104 4 Bioteknologi dan Kedokteran

Manusia Tikus / tikus

Telomer pendek Telomer panjang

Telomerase mati Telomerase aktif

tidak memadai sesuai

Telomer
Penangkapan pos pemeriksaan
memendekkan
kondisi pertumbuhan lingkungan Hidup

pRb / p16INK4a p19 ARF / p53 / p16 INK4a

inaktivasi inaktivasi

Penangkapan pos pemeriksaan

(penuaan)

Telomer p53
memendekkan mutasi

Kromosom Kontinu
Telomerase (biasanya)
fusi akhir pertumbuhan

dan apoptosis dalam budaya

Jalur ALT (jarang9
(krisis) (abadi)

Gambar 4.2. Lama dan pendeknya penuaan. Sebagian besar sel hewan pengerat mengandung enzim telomerase dan memiliki telomer yang panjang. Di

bawah kondisi kultur jaringan yang sesuai, sel hewan pengerat mampu tumbuh terus menerus

(1,2,8). Namun, lingkungan kultur yang tidak memadai (misalnya, di mana faktor kelangsungan hidup yang tepat hilang atau di mana jenis sel
yang berbeda tidak dapat berinteraksi) dapat mengakibatkan kerusakan DNA atau tekanan lain yang menyebabkan tertahannya pembelahan
sel di pos pemeriksaan siklus sel. Inaktivasi spontan p19 ARF, p53, dan mungkin p16 INK4a Dalam kondisi kultur standar seringkali sel tikus yang
normal dapat tumbuh terus menerus. Fibroblas manusia memiliki telomer pendek dan merupakan telomerase satiny. Seperti halnya dengan sel
hewan pengerat, kondisi kultur yang tidak memadai dapat menyebabkan sel manusia mengaktifkan jalur pos pemeriksaan yang mengarah
pada penghentian pertumbuhan awal (dan tidak bergantung telomer) (9, 10). Berbeda dengan sel hewan pengerat, bypass p53 dan / atau pRb /
p16 INK4a pos pemeriksaan tidak cukup untuk mengabadikan fibroblas manusia tetapi memperpanjang umurnya. Pemendekan telomer terus
menerus dari fibroblas manusia menyebabkan fusi kromosom, krisis, dan apoptosis. Hanya sel manusia yang langka (1 dari 10 juta) yang dapat
melewati krisis baik melalui reaktivasi telomerase atau melalui ALT (jalur alternatif langka untuk pemanjangan telomer). Meskipun metode untuk
menghitung jumlah pembelahan sel tidak membatasi pertumbuhan sel hewan pengerat, pemendekan telomer dalam sel manusia memberikan
catatan jumlah penggandaan dan mengontrol penuaan replikatif [Referensi dalam 510].
 4.6 Sifat Kompleks 105

telah mengalami. [ 510] Perbedaan antara penuaan sel pada manusia dan hewan pengerat digambarkan pada Gambar 4.2.

Telomer memainkan peran penting dalam kelangsungan hidup sel. Gangguan eksperimental tindakan telomerase
menyebabkan pemendekan telomer dan penuaan seluler [ 525] dan cacat genetik telomerase memiliki dampak yang
signifikan. Bentuk X-linked dari human disease dyskeratosis congenita (DKC) disebabkan oleh mutasi pada gen yang
mengkode diskerin dan menyebabkan cacat pada jaringan regeneratif seperti kulit dan sumsum tulang, ketidakstabilan
kromosom, dan kecenderungan menuju keganasan tertentu. Diskerin dikaitkan dengan RNA telomerase manusia yang
mengandung motif H / ACARNA dan mutasi menyebabkan pemeliharaan telomer rusak. [ 526]

