ke dalam tabung ependorf 1,5 mL dan
ditambahkan dengan etanol dingin 96% (perbandingan 1:1 atau 1:2). Larutan kemudian
dicampur secara perlahan sampai terbentuk benang-benang halus yang berwana putih.
Benang-benang DNA tersebut kemudian diambil dan dicuci dengan menggunakan etanol
70%, lalu disentrifus selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk dibuang dan pellet
dikeringkan, lalu pellet yang telah dikeringkan ditambahkan dengan TE 200 μL dan disimpan
pada suhu 4oC. Untuk membuktikan isolasi DNA yang dilakukan tersebut menghasilkan
DNA murni maka dilakukan proses elektroforesis gel agarosa dengan cara pertama disiapkan
gel agarosa dengan konsentrasi 1% lalu DNA Salmonella sp. yang dihasilkan dari proses
isolasi ditambahkan dengan 4 μL loading dye. Campuran tersebut kemudian dimasukkan ke
dalam sumur gel dan di running dengan voltase 100 volt. Pita DNA yang terbentuk kemudian
diamati dibawah sinar UV.
Isolasi DNA Plasmid
DNA plasmid pada dasarnya dapat diperoleh dari sel-sel bakteri yang mengandung
plasmid, tetapi tidak semua sel bakteri mengandung plasmid dan tidak semua jenis plasmid
dapat digunakan di dalam percobaan yang menggunakan metode tertentu. Sel-sel bakteri
yang mengandung plasmid spesifik dapat diperoleh melalui proses transformasi genetic.
DNA plasmid yang digunakan dalam isolasi ini adalah plasmid pGEM® -3Zf(+).
Perbanyakan plasmid dapat dilakukan dengan menggunakan metode transformasi pada sel
E.coli dH5α.
Bahan yang digunakan pada isolasi DNA plasmid pGEM® -3Zf(+) yaitu TSS 1X,
85% LB medium,10% PEG, 5% DMSO, 50 mM MMgCl 2, DNA plasmid, sel kompeten
E.coli DH5α, medium agar LB, ampisilin (10μg/mL), es batu, 0,1 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl
(pH 7,8), 1 mM dan 10 mM EDTA, 50 glukosa, 25 mM Tris-Cl (pH 8), lisosim, 5 M kalium
asetat, 10 N NaOH, SDS 20%, 3 M Na asetat, etanol absolut, etanol 70%, buffer TE, X-Gal
(20 mg/mL), 100 mM IPTG dan 7,5 M Amonium asetat. Metode isolasi DNA plasmid yang
akan dilakukan yaitu pertama kultur sel bakteri yang mengandung DNA plasmid
(ditumbuhkan dari koloni biru) berusia 16 jam dimasukkan ke dalam tabung
mikrosentrifugasi 1,5 mL, kemudian sel akan dipanen dengan sentrifugas pada kecepatan
12.000 rpm selama 1 menit. Pellet yang telah didapatkan ditambahkan dengan menggunakan
0,5 mL STE (0,1 mM NACl;10 mM Tris-Cl (pH 7,8); dan 1 mM EDTA) yang sebelumnya
telah didinginkan dengan menggunakan es lalu dilakukan vortex sampai homogen, lalu
disentrifus lagi pada kecepatan 12.000 rpm selama 1 menit. Selanjutnya, endapan bakteri
disuspensi kembali dalam 200 μL larutan I (50 mM glukosa,25 mM Tris-Cl (pH 8), 10 mM
EDTA, 5 mg/mL lisosim ditambahkan sesaat sebelum digunakan). Campuran divorteks
hingga larutan menjadi homogen lalu dilakukan inkubasi pada suhu ruang selama 5 menit.,
kemudian larutan II (0,2 NaOH, SDS 1%, ddH 2O) ditambahkan sebanyak 400 μL lalu tabung
diseal dengan menggunakan parafilm selanjutnya isi pada tabung dicampur dengan cara
membolak balikkan tabung secara hati-hati dan dibiarkan di dalam es selama 5 sampai 10
menit. Campuran yang telah didinginkan tersebut ditambahkan dengan 7,5 M ammonium
asetat sebanyak 300 μL lalu dilakukan vorteks selama 10 detik dan disimpan kembali di
dalam es selama 10 menit. Selanjutnya, campuran disentrifus dengan kecepatan 13000 rpm
selama 5 menit lalu supernatan yang dihasilkan dipindahkan ke dalam tabung yang baru dan
ditambahkan dengan menggunakan isopropanol dingin sebanyak 0,6 volume supernatant lalu
tabung dibolak-balik sampai homogen. Kemudian, campuran yang telah homogen diinkubasi
dalam suhu ruang selama 5 menit lalu disentrifus dengan kecepatan 13000 rpm selama 5
menit. Supernatan yang dihasilkan kemudian dibuang lalu ditambahkan dengan
menggunakan ethanol 70% dingin sebanyak 1 mL dan dilakukan sentrifugasi dengan
kecepatan 13000 rpm selama 2 menit, selanjutnya supernatan yang dihasilkan dibuang lalu
pelet yang diperoleh dikeringkan. Hasil pelet yang diperoleh kemudian ditambahkan dengan
larutan TE sebanyak 25 μL dan disimpan dalam suhu -20oC. Untuk membuktikan isolasi
DNA plasmid yang dilakukan tersebut menghasilkan plasmid maka dilakukan proses
elektroforesis gel agarosa dengan cara plasmid yang telah dihasilkan dari proses isolasi
dielektroforesis pada gel agarosa 0,8% (b/v) yang mengandung ethidium bromide 0,5 ug/mL
dan degan menggunakan fase gerak buffer TAE. Hasil elektroforesis didokumentasi dengan
menggunakan gel doc.
Isolasi RNA
Isolasi RNA dapat dilakukan dengan menggunakan Isolasi RNA Kit. Penggunaan
isolasi RNA kit ini dapat menghasilkan isolate RNA yang lebih murni dari kontaminan dan
dari degradasi RNA. Isolasi ini pada umumnya menggunakan etanol atau alkohol dingin
dengan konsentrasi 90-95%. Etanol atau alcohol tidak dapat melarutkan RNA dan kerapatan
alcohol lebih ringan daripada air sehingga membuat RNA naik dan melayang ke permukaan.
Isolasi yang akan dilakukan ini adalah isolasi RNA pada virus Dengue.
Virus Dengue ini adalah virus RNA yang menyebabkan penyakit dengan manifestasi
klinis Deman Berdarah Dengue. Demam berdarah ini muncul dalam dua bentuk yaitu demam
berdarah biasa dan demam berdarah bentuk yang parah. Dengue Hemorrhagic fever (DHF)
dan Dengue Shock Syndrom (DSS) dpaat menyebabkan pendarahan di dalam perut. Apabila
bentuk yang parah tersebut tidak segera ditangani maka dapat menyebabkan kasus yang
sangat fatal. Demam berdarah dengue (DBD) disebabkan oleh virus dengue yang masih
menjadi suatu masalah di negara tropis. Demam berdarah dengue (DBD) ini adalah suatu
penyakit yang paling cepat untuk menyebar sekitar 50 juta kasus infeksi di seluruh dunia.
Demam berdarah telah muncul sebagai masalah kesehatan utama di daerah tropis dan
hamparan subtropics di dunia yang dpaat menyebabkan peningkatan kematian setiap
tahunnya. Demam berdarah ini merupakan virus yang ditularkan melalui gigitan nyamuk
betina. Penularan penyakit ini dapat terjadi ketika nyamuk betina aedes tersebut menghisap
darah orang yang terinfeksi virus dengue dan nyamuk akan menggigit orang yang lainnya.

Bahan yang digunakan pada isolasi RNA pada virus dengue tipe 1 adalah virus
dengue type 1 yang telah diisolasi dari Surabaya, aseton, dimetil sulfide (DMSO), ethanol
96%, isolasi RNA kit yang disuplai oleh Qiagen dari USA, nuclease free water (NFW),
etidium bromide, buffer TAE dan gel agarosa. Metode isolasi RNA pada virus Dengue ini
adalah untuk RNA mengisolasi dari sel yang telah terinfeksi Vero yang digunakan sebagai
konsentrasi dari reagen. Pertama sampel diambil terlebih dahulu dari kulkas dan biarkan
meleleh, kemudian sampel dicampur dengan menggunakan 2,24 mL AVL dan 22,4 μL AVE.
Campurkan larutan tersebut dengan menggunakan vorteks selama 15 detik, lalu sentrifugasi
campuran tersebut dan pellet RNA yang dihasilkan dicuci dengan menggunakan etanol 560
μL. Kemudian dipindahkan 630 μL ke dalam mini kolom QiAamp, campuran tersebut
kemudian disentrifus kembali dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Langkah
selanjutnya adalah menambahkan buffer AW 2 sebanyak 500 μL, lalu disentrifus pada
kecepatan 14000 rpm selama 3 menit kemudian sisa air dikeluarkan dan dipindahkan ke
tabung yang baru setelah itu dilakukan sentrifus kembali dengan kecepatan 14000 rpm
selama 3 menit dan apabila sudah selesai diletakkan pada tabung eppendorf. Selanjutnya
tambahkan dengan buffer AVE sebanyak 40 μL lalu disentrifus dengan menggunakan
kecepatan 8000 rpm selama 1 menit dan terakhir, simpan pada suhu -80 oC. Untuk
membuktikan bahwa isolasi RNA yang dilakukan tersebut dikatakan berhasil maka setelah
dilakukan proses isolasi RNA pada virus Dengue tersebut dilakukan proses isolasi DNA
dengan menggunakan PCR lalu kemudian dapat diamati lebih lanjut dengan menggunakan
elektroforesis gel agarosa yaitu dengan cara pencampuran 1 μL marker, 6 μL buffer TAE dan
3 μL DNA yang telah diperoleh dari isolasi dengan PCR. Kemudian campuran tersebut
dimasukkan ke dalam sumur gel lalu gel akan berjalan selama 30 menit pada 100 volt dan
diwarnai dengan menggunakan etidium bromide. Band-band yang telah dihasilkan tersebut
divisualisasikan pada sinar UV trans-illuminator.