DARBEPOETIN ALFA
KELAS : A3D
Ngurah Putra Pastiya 18021106
Ketut Mery Virgoyani 18021107
Kadek Yuni Artini 18021108
Kadek Tiffanie Laksmi Arasta P. 18021109
Ni Putu Sunariningsih 18021110
DOSEN :
DENPASAR
2020
DAFTAR ISI
Cover
Daftar isi……………………………………………………………………..…..…….. i
Kata Pengantar………………………………………………………………………… ii
BAB I PENDAHULUAN
Latar Belakang…………………………………………………………………………...1
Rumusan Masalah………………………………………………………………………..1
Manfaat Pembahasan……………………………………………………………………. 2
BAB II PEMBAHASAN
Definisi Biotekologi……………………………………………………………………….3
Downstream process…………………..……………………………………………….….6
Kesimpulan……………………………………………………………………………….14
Saran………………………………………………………………………………………15
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
i
KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis panjatkan kepada Ida Sang Hyang Widi Wasa /Tuhan Yang
Maha Esa karena pada kesempatan kali ini makalah “Bioteknologi Sediaan Farmasi”
dapat dibuat dan diselesaikan tepat waktu. Atas dukungan yang diberikan dalam
penyusunan makalah ini, maka penulis mengucapkan terima kasih kepada :
1. Apt. I Gusti Ngurah Agung Windra W.P., S.Farm.,M.Sc.
Apt. Dewi Puspita Apsari, S.Farm, M.Farm.
Apt. Putu Yudhistira Budi Setiawan, S.Farm., M.Sc.
Apt. I Wayan Martadi Santika, S.Farm., M.Si.
selaku dosen pengampu mata kuliah “Bioteknologi Sediaan Farmasi”, yang
sudah memberikan bimbingan kepada penulis
2. Kepada keluarga , sahabat, serta teman-teman yang telah memberikan semangat
kepada penulis sehingga makalah ini dapat terselesaikan tepat waktu
Kami berharap semoga makalah ini dapat menambah pengetahuan dan
pengalaman untuk para pembaca. Penulis menyadari bahwa makalah ini jauh dari kata
sempurna. Oleh karena itu, saran dan kritik yang bersifat membangun sangat kami
harapkan dari pembaca agar dapat terciptanya makalah yang sempurna.
Penulis
ii
BAB I
PENDAHULUAN
1.1.Latar Belakang
Eritropoetin merupakan molekul glikoprotein yang terdiri dari 165 asam amino dan
4 gugus karbohidrat dengan berat molekul sekitar 34 k dalton. Mempunyai dua ikatan
disul-fida, ikatan pertama antara asam amino sistein 6 dengan asam amino sistein 161
sedangkan ikatan kedua adalah asam amino sistein 29 dengan asam amino sistein 33.
Sekitar 60% molekul eritropoetin terdiri dari protein sedangkan sisanya adalah karbohidrat.
(Lappin T, 2003)
Eritropoetin merupakan faktor pertumbuhan hematopoetik pertama yang dapat
dibuat, yaitu eritropoetin rekombinan (epoetin alfa). Bersama dengan kemajuan teknologi
DNA, eritropoetin rekombinan yang baru telah ditemukan yaituDarbepoetin-α (NESP).
Darbepoetin-α sedikit berbeda dengan eritropoetin aslinya. Darbepoetin-α memiliki berat
molekul 38,5 k dalton, 5 rantai ikatan dengan oligosakarida dibandingkan 3 rantai
oligosakarida pada eritropoetin aslinya, total karbohidrat 52% dibandingkan 40% pada
eritropoetin yang asli, mempunyai waktu paruh yang lebih panjang yaitu sekitar 48,8 jam
dibandingkan 12-48 jam pada pemberian secara subkutan. Sedangkan ikatan reseptor pada
tempat bekerja eritropoetin sama dengan eritropoetin asli. (Moritz KM, et al, 1997).
.Darbepoetin alfa juga merupakan analog EPO yang mengalami hiperglikosilasi
yang mengandung dua asam sialat tambahan yang mengandung rantai karbohidrat. Ini telah
dirancang untuk berisi lima situs glikosilasi terkait-N (Asn 24, 30, 38, 83, 88). Posisi
karbohidrat baru telah terbukti tidak mengganggu ikatan reseptor atau efek mengganggu
pada struktur protein.( Kasus, A, 2003 ).
Darbepoetin alfa saat ini tersedia dalam botol dosis tunggal 25-, 40-, 60-, 100-, dan
200-Hg. FDA menyetujui 2 formulasi, tetapi hanya formulasi albumin yang saat ini
tersedia di AS. Formulasi polisorbat akan datang (Robert Hunter, Urusan Medis Amgen,
komunikasi pribadi, 31 Januari 2002).
Leishmania tarentolae adalah parasit non-patogen dan telah dikembangkan sebagai
inang ekspresi eukariotik potensial untuk produksi biofarmasi rekombinan. L. tarentolae
kaya akan glikoprotein dan pola glikosilasinya mirip dengan mamalia yang mencakup
oligosakarida tipe kompleks.
1
1.2.Rumusan Masalah
1.2.1.Apakah yang dimaksud dengan sediaan biotekologi ?
1.2.2.Apakah yang dimaksud dengan darbepoetin alfa ?
1.2.3.Bagaiamana cara upstream process darbepoetin alfa ?
1.2.4.Bagaiamana downstream process darbepoetin alfa ?
1.2.5.Bagaiamana cara Analisis kemurnian protein darbepoetin alfa ?
1.3.Manfaat Pembahasan
1.3.1. Mahasiswa mampu mengetahui definisi dari sediaan bioteknologi
1.3.2. Mahasiswa mampu mengetahui defines dari produk darbepoetin alfa
1.3.3. Mahasiswa mampu mengetahui prosess upstream darbepoetin alfa
1.3.4. Mahasiswa mampu memahami proses downstream darbepoetin alfa
1.3.5. Mahasiswa mampu mengetahui cara analisis protein darbepoetin alfa
2
BAB II
PEMBAHASAN
3
1.3. Penjelasan Upstream Process Darbepoetin Alfa
1.3.1. Host
Leishmania tarentolae adalah parasit non-patogen dan telah
dikembangkan sebagai inang ekspresi eukariotik potensial untuk produksi
biofarmasi rekombinan. L. tarentolae kaya akan glikoprotein dan pola
glikosilasinya mirip dengan mamalia yang mencakup oligosakarida tipe
kompleks. L. tarentolae memiliki kebutuhan nutrisi yang sederhana,
kemampuan untuk produksi skala besar, laju pertumbuhan yang tinggi, dan
keamanan bagi manusia. Fitur ini membuat L. tarentolae menarik sebagai
alternatif sel mamalia untuk produksi protein rekombinan. (Fritsche, C., et
al.,2007).
1.3.2. Sumber Gen
4
menjadi 58%. Analisis ekspresi mengkonfirmasi adanya pita protein pada
40 kDa. ( Basile, G., & Peticca, M.,2009).
1.3.4. Ekpresi Gen
Analisis ekspresi menunjukkan adanya pita protein pada 40 kDa, dan
tingkat ekspresi 51,2 mg / ml media kultur. Darbepoetin alfa memiliki 5
isoform dengan derajat sialilasi yang bervariasi.Untuk ekspresi sekretori,
transfected L. tarentolae sel tumbuh dalam media BHI dilengkapi dengan
hemin, penisilin, streptomisin, bleomisin, dan NTC pada suhu 26 oC sebagai
budaya suspensi statis. Transkripsi yang digerakkan T7 diinduksi dengan
10 μg / ml tetrasiklin selama 72 jam setelah inokulasi. Induksi juga dipantau
dengan pengukuran fluoresensi pada 590 nm (eksitasi) dan 620 nm (emisi)
Untuk memurnikan protein rekombinan, supernatan pekat L. tarentolae
kultur diaplikasikan pada kolom afinitas Ni-NTA (Qiagen, Jerman) sesuai
dengan instruksi pabrik. Kolom dicuci dengan tiga volume kolom dari 50
mM penyangga Tris-HCl (pH 7.0) yang mengandung 50 mM imidazol, dan
kemudian, darbepoetin alfa dielusi dengan penyangga elusi (50 mM Tris-
HCl, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA , 500 mM imidazol, pH 7,0).( Basile, G.,
& Peticca, M.,2009)
1.3.5. Proses Fermentasi
Elektroforesis SDS-PAGE dalam kondisi reduksi dan non-reduksi
dilakukan dalam gel 12%, diikuti dengan pewarnaan dengan Coomassie
brilyan Blue R-250 . Rekombinan L. tarentolae sel dipanen dari kultur sel 3
hari dengan sentrifugasi pada 3500 rpm selama 20 menit dan supernatan dari
kultur sel dihilangkan dan dipekatkan. Sampel yang diendapkan dilarutkan
dalam buffer sampel SDS-PAGE 1X dan kemudian dididihkan selama 5
menit. Sampel dari tipe liar dan transgenik L. tarentolae dipisahkan pada gel
SDS-PAGE 12% (w/v). Untuk Western blot, protein yang telah diselesaikan
dipindahkan ke membran PVDF menggunakan sistem blotting basah dan
diinkubasi dengan larutan TBST yang mengandung 3% bovine serum
albumin (BSA) selama semalam pada suhu 4 oC. Membran dicuci tiga kali
dengan TBST dan direaksikan dengan Antibodi EPO sebagai antibodi
pertama selama 2 jam pada suhu kamar. Setelah tiga kali pencucian,
diinkubasi selama 1 jam pada suhu kamar. Pita protein target dideteksi
menggunakan mode: pemfokusan awal pada tegangan 800 V, arus listrik 30
5
mA, dan daya 25 W selama 45 menit; memasukkan protein ke dalam gel
pada 600 V, 30 mA, dan 25 W selama 45 menit; dan pemisahan protein pada
1600 V, 30 mA, dan 25 W selama 60 menit. Setelah protein dipisahkan, gel
ditempatkan dalam larutan fiksasi yang mengandung asam trikloroasetat 0,7
M dan asam sulfosalisilat 0,16 M dan diinkubasi selama 40 menit pada suhu
kamar. Kemudian gel dicuci dalam larutan yang mengandung asam asetat
8% dan etanol 25% dan dilakukan pewarnaan seperti dijelaskan di atas.
(Sambrook, J., Fritsch, EF, & Maniatis, T., 1994)
6
kolom dari 50 mM penyangga Tris-HCl (pH 7.0) yang mengandung 50 mM
imidazol, dan kemudian, darbepoetin alfa dielusi dengan penyangga elusi
(50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA , 500 mM imidazol, pH
7,0). (Davoudi, N.,2011)
7
protein ekspresi pada sel mamalia, modifikasi pola glikosilasi, dan teknologi
transfeksi melalui plasmid dan retrovirus, diharapkan dapat diperoleh rhEPO
yang fungsional dalam waktu yang rekatif cepat dan memiliki waktu
paruh/aktivitas biologis yang lebih tinggi dibandingkan dengan native hEPO.
(Egrie dkk. 2001; Byrne dkk. 2007).
1.5.Analisis Kemurnian Protein
Untuk analisis lebih lanjut, IEF digunakan untuk estimasi profil glikosilasi
protein rekombinan. Menurut hasil IEF, darbepoetin alfa terdiri dari 5 isoform,
sedangkan Aranesp terdiri dari 10 isoform. Angka 5 menunjukkan spektrum UV-Vis
darbepoetin alfa dan Aranesp. Seperti yang dapat ditemukan, tidak ada perbedaan
mencolok dalam spektrum UV-Vis dari protein ini. Hasil ini terutama menunjukkan
bahwa darbepoetin alfa memiliki kemiripan struktural dengan Aranesp. CD adalah alat
yang ampuh untuk analisis struktur sekunder dan konformasi. Spektrum CD di daerah
UV jauh (190-260 nm) berhubungan dengan alpha helix dan beta sheet content dari
protein. Angka 6 menunjukkan spektrum CD darbepoetin alfa dan Aranesp. Seperti
yang diamati, protein yang dihasilkan dalam L. tarentolae memiliki spektrum CD yang
mirip dengan Aranesp. Data ini menunjukkan bahwa struktur sekunder darbepoetin alfa
tidak berubah. (Markham, A., & Bryson, HM, 1995.
8
BAB III
PENUTUP
3.1. Kesimpulan
3.2. Saran
Diharapkan kepada pembaca atau penulis agar makalah ini dapat menjadi
salah satu sumber informasi tentang Ilmu pengetahuan mengenai faktor
pertumbuhan EPO ( Erithropoetin ) DNA rekombinan yang mampu menghasilkan
obat anemia salah satunya ialah Darbepoetin alfa.
9
DAFTAR PUSTAKA
Amgen, Inc. 2001. Aranesp physician package insert. Thousand Oaks, Calif: Amgen
Basile, G., & Peticca, M. 2009. Ekspresi protein rekombinan dalam Leishmania tarentolae.
Bioteknologi Molekuler, 43,273–278.
Davoudi, N., Hemmati, A., Khodayari, Z., Adeli, A., & Hemayatkar, M. 2011. Kloning dan
ekspresi IFN- manusia c di Leishmania tarentolae. Jurnal Dunia
Mikrobiologi dan Bioteknologi, 27, 1893–1899
Egrie, JC, & Browne, JK (2007). Pengembangan dan karakterisasi protein tarentolae: review.
perangsang eritropoiesis baru (NESP). Metode Biologi Molekuler, 824,
307–315.
Egrie, J., & Browne, J. (2002). Darbepoetin alfa lebih kuat secara in vivo dan rekombinan
dalam a Leishmania tarentolae dapat diberikan lebih jarang daripada
rHuEPO. sistem ekspresi. Ekspresi dan Pemurnian Protein. 68, British
Journal of Cancer, 87, 476–477
Fritsche, C., Sitz, M., Weiland, N., Breitling, R., & Pohl, HD. 2007. Karakterisasi perilaku
pertumbuhan Leishmania tarentolae: sistem ekspresi baru untuk protein
rekombinan. Jurnal Mikrobiologi Dasar, 45, 384–39.
Kasus, A. 2003. Darbepoetin alfa: protein perangsang eritropoiesis baru. Drugs Today, 39,
477–495.
Lappin T. 2003. The cellular biology of erythropoietin receptors. The Oncologist ;8:15-8
Moritz KM, Lim GB, Wintour EM. 1997. Developmentalregulation of erythropoietin and
erythropoiesis. Am JPhysiol ;273:1829-44.
Markham, A., & Bryson, HM (1995). Epoetin alfa: tinjauan sifat farmakodinamik platform
untuk penelitian dan produksi protein. Ekspresi Protein dan Pemurnian, 25,
209–218
Sambrook, J., Fritsch, EF, & Maniatis, T. 1994. Molekuler Kloning: manual laboratorium (
Edisi ke-2, hlm. 1847–1857). Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor
Laboratory tekan.