Di Elegans Caenorhabditis, jalur pensinyalan mirip insulin mengontrol penuaan, metabolisme, dan
perkembangan. Mutasi di daf-2 gen seperti reseptor insulin atau bagian hilir
usia-1 phosphoinositide 3-kinase memperpanjang usia dewasa dua sampai tiga kali lipat. Untuk mengidentifikasi
regulasi penuaan dan metabolisme dengan jalur ini, daf-2 jalur pensinyalan dikembalikan ke hanya neuron, otot,
atau usus. Insulin seperti pensinyalan di neuron saja sudah cukup untuk menentukan rentang hidup tipe liar,
sedangkan pemulihan sinyal otot atau usus tidak cukup untuk melakukannya. Pemulihan file daf-2 jalur
pensinyalan di otot menyelamatkan cacat metabolik, menunjukkan decoupling rentang hidup dan metabolisme.
Sistem saraf tampaknya menjadi pusat pengatur umur panjang C. elegans. [ 511] Studi tentang penuaan dan
regulasi genetik perkembangan di C. elegans didukung oleh ketersediaan data genom-lebar pada profil ekspresi
gen. [ 588]

Penelitian untuk gen yang terlibat dalam penuaan dilakukan pada organisme yang dapat diatur secara genetik
seperti ragi, nematoda Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster lalat buah, dan tikus telah menetapkan
bahwa penuaan diatur oleh gen tertentu. Jalur terkait menghubungkan fisiologi, transmisi sinyal, dan regulasi gen.
Mutasi diidentifikasi dan korelasi fenotipe menunjukkan bahwa gen ini mengendalikan penuaan pada organisme
yang lebih tinggi. [ 522]

Mutasi dalam Caenorhabditis elegans mempengaruhi silia sensorik atau sel pendukungnya, atau dalam transduksi
sinyal sensorik, memperpanjang umur. C. elegans merasakan sinyal lingkungan melalui neuron sensorik bersilia yang
terletak terutama di organ sensorik tertentu di kepala dan ekor. Silia adalah struktur berbasis mikrotubulus yang terikat
membran yang ditemukan di ujung dendritik neuron sensorik di C. elegans. Temuan dari peningkatan umur mutan
dengan cacat pada silia sensorik menyiratkan bahwa umur dapat diatur oleh sinyal lingkungan. [ 512]

Studi biokimia dan genetik berumur panjang Caenorhabditis CLK-1 mutan menunjukkan bahwa mutan ini
adalah Q auksotrof. CLK-1 adalah polipeptida mitokondria dengan sekuens dan konservasi fungsional dari
manusia ke ragi. Itu Saccharomyces cerevisiae
homolog Coq7p sangat penting untuk sintesis ubikuinon dan juga respirasi. Pengembangan clk-1 mutan
membutuhkan sumber makanan dari Koenzim Q. [ 527]

Pada jamur berserabut Podospora anserina kerusakan nuklir COX5

gen pengkode subunit V dari sitokrom c oksidase kompleks mengarah pada penggunaan jalur pernapasan
alternatif dan penurunan produksi spesies ion reaktif dengan peningkatan bersamaan dalam umur terkait
dengan stabilisasi genom mitokondria. Ini memberikan bukti untuk hubungan sebab akibat antara metabolisme
mitokondria dan umur panjang Podospora anserina. [ 518]
106 4 Bioteknologi dan Kedokteran

Tabel 4.3. Mutasi mengungkapkan hubungan antara umur panjang dan ketahanan stres pada organisme multisel [referensi dalam 520].

Jenis/ Deskripsi gen Pengaruh fenotipe *

mutasi Masa hidup † Resistensi stres

C. elegans

usia-1 Homolog Pl (3) K manusia 65% meningkat Ditingkatkan (UV, paraquat,

panas)

daf-2 Reseptor insulin manusia 100% meningkat Ditingkatkan (UV, paraquat,

homolog panas)

daf-16 Faktor transkripsi dahi Menekan umur panjang Menekan ketahanan stres
diberikan oleh usia-1 dan dari usia-1 dan daf-2 mutan

daf-2 mutasi

clk-1 Homolog gen ragi terkait dengan 40% meningkat Ditingkatkan meningkat (UVC)

biosintesis koenzim Q.

spe-10 Tidak diketahui (sperma rusak 40% meningkat Ditingkatkan (UV, paraquat,
tapi tidak panas)

spe-26 Tidak diketahui (sperma rusak) 65% meningkat Ditingkatkan (UV, paraquat,
panas)

lama-1 Tirosin reseptor putatif 65% meningkat Ditingkatkan (UV, panas)

kinase

ctl-1 Katalase sitostatik 25% penurunan; sup- Tidak ditentukan

menekan umur panjang

diberikan oleh daf-2,

usia-1 dan clk-1

mev-1 Sitokrom b subunit dari 37% menurun Hipersensitif terhadap oksigen

suksinat dehidrogenase

Drosophila

bln Putative G-protein-coupled 35% meningkat Ditingkatkan (UV, paraquat,

reseptor panas)

Mouse

shc 66 Sinyal sitoplasma- 30% meningkat Ditingkatkan (UV, H. 2 HAI 2)

protein adaptor transduksi

• Lihat [ref. 83] untuk referensi asli yang menjelaskan fenotipe dari daf-2, daf-16, clk-1 dan spe26 mutan. Referensi mutan
lainnya adalah sebagai berikut: usia-1 [ refs 49,50,83]; spe-10 [ ref. 84];
lama-1

• [ref. 85]; ctl-1 [ ref. 56]; mev-1 [ ref. 55]; bln [ ref. 60]; dan shc 66 [ ref. 6].
†
Angka mencerminkan perubahan rata-rata masa hidup mutan relatif terhadap hewan tipe liar.
 4.6 Sifat Kompleks 107

Studi luas agenome tentang penuaan dan respons stres oksidatif di Drosophilamelanogaster
melibatkan pengukuran perubahan seluruh genom pada tingkat transkrip sebagai fungsi usia dibandingkan dengan efek
molekul generator radikal bebas yang mengungkapkan respons yang signifikan dalam sejumlah gen. Radikal bebas
tampaknya memainkan peran penting dalam mengatur tingkat transkrip selain faktor lainnya. Studi tersebut
mengidentifikasi beberapa kandidat gen sebagai penanda molekuler untuk penuaan dan target potensial untuk intervensi
biofarmasi dalam proses penuaan. [ 514]

Studi genetik lain di Drosophilamelanogaster menemukan bahwa lima mutasi penyisipan elemen P independen
dalam satu gen menghasilkan hampir dua kali lipat dari rata-rata umur orang dewasa tanpa penurunan kesuburan atau
aktivitas fisik. Produk dari gen yang bersangkutan Indy Berkaitan erat dengan kotransporter natrium dikarboksilat
mamalia, suatu membran protein yang mengangkut perantara siklus Krebs. Eksisi elemen P menyebabkan
pengembalian ke umur normal. Mutasi pada gen ini mungkin meniru keadaan metabolisme dari pembatasan kalori,
yang diketahui dapat memperpanjang umur. [ 515]

Kemampuan untuk menanggapi stres oksidatif merupakan penentu penting dari masa hidup. Produksi oksidan dan
pembersihan spesies oksidan reaktif melibatkan strategi seluler untuk mendeteksi dan detoksifikasi spesies oksigen
reaktif dan terkait dengan umur panjang. [ 520] Tabel 4.3 mencantumkan mutasi yang terkait dengan ketahanan stres pada
organisme multisel dan Tabel 4.4 menunjukkan sistem penyakit yang terkait dengan stres oksidan.

Tabel 4.4. Oksidan, antioksidan dan penyakit penuaan [referensi dalam 520].

Sistem Penyakit Studi laboratorium / hewan Data klinis

Kardiovaskular Memiliki pembuluh darah pra-aterosklerotik PHSI: tidak ada manfaat keseluruhan dari beta-

peningkatan level ROS. karoten pada CVD? Manfaat dalam risiko tinggi

Vitamin E melindungi terhadap perkembangan- subkelompok.

penyakit aterosklerosis Jejak CHAOS: vitamin E mengurangi tingkat

Gangguan SOD menyebabkan gagal jantung- infark miokard nonfatal.
melindungi ure dan ekspresi berlebih Studi ATBC: tidak ada manfaat keseluruhan pada

melawan cedera. Tingkat CVD dengan Vitamin E atau betacarotene?

Peningkatan kematian akibat CVD dengan beta-karoten.

Dokter mata Keturunan tikus hamil yang kekurangan glutathione
mengembangkan katarak. Pigmen retinal
menghasilkan ROS setelah paparan cahaya.
Degenerasi retina pada primata dengan
defisiensi Vitamin A atau E.
PHSI: penurunan katarak dan degenerasi makula
yang tidak signifikan dengan Vitamin E dan
multivitamin.
NHS: asupan karotenoid dapat menurunkan risiko
katarak.

Neurologis Mutasi pada SOD1 menghasilkan ALS manusia dan Vitamin E tidak melindungi pada awal penyakit
model hewan transgenik yang diselamatkan oleh Parkinson.
antioksidan. Vitamin E bermanfaat untuk penyakit Alzheimer.
Stimulasi reseptor NMDA menghasilkan
superoksida. N- asetilsistein tidak mempengaruhi kelangsungan hidup

Cacat fungsi kompleks 1 terlihat pada pada ALS.

penyakit Parkinson.
108 4 Bioteknologi dan Kedokteran

Ekspresi gen yang berubah pada sel muda dan tua dikatalogkan dengan menggunakan tampilan diferensial yang
disempurnakan [ 517] dan susunan oligonukleotida densitas tinggi digunakan untuk memeriksa perbedaan ekspresi gen di
hipotalamus dan korteks tikus muda dan tua. [ 187]

Hypthalamus memainkan peran kunci dalam mengatur metabolisme dan modulasi hipotalamus dapat mempengaruhi
proses penuaan. Tabel 4.5 menunjukkan berbagai perubahan ekspresi gen pada hyopthalamus dari mencit muda dan
tua, sedangkan Tabel 4.6 mencantumkan perubahan ekspresi gen di korteks.

Genom eukariotik dikemas menjadi nukleosom, yang dianggap menekan ekspresi gen secara umum.
Represi terutama terlihat pada telomer ragi, di mana gen dalam heterokromatin telomer tampak dibungkam
oleh kompleks Sir pengikat histon (Sir2, Sir3 dan Sir4) dan Rap1. Untuk menyelidiki bagaimana nukleosom
dan faktor peredam mempengaruhi ekspresi gen global, array dengan kepadatan tinggi digunakan untuk
mempelajari efek dari penipisan histon nukleosom dan faktor pembungkam dalam ragi. Pengurangan
kandungan nukleosom dengan menipisnya histon H4 menyebabkan peningkatan ekspresi 15% gen dan
penurunan ekspresi 10% gen, tetapi efeknya kecil pada ekspresi mayoritas (75%) gen ragi. Gen telomer
proksimal ditemukan terdepresi pada daerah yang memanjang 20 kb dari telomer, jauh melampaui batas
pengikatan protein Sir dan efek hilangnya fungsi Sir. Hasil ini menunjukkan bahwa histon memberikan
kontribusi Sir-independent untuk pembungkaman telomer, dan bahwa peran histon di tempat lain dalam
kromosom bersifat spesifik gen daripada secara umum represif. [ 205]

Pencetakan genom dicirikan oleh ekspresi spesifik alel dari beberapa gen dalam domain kromosom
besar yang menjalani replikasi DNA secara asinkron selama fase S. Dengan menggunakan analisis
FISH dan teknik fraksinasi fase-S, waktu replikasi diferensial terbukti terkait dengan gen yang tercetak
di berbagai jenis sel dan sudah ada dalam embrio pra-implantasi segera setelah pembuahan. Pola ini
dihapus.

Tabel 4.5. Perubahan ekspresi gen di hipotalamus dari tikus muda (2 bulan) dan tua (22 bulan) BALB / c [referensi di 187].

Nomor aksesi Nama Lipat kembalian

Enzim metabolik
W33716 NADH-Ubiquinone oksidoreduktase KFYI subunit NAOH 2.8
Y07708 oksidoreduktase subunit MWFE 3
AA109866 NADH-ubiquinone oxidoreductase chain 4L NADH-ubiquinone 2.1
AA219829 oxidoreductase SGDH subunit Cytochrome c oxidase subunit 2.5
AA521794 VIIb 2.2
AA672840 ATP sintase 0 subunit ATP 2.2
C76507 sintase µ-subunit 2.7
AA003458 Sarko / retikulum endoplasma Ca2 + -ATPase 2 Na / K-ATPase Sebuah - 2.9
X56007 2 - 11
AA106307 H + ATPase subunit E - 6.1
AA087605 H (+) - ATPase (mvp) - 6.9
 4.6 Sifat Kompleks 109

Tabel 4.5. Perubahan ekspresi gen di hipotalamus dari mencit BALB / c muda (2 bulan) dan tua (22 bulan) (Lanjutan).

Nomor aksesi Nama Lipat kembalian

Pengolahan protein
U05333 Kofaktor Cochaperonin ' SEBUAH ' 6.8
U09659 Pendamping mitokondria 10 2.6
Z31557 Chaperonir berisi TCP-1 3.2
AA027544 Enzim pengaktif Ubiquitin E1 2.8
AA146437 Prekursor Cathepsin S, proteinase yang menyortir sistein seperti 3.4
Z31297 protein nexin 2, degradasi protein 4.8
AA013993 Prolyl olig-peptidase, 11
AA020512 Caspase 6 3

Pertumbuhan / struktur saraf

U95116 Protein Lissencephaly-1 (LIS-1) 3
V00835 Metallothionein-I 3.3
X61452 Protein 2b terkait kontrol pembelahan sel 2.8
AA709861 Protein seperti aktin AX 3.5
L31397 Dynamin - 3.5
U27106 AP-2 terkait Clathrin - 5.7
U86090 Rantai berat Kinesin - 2.4

Pensinyalan neuronal

AA271109 Protein fosfatase 1, subunit pengatur 3.8

X15373 lnositoi-1,4,5-reseptor trifosfat 3.5
X51468 Gen preprosomatostatin 3
D37792 Synaptotagmin 1 - 17
D50621 PSD-95 / SAP90A - 16
AA048604 Apolipoprotein E - 6.7
AA068956 Protein fosfatase PP2A - 6.1
W12204 Ca2 + / protein kinase II yang bergantung pada kalmodulin - 3.6
X61434 protein kinase C yang bergantung pada cAMP Sebuah - 3.1
X57497 Reseptor glutarnate 1 - 2.7
AA710375 N- reseptor faktor lampiran yang sensitif terhadap ethylmaleimide - 3.4
A8006361 Prostaglandin D sintetase - 5.6

Respon stress
M60798 Cu (2 +) - Zn2 + superoksida dismutase 2.9
AA107471 Homolog DNAJ 2 - 6.4
AA166139 Protein perbaikan DNA - 10.4
AA033408 Protein pengikat DNA khusus kerusakan, perbaikan DNA Hif seperti - 4.6
D89787 protein - 6.5
U27830 Protein penyebab stres, STI1 - 4.9

Setiap sampel RNA dihibridisasi dua kali menjadi dua array yang berbeda, dan nilai perubahan lipatan adalah rata-rata dari pengukuran
duplikat. Nilai positif menunjukkan peningkatan, dan nilai negatif menunjukkan penurunan ekspresi gen. Gen yang dicetak tebal
diekspresikan secara berbeda di korteks tua dan hipotalamus.
110 4 Bioteknologi dan Kedokteran

Tabel 4.6. Perubahan ekspresi gen di korteks dari tikus muda (2 bulan) dan tua (22 bulan) BALB / c [referensi di 187].

Nomor aksesi Nama gen Lipat kembalian

Enzim metabolik
M21285 Desaturase Stearoyl-CoA 2.4
U27315 Adenin nukleotida translocase-1 2.2
M84145 Hidrolase fumarylacetoacetate 3.1
U13841 Subunit ATPase E - 4.4
AA105755 Na +, K + -ATPase α - 4.6
AA003458 Sarko / retikulum endoplasma Ca2 + -ATPase 2 Na / - 5.9
X56007 K-ATPase β β 2 subunit - 2.3
AA 106307 H (+) - Protein mirip ATPase E. 3.8
AA389346 Sintase sitrat - 3.4

Pengolahan protein

M13500 Gen Kallikrein 5.2

X61232 Karboksipeptidase H. 3.6
X92665 Ubiquitin-conjugating enzyrne UbcM3 3
AA013993 Prolyl oligopeptidase 2.7
AA020512 Caspase 6 2.2
Z30970 Penghambat jaringan metaloproteinase-3 2.1

Pertumbuhan / struktur saraf

U95116 Protein Lissencephaly-1 2.6
L20899 Siklus pembelahan sel (CDC25) protein 2.6
C76314 mirip Cdc5 2.4
AA590859 Protein seperti aktin AX 7.3
U27106 AP-2 terkait Clathrin - 5.5
AA1 18546 Protein mirip aktin 3 - 6.2
AA050703 Bek melawan kematian 1 (DAD1) rantai berat Dynein, - 2.4
w 18503 transportasi retrograde Dynactin 1, transportasi - 7.7
AA1 11631 aksonal retrograde Dynamin - 3.4
L31397 - 2.7

Pensinyalan neuronal
AA168959 25 kDa FK506-binding protein Subunit reseptor 2.7
L32372 AMPA FKBP25 (GluR-B) MDK1, reseptor tirosin 2.8
X79082 kinase 2
D37792 Synaptotagmin 1 - 13.2
M73490 Apolipoprotein E - 6.9
AA124955 Kasein kinase 1 α - 2.9
Z67745 Subunit katalitik fosfatase 2A - 6.2
M27073 Protein fosfatase 1 β - 2.7
J02626 protein kinase C yang bergantung pada cAMP β β - 4.6
W13835 N- homolog protein membran sensitif ethylmaleimide - 3.2
U10120 N- faktor sensitif ethytmaleimide - 10.3
A8006361 Prostaglandin D sintetase - 3.2
M27844 Calmodulin - 2.7
M63436 Reseptor GABA-A α- 1 subunit - 7.1
 4.6 Sifat Kompleks 111

Tabel 4.6. Perubahan ekspresi gen di korteks dari mencit BALB / c muda (2 bulan) dan tua (22 bulan) (Lanjutan).

Nomor aksesi Nama gen Lipat kembalian

Respon stress
AA105022 Protein heat-shock protein mirip-hsp84 HSP4O / - 2.7
AA204094 DNAJ homolog - 2.9

Setiap sampel RNA dihibridisasi dua kali menjadi dua array yang berbeda, dan nilai perubahan lipatan adalah rata-rata dari pengukuran duplikat.
Gen yang dicetak tebal diekspresikan secara berbeda di korteks tua dan hipotalamus.

Referensi yang dikutip di atas harus dilihat hanya sebagai contoh representatif yang berasal dari literatur tubuh yang jauh
lebih besar dan relevan, yang tidak sepenuhnya disajikan.
Akronim dan singkatan: PHSI, Physician's Health Study I; CHAOS, Studi Cambridge HeartAntioxidant;
ATBC, Alpha-Tocopherol, Beta-CaroteneCancer Prevention Study; NHS, Studi Kesehatan Perawat; CVD,
penyakit kardiovaskular; ALS, sklerosis lateral amiotrofik; NMDA, N- reseptor glutamat metil-D-aspartat.

Sebelum meiosis di germline, dan waktu replikasi khusus induk kemudian diatur ulang pada gametogenesis
akhir pada jantan dan betina. Waktu replikasi asinkron ditetapkan dalam gamet dan dipertahankan selama
pengembangan, menunjukkan bahwa itu dapat berfungsi sebagai penanda epigenetik utama untuk
membedakan antara garis induk. [ 206]

Mekanisme penuaan yang penting terkait dengan penekan tumor dan regulasi antara penekan yang
berbeda dan sinyal pengatur. Penekan tumor p53 menginduksi penuaan seluler sebagai respons
terhadap sinyal onkogenik. Aktivitas p53 dimodulasi oleh stabilitas protein dan modifikasi
pasca-translasi, termasuk fosforilasi dan asetilasi.

Mekanisme aktivasi p53 oleh onkogen sebagian besar masih belum diketahui. Dilaporkan bahwa PML
penekan tumor mengatur respons p53 terhadap sinyal onkogenik. Ras Onkogenik mengatur ekspresi PML dan
ekspresi PML yang berlebihan menyebabkan penuaan dengan cara yang bergantung pada p53. p53 diasetilasi di
lisin 382 pada ekspresi Ras, suatu peristiwa yang penting untuk fungsi biologisnya. Ras menginduksi pelokalan
ulang p53 dan CBP asetil-transferase di dalam badan inti PML dan menginduksi pembentukan kompleks
p53-PML-CBP trimerik. Asetilasi p53 yang diinduksi oleh ras, stabilisasi kompleks p5-CBP, dan penuaan hilang
pada PML - / - fibroblas. Data membentuk hubungan antara PML dan p53, dan menunjukkan bahwa integritas
badan PML diperlukan untuk asetilasi p53 dan penuaan pada ekspresi onkogen. [ 207]

Penerapan telomerase perlu dipelajari dengan potensi efek merusak dari pengenalan hTERT dalam
pikiran. Aktivasi telomerase memperpanjang umur kultur humanmammary epithelial cell (HMEC)
sementara pada saat yang sama mendorong ekspresi c- myc onkogen. [ 208] Relevansi telomerase dalam
penuaan sangat diperdebatkan. [ 209]

Model yang dipelajari secara menyeluruh untuk penuaan di nematoda C. elegans. Studi tentang evolusi rentang hidup C.
elegans konsisten dengan beberapa gen yang bertindak awal. [ 210]

Aspek khusus, yaitu keabadian germline dan integritas telomer dipelajari. Garis benih adalah garis keturunan
sel abadi yang diteruskan tanpa batas dari satu generasi ke generasi
112 4 Bioteknologi dan Kedokteran

lanjut. Untuk mengidentifikasi gen yang dibutuhkan untuk keabadian germline, C. elegans mutan dengan germline
diisolasi - cacing yang dapat berkembang biak selama beberapa generasi yang sehat tetapi akhirnya menjadi steril.
Salah satu dari ini mortal germline (mrt) mutan, mrt-2,
menunjukkan pemendekan telomer progresif dan mengakumulasi fusi kromosom ujung ke ujung pada generasi
selanjutnya, menunjukkan bahwa protein MRT-2 diperlukan untuk replikasi telomer. Selain itu, germline dari mrt-2 hipersensitif
terhadap sinar-X dan aktivitas transposon. Karena itu, mrt-2 memiliki cacat dalam merespons DNA yang rusak dan
kerusakan merek ganda normal yang ada pada telomer. Mrt-2 mengkodekan homolog gen checkpoint yang diperlukan
untuk merasakan kerusakan DNA pada ragi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa telomer dapat diidentifikasi sebagai
jenis kerusakan DNA dan kemudian diperbaiki oleh enzim telomer replikasi telomerase. [ 211]

Potensi kloning sebagian bergantung pada apakah prosedur tersebut dapat membalikkan penuaan sel dan
memulihkan sel somatik ke keadaan fenotipik awet muda. Kelahiran enam anak sapi kloning sehat yang berasal
dari populasi sel somatik donor tua dilaporkan. Transfer nuklir memperpanjang umur replikasi sel-sel tua (nol
hingga empat penggandaan populasi tersisa) menjadi lebih dari 90 penggandaan populasi. Ekspresi DNA-1
komplementer tingkat penggandaan populasi awal (EPC-1, gen yang bergantung pada usia) dalam sel dari hewan
kloning adalah 3,5 hingga 5 kali lipat lebih tinggi daripada yang ada pada sel dari usia yang cocok (5 - 10 bulan)
kontrol. Analisis Southern blot dan flow cytometric menunjukkan bahwa telomere juga meluas melebihi bayi baru
lahir (kurang dari 2 minggu) dan hewan kontrol yang ditandingkan. Kemampuan untuk meregenerasi hewan dan sel
mungkin memiliki implikasi penting untuk pengobatan dan studi tentang penuaan mamalia. [ 212]

Tikus telah diklon dengan transfer inti ke dalam oosit yang dienukleasi. Secara khusus, telah dilaporkan
kloning berulang tikus menjadi empat dan enam generasi dalam dua galur independen. Generasi berturut-turut
tidak menunjukkan tanda-tanda penuaan dini, seperti yang dinilai dari parameter perilaku kasar dan tidak ada
bukti pemendekan telomer di ujung kromosom, biasanya merupakan indikator penuaan seluler. Telomer
sebenarnya sedikit bertambah panjang. Peningkatan ini mencengangkan, karena jumlah divisi mitosis jauh
melebihi hewan yang diproduksi secara seksual dan efek kloning yang merusak dapat diperkuat pada tikus
kloning secara berurutan. Pengamatan ini didasarkan pada studi tentang penuaan organisme. [ 213]

Telomerase dapat menerima intervensi terapeutik oleh efektor molekul kecil dan dengan demikian terapi yang sesuai
dapat dikembangkan. Telomerase, ribonukleoprotein yang diatur di berbagai jenis kanker, memiliki templat RNA yang
diperlukan untuk mengikat dan memperpanjang ujung telomer. Aksesibilitas intrinsik Telomerase ke asam nukleat yang
masuk membuat template RNA menjadi target ideal untuk penghambatan oleh oligonukleotida. 2 ′ - HAI- metil RNA (2 ′ - HAI- meRNA),
sebuah oligonukleotida yang diketahui memberikan efek spesifik urutan dalam kultur sel dan hewan, menghambat
telomerase dengan potensi yang lebih tinggi daripada yang dimiliki oleh asam nukleat peptida analog (PNA). Penghambatan
potensial relatif terhadap PNA cukup mengejutkan, karena afinitas pengikatan 2 ′ - HAI- meRNA untuk RNA komplementer
relatif rendah terhadap PNA analog. A 2 ′ - HAI-

meRNAoligomer dengan substitusi fosforothioate terminal menghambat urutan telomerase secara selektif dalam sel DU145
yang diturunkan dari tumor manusia ketika dikirim dengan lipid kationik. Berbeda dengan kemampuan 2 ′ - HAI- oligomer
meRNA untuk menghambat telomerase, pengikatan a 2 ′ - HAI- meRNA menjadi pengulangan terbalik dalam DNA plasmid
tidak dapat dideteksi, sedangkan
 4.6 Sifat Kompleks 113

pengambilan PNA efisien, menunjukkan bahwa aksesibilitas relatif dari templat RNA telomerase penting untuk
penghambatan oleh 2 ′ - HAI- meRNA. Penghambatan telomerase oleh 2 ′ - HAI- meRNA akan memfasilitasi penyelidikan
hubungan antara aktivitas telomerase dan proliferasi sel yang berkelanjutan, dan dapat memberikan dasar untuk
pengembangan agen kemopreventