BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

1.1.1. Media Kultur

Pertumbuhan organisme hanya dimungkinkan apabila kondisi fisik dan kimiawi

lingkungannya sesuai. Yang dimaksud dengan kondisi fisik adalah suhu dan struktrur
bahan. Sedangkan kondisi kimiawi yang diperlukan untuk pertumbuhan adalah air,
sumber nitrogen, sumber karbon, sumber energi/kalori, mineral (P, K, Mg, Na, Ca,
dalam jumlah yang besar dan Cu, Mn, Co, Fe, dan Mo dalam jumlah yang sedikit),
factor pertumbuhan (misalnya vitamin) maupun konsentrasi ion hydrogen (pH)

Pertumbuhan mikroorganisme tergantung dari cukupnya tersedia bahan-bahan

nutrisi yang diperlukan oleh mikroorganisme tersebut. Media kultur dapat berupa
atau terdiri dari bahan dimana secara umum mikroorganisme tersebut hidup/tumbuh
misalnya: Darah, Susu, Ekstrak tanah. Yang terpenting, media kultur harus
mengandung semua zat-zat yang diperlukan untuk pertumbuhan dari
mikroorgasnisme tersebut.

Media untuk pertumbuhan bakteri dapat berupa media cair, padat, maupun semi
padat. Media cai, atau bisa disebut “broth”, berupa nutrient yang dilarutkan dalam
air. Adanya pertumbuhan bakteri di dalam cairan itu ditunjukan dengan adanya
kekeruhan. Media padat terdiri dari bahan nutrient yang dilarutkan dalam air
ditambah dengan agar untuk memadatkan media. Bakteri diinokulasikan pada
permukaan media padat akan tumbuh membentuk koloni. Media semi padat mirip
dengan media padat hanya konsentrasinya agak rendah, sehingga memberikan
kosistensi seperti jeli.

1.1.2. Sterilisasi Alat Laboratorium

Dalam mempelajari mikroorganisme dalam kultur murni, para mikrobiologi

memerlukan alat-alat yang menunjang dalam usaha mendapatkan kultur murni.
Dalam mikrobiologi, peralatan laboratorium merupakan unsur penting yang harus
ada. Peralatan yang ada dalam laboratorium pun haruslah steril agar dapat menunjang
pekerjaan yang berhubungan dengan mikroorganisme dan hal tersebut merupakan
syarat mutlak. Artinya, pada bahan atau peralatan yang akan digunakan harus bebeas
 dari mikroorganisme yang tidak diingikan yang dapat merusak media atau koloni
suatu mikroorganisme yang diinginkan (Suriawira, 2005).

Sterilisasi dalam mikrobiologi adalah suatu proses untuk mematikan semua

organisme yang terdapat pada atau didalam suatu benda. Ketika anda untuk pertama
kalinya melakukan pemindahan biakan bakteri secara aseptik, sesungguhnya anda
telah menggunakan salah satu sterilisasi, yaitu pembakaran. Namun kebanyakan
peralatan dan media yang umum dipakai dalam pekerjaan mikrobiologis akan
menjadi rusak bila dibakar. Untungnya tersedia berbagai metode lain yang efektif
(Hadioetomo, 1993).

Ada tiga cara yang umum digunakan dalam sterilisasi yaitu penggunaan panas,
penggunaan bahan kimia dan penyaringan (Filtrasi). Bila panas digunakan bersama –
sama dengan uap air maka disebut sterilisasi panas lembut atau sterilisasi basah, bila
tanpa kelembapan maka disebut sterilisasi panas kering atau sterilisasi kering
(Hadioetomo, 1993).

Sterilisasi kimiawi dapat dilakukan dengan menggunakan gas atau radiasi.

Metode sterilisasi yang umum digunakan secara rutin dilaboratorium mikrobiologi
ialah yang menggunakan panas (Hadioetomo, 1993).

Mikroorganime hidup di segala tempat (tanah, air udara makanan, pembuangan,

dan pada permuikaan tubuh). Keberadaan mereka yang ada di segala tempat
menyulitkan para mikrobiolog untuk memperoleh suatu koloni mikroorganisme
tertentu dan yang sejenis tanpa adanya mikroorganisme lain yang mencampuri koloni
tersebut. Kultur mikroorganisme yang tersusun dari sel-sel sejenis (tuinggal) disebut
juga sebagai kultur murni.

Steril merupakan syarat mutlak keberhasilan kerja dalam lab mikrobiologi. Dalam
melakukan sterilisasi, diperlukan teknik-teknik agar sterilisasi dapat dilakukan secar
sempurna, dalam arti tidak ada mikroorganisme lain yang mengkontaminasi media.
Sterilisasi adalah proses untuk menjadikan alat-alat terbebas dari segala bentuk
kehidupan. Seperti yang telah disebutkan bahwa tujuan sterilisasi untuk mematikan
mikroorganisme yang tidak diinginkan agar tidak ikut tumbuh.

Ada beberapa teknik sterilisasi, yaitu dengan cara fisik dengan panas, mekanik
dengan filtrasi dan kimia dengan senyawa-senyawa kimia. Dalam praktikum ini kami
mencoba mempelajari bagaimana cara mensterilisasi cawan petridis dengan
menggunakan autoclave dan mensterilisasi jarum ose menggunakan lampu Bunsen.

1.2 Tujuan :
 1. Menyadari kebesaran tuhan yang menciptakan Bumi dan seisinya khususnya tumbuhan
dan hewan segabagai hasil pertanian dan perikanan yang dimanfaatkan manusia sevagai
kebutuhan pokok untuk tumbuh dan berkembang
2. Menunjukan perilaku ilmiah (memiliki rasa ingin tahu, objektif, jujur, teliti, cermat, tekun,
ulet, hati-hati, bertanggung jawab, ulet, kritis, kreatif, inovatif, dan peduli lingkungan )
dalam kegiatan sehari-hari sebagai wujud implementasi sikap ilmiah dalam melakukan
percobaan dan berdiskusi

1.3 Manfaat
-
-
-
-:

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Media Kultur

Bahan nutrisi yang digunakan untuk pertumbuhan mikroorganisme laboratorium disebut

media kultur. Pengetahuan tentang habitat normal mikroorganisme sangat membantu dalam
pemilihan media yang cocok untuk pertumbuhan mikroorganisme di laboratorium. Karena
mikroorganisme memiliki perbedaan pada kebutuhan nutrisinya, tidak ada satupun medium
yang dapat menumbuhkan seluruh mikroorganisme yang sama (Lee, 1983).

Berdasarkan konsistensinya, media dikelompokkan menjadi dua macam yaitu media cair
(liquid media) dan media padat (solid media). Apabila media cair merupakan ekstrak
kompleks material biologis, maka media tersebut dinamakan rich media atau broth. Media
padat menggunakan bahan pembeku (solidifying agent), misalnya Agar, suatu Agar
memiliki komposisi kimia berupa D-galaktosa, 3,6-anhidro-L-galaktosa,D-glucuronic acid.
Agar sebagai bahan pembeku akan mencair saat dididihkan, kemudian didinginkan pada
suhu 40-42℃ sebelum dibekukan. Media Agar ini tidak akan mencair lagi kecuali pada suhu
80-90℃. Agar merupakan media yang paling sering digunakan dan terbuat dari rumput laut
pilihan, media agar adalah agen pengeras yang bagus sekali karena tidak dapat
didegradasi oleh mikroorganisme (Pratiwi, 2008).
Menurut kandungan nutrisinya, media dapat dibedakan menjadi beberapa macam (Pratiwi,
2008):

• Defined media (synthetic media)

Defined media merupakan media yang komponen penyusunnya sudah diketahui atau
ditentukan. Media ini biasanya digunakan dalam penelitian untuk mengetahui kebutuhan
nutrisi mikroorganisme. Contoh: media untuk Escherichia coli.

• Media kompleks (complex media)

Media kompleks merupakan media yang tersusun dari komponen yang secara kimia tidak
diketahui dan umumnya diperlukan karena kebutuhan nutrisi mikroorganisme tertentu tidak
diketahui. Contoh: Nutrient Broth/ Nutrient Agar, Tryptic Soy Broth (TSB)/ Tryptic Soy
Agar (TSA), MacConkey Agar

• Media umum (general media)

Media umum merupakan media pendukung bagi banyak pertumbuhan mikroorganisme.

• Media penyubur (enrichment media)Media penyubur merupakan media yang berguna

untuk mempercepat pertumbuhan mikroorganisme tertentu. Media ini digunakan bila kita
ingin menumbuhkan salah satu mikroorganisme dari kultur campuran. Media ini
menggunakan bahan atau zat yang serupa dengan habitat tempat mengisolasi
mikroorganisme tersebut.

• Media selektif (selective media)

Media selektif merupakan media yang mendukung pertumbuhan mikroorganisme tertentu
(seleksi) dengan menghambat pertumbuhan mikroorganisme yang lain. Pada media ini
ditambahkan bahan penghambat pertumbuhan, misalnya bile salt dan dye (fuchsin, crystal
violet, brilliant green) yang akan menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif dan tidak
memberi efek pada bakteri Gram negatif; antibiotik; dan selulosa untuk mengisolasi bakteri
pendegradasi selulosa.

• Media diferensial (differential media)

Media diferensial digunakan untuk membedakan kelompok mikroorganisme dan bahkan
dapat digunakan untuk identifikasi. Contohnya adalah media Agar Darah, media
MacConkey.

• Media khusus
 Contoh media khusus adalah media untuk bakteri anaerob. Biasanya ke dalam media
tersebut ditambahkan bahan yang dapat mereduksi kandungan 𝑂2 dengan cara pengikatan
kimiawi. Contoh bahan-bahan itu adalah sistein, sebagai indikator anaerob digunakan
rezasurin.

2.2 Sterilisasi Alat Labortorium

Sterilisasi adalah suatu proses di mana kegiatan ini bertujuan untuk membebaskan alat
ataupun bahan dari berbagai macam mikroorganisme. Suatu bahan bisa dikatakan steril
apabila bebas dari mikroorganisme hidup yang patogen maupun tidak baik dalam bentuk
vegetatif maupun bentuk nonvegetatif (spora) (Subaghdja, 2010).

Sterilisasi adalah suatu proses untuk membunuh semua jasad renik yang ada, jika
ditumbuhkan di dalam suatu medium tidak ada jasad renik yang dapat berkembang baik.
Sterilisasi harus dapat membunuh renik yang paling tahan panas yaitu spora bakteri
(Fardiaz, 1992).
Adanya pertumbuhan mikroorganisme menunjukkan bahwa pertumbuhan bakteri masih
berlangsung dan tidak sempurnanya proses sterilisasi. Jika sterilisasi berlangsung sempurna,
maka spora bakteri yang merupakan bentuk paling resisten dari kehidupan mikrobia akan
diluluhkan (Lay dan Hatowo, 1992).

Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik, fisik dan
kimiawi. Pemilihan mekanisme sterilisasi yang dilakukan hendaknya disesuaikan dengan
sifat bahan yang akan disterilkan. Sterilisasi secara fisik dilakukan dengan menggunakan
pemanasan, penggunaan sinar UV, sinar X, dan sinar-sinar yang memiliki panjang
gelombang pendek (Waluyo, 2008).

Ada tiga cara utama yang umum dipakai dalam sterilisasi yaitu penggunaan panas,
penggunaan bahan kimia, dan penyaringan (filtrasi). Bila panas digunakan bersama-sama
dengan uap air maka disebut sterilisasi panas lembab atau sterilisasi basah, bila tanpa
kelembaban maka disebut sterilisasi panas kering atau sterilisasi kering. Di lain pihak,
sterilisasi kimiawi dapat dilakukan dengan mengunakan gas atau radiasi. Pemilihan metode
didasarkan pada sifat bahan yang disterilkan (Ratna, 1993).

Menurut Ratna (1993), berikut ini adalah jenis proses sterilisasi:

a. Sterilisasi basah atau sterilisasi panas lembab

Sterilisasi basah biasanya dilakukan di dalam autoklaf atau sterilisator uap yang mudah
diangkat (portable) dengan menggunakan air jenuh bertekanan pada suhu 121oC selama 15
menit. Maka sterilisasi basah dapat digunakan untuk mensterilkan bahan apa saja yang dapat
ditembus uap air (misalnya minyak) dan tidak rusak bila dipanaskan dengan suhu yang
berkisar antara 110oC dan 121oC. Bahan-bahan yang biasanya disterilkan dengan cara ini
antara lain medium biakan yang umum, air suling, peralatan laboratorium, biakan yang
dibuang, medium yang tercemar, dan bahan-bahan dari karet.

Ada 4 hal utama yang harus diingat bila melakukan sterilisasi basah:
1. Sterilisasi bergantung pada uap, karena itu udara harus dikosongkan betul-betul dari
ruang sterilisator.
2. Semua bagian bahan yang disterilkan harus terkena uap, karena itu tabung dan labu
kosong harus diletakkan dalam posisi tidur agar udara tidak terperangkap di dasarnya.
3. Bahan-bahan yang berpori atau yang berbentuk cair harus permeabel terhadap uap.
4. Suhu sebagaimana yang terukur oleh termometer harus mencapai 121oC dan
dipertahankan setinggi itu selama 15 menit.

b. Sterilisasi kering
Sterilisasi kering atau sterilisasi panas kering dapat diterapkan dengan cara pemanasan
langung sampai merah, meayangkan di atas nyala api, pembakaran dan sterilisasi dengan
udara panas (oven). Pemanasan kering sering digunakan dalam sterilisasi alat-alat gelas di
laboratorium.

Dalam sterilisasi panas kering, bahan yang sering disterilkan adalah pipet, tabung reaksi,
cawan petri dari kaca, dan barang-barang pecah belah lainnya. Bahan-bahan yang disterilkan
harus dilindungi dengan cara membungkus, menyumbat atau menaruhnya dalam suatu
wadah tertutup untuk mencegah kontaminasi setelah dikeluarkan dari oven.
Sebelum melakukan sterilisasi udara panas kering ini terlebih dahulu membungkus alat-alat
gelas dengan kertas payung atau aluminium foil, setelah itu atur pengatur suhu oven menjadi
160oC dan alat disterilkan selama 2 jam.

c. Sterilisasi uap
Uap panas pada suhu 100oC dapat digunakan dalam bentuk uap mengalir. Metode ini
mempunyai keterbatasan. Penggunaan uap mengalir dilakukan dengan proses sterilisasi
bertingkat untuk mensterilkan media kultur. Metode ini jarang memuaskan untuk larutan
yang mengandung bahan-bahan karena spora sering gagal tumbuh di bawah kondisi ini,
karena bentuk vegetatif dari kebanyakan bakteri tidak membentuk spora. Temperatur suhu
titik mati bervariasi, tetapi tidak ada bentuk non spora yang bertahan. Dalam prakteknya,
suatu perpanjangan pemaparan uap selama 20-60 menit akan membunuh semua bentuk
vegetatif bakteri tapi tidak akan menghancurkan spora. Untuk meyakinkan penghancuran
spora, dilakukan sterilisasi bertingkat. Proses ii dilakukan dengan waktu yang bervariasi,
dari 20-60 menit setiap hari selama 3 hari. Setiap hari setelah sterilisasi bahan disimpan pada
inkubator pada 37oC. Prinsip dari metode ini adalah pada saat pemaparan pertama, uap
membunuh bakteri vegetatif tapi tidak sporanya. Tapi pada saat bahan disimpan pada
inkubator atau pada suhu ruangan selama 24 jam, spora akan tumbuh ke dalam bentuk
vegetatif. Spora yang telah tumbuh ini akan dimatikan pada pemanasan hari ke dua.
Kesuksesan dari proses ini tergantung pada spora yang berkembang ke bentuk vegetatif
selama masa istirahat.

d. Penyaringan (filtrasi)
Penyaringan telah banyak digunakan untuk mensterilkan medium laboratorium dan
larutan yang dapat mengalami kerusakan jika dipanaskan. Penyaringan dengan ukuran pori-
pori 0,45 mikron atau kurang akan menghilangkan jasad renik yang terdapat di dalam
larutan tersebut. Penyaring yang banyak digunakan terbuat dari gelas sinter, selulsa dan
asbestos atau penyaring Seitz. Pori-pori dari penyaring tersebut berkisar antara 0,22 sampai
10 mikron. Pori-pori yang lebih kasar biasanya digunakan untuk penjernihan sebelum
digunakan pori-pori yang lebih halus, sehingga tidak terjadi penyumbatan. Penyaring yang
biasa digunakan untuk bakteri tidak dapat menahan atau menyaring virus atau mikoplasma.
Beberapa contoh bahan yang biasa disterilkan dengan cara ini adalah serum, larutan
bikarbonat, enzim, toksin, bakteri, medium sintetik tertentu, dan antibiotik.
Ada beberapa macam filter, yaitu:

1) Filter Swinny
Sebuah adaptasi dari filter seitz, filter swinny mempunyai adaptor khusus yaitu terdiri
dari lapisan asbes, bersama dengan layer dan pencuci. Keutamaan untuk digunakan filter
swinny dibungkus dengan kertas dan autoklaf. Bagian yang dipotong dihubungkan pada
spoit werlock dan cairan dimasukkan ke potongan asbes dengan menggunakan tekanan pada
sal spoit.

2) Filter Fritted-Glass
filter berbanding lurus dengan ukurannya. Setelah potongan dibentuk, potongan disegel
dengan pemanasan di dalam gelas pirex seperti corong buhcner.

3) Filter Berkefeld dan Mandler

Mandler terbuat dari tanah silika murni, asbestos dan kalium sulfat. Berkefeld juga
tersusun dari tanah silika murni. Masing-masing filter bermuatan negatif.

4) Filter Selas
Filter ini secara kimia bersifat resisten terhadap semua larutan yang tidak menyerang
silika.
5) Filter Candles-Pasteur-Chamberland
Terbuat dari pori porselen tak berkaca dengan pori kecil yang menghasilkan filtrasi
lambat.
e. Sterilisasi dengan desinfektan
Desinfektan adalah zat yang dapat membunuh bakteri. Senyawa kimia yang banyak
digunakan sebagai esinfektan antara lain: larutan AgNO3, CuSO4, HgCl2, ZnO, serta
alkohol dan campurannya. Zat-zat yang dapat membunuh atau menghambat pertumbuhan
bakteri dapat dibagi atas garam-garam, logam, fenol, dan senyawa-senyawa lain yang
sejenis, formaldehida,yodium, alkohol, klor, zat warna, detergen, sulfonamida, dan
antibiotik. Umumnya bakteri yang muda kurang daya tahannya terhadap desinfektan
daripada bakteri yang tua. Kepekatan, konsentrasi dan lamanya berada di bawah pengaruh
desinfetan merupkan faktor-faktor yang berperan dalam sterilisasi jenis ini.

f. Sterilisasi gas
Sterilisasi gas digunakan dalam pemaparan gas atau uap untuk membnih mikroorganisme
dan sporanya. Beberapa bahan kimia yang dapat digunakan untuk sterilisasi gas adalah
etilena oksida, asam parasetat, formaldehida dan glutaraldehida alkalin. Cara ini diterapkan
pada suhu kamar selama 2-18 jam tergantung pada bahan kimianya. Hal-hal yang perlu
diperhatikan dapat sterilisasi gas antara lain:
1) Lamanya waktu yang diperlukan sesudah perlakuan untuk menghilangkan semua sisa
bahan kimia yang digunakan.
2) Daya bahan bakar yang bersangkutan.
3) Persyaratan peralatan.
4) Biaya pelaksanaan.
g. Sterilisasi dengan radiasi
Sterilisasi dengan radiasi dapat dilakukan dengan sinar gamma (sinar UV kadang juga
digunakan tetapi tidak begitu baik karena daya tembusnya lemah) namun penggunaannya
terbatas karena menuntut persyaratan keamanan dan biaya tinggi.
 BAB III

METODOLOGI PRAKTIKUM

3.1 MEDIA KULTUR

Waktu dan Tempat :

Kamis, 3 Oktober 2019 , Pada pukul 10:00 – Selesai, di Laboratorium Mikrobiologi Kampus
Sudirman, Denpasar -Bali

Bahan dan Alat

Alat :
1. Cawan petri
2. Preparat
3. Pipet tetes
4. Bunsen
5. Jarum ose
6. Stopwatch
7. Mikro pipet

Catatan : Alat-alat diatas sudah di sterilisasi agar tidak terkontaminasi dari kuman dan
bakteri dari luar

Bahan :
1. Agar
2. Alkohol 95%
3. Pepton
4. Aquadesh
5. Tisu=sue
6. Larutan EMBA
7. Larutan NA
8. Sampel air keran

Skema kerja :
1. Siapkan media padat yang telah dibuat 1 hari sebelumnya
2. Siapkan sampel yang akan dihitung jumlah bakterinya. Bila menggunakan sampel air
(air keran misalnya) dengan pipet no.1 tuanglah kedalam tabung reaksi pertama yang
telah berisi 9ml larutan pepton, lalu tabung pertama berisi suspensi dengan pengenceran
10−1sebelum disingkirkan dikocok terlebih dahulu atau bisa menggunakan alat bantu
seperti vortex
3. Dengan pipet no.2 ambil 1ml suspensi 10−1 dan tuanglah kedalam tabung reaksi dengan
suspensi pengenceran 10−2 , tabung di vortex dan pipet disingkirkan
4. Dengan pipet no.3 ambil 1 ml suspensi 10−2 dan tuanglah kedalam tabung reaksi dengan
suspensi pengenceran 10−3 , lalu vortex dan pipet no.3 disingkirkan
5. Dengan pipet no.4 ambil 1ml suspensi 10−3 dan tuang ke tabung pengenceran 10−4, lalu
tabung di vortex dan pipet no.4 disingkirkan
6. Dengan pipet no.5 ambil 1ml suspensi 10−4 dan tuang ke tabung pengenceran 10−5 , lalu
di vortex, dan pipet no.5 disingkirkan
7. Dengan pipet no.6 ambil 1ml suspensi 10−5 dan tuang ke tabung pengenceran 10−6 , lalu
vortex, dan pipet no.6 disingkirkan
8. - Masih dengan pipet no.6 ambil 1ml suspensi 10−6 dan teteskan pada cawan petri ke 4
yaitu cawan dengan label 10−6
-Ambil 1ml suspensi 10−5 dan teteskan pada cawn petr ke 3 yaitu cawan dengan label
10−5
- Ambil 1ml suspensi 10−4 dan teteskan pada cawn petri ke 2 yaitu cawan dengan label
10−4
- Ambil 1ml suspensi 10−3 dan teteskan pada cawn petri ke 1 yaitu cawan dengan label
10−3
9. Siapkan media EMBA buka penutup EMBA lalu bakar mulut Erlenmeyer tersebut,
tuangkan media secukupnya pada cawan dengan label 10−3 dan cawan dengan label
10−4, tutup kembali tabung Erlenmeyer
10. Siapkan media NA buka penutup NA lalu bakar mulut Erlenmeyer tersebut, tuangkan
media secukupnya pada cawan dengan label 10−1dan cawan dengan label 10−2 , tutup
kembali tabung Erlenmeyer
 11. Setelah inokulasi selesai cawan petri di inkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam dengan
posisi terbalik
12. Setelah di inkubasi dilakukan penghitungan jumlah kalori pada masing-masing cawan
petri

3.2 Sterilisasi Alat Laboratorium

Skema Kerja:
A. Sterilisasi menggunakan autoklaf (panas basah)
1. Diletakkan cawan Petridis dalam keadaan terbalik di atas kertas kemudian
dibungkus dengan rapi.
2. Dibuka tutup autoklaf dan dicek dahulu banyak air dalam autoklaf.
3. Ditambahkan air jika kurang dari tanda batas yang ditentukan.
4. Dimasukkan peralatan/bahan yang akan disterilkan.
5. Ditutup autoklaf dengan rapat dan dikencang baut pengaman agar tidak ada udara
yang keluar.
6. Dinyalakan autoklaf dan diatur timer dengan waktu minimal 15 menit pada suhu
121°C.
7. Jika autoklaf berbunyi maka tanda sterilisasi selesai.
8. Dikeluarkan peralatan/bahan dari dalam autoklaf dengan hati-hati.

B. Sterilisasi menggunakan lampu bunsen (pemijaran)

1. Dipanaskan jarum ose pada lampu Bunsen sampai berwarna merah.
2. Didiamkan sebentar sampai kira-kira jarum ose dingin/steril.
3. Diambil mikroba yang ada di dalam cawan Petridis menggunakan jarum ose yang
sudah steril.
 BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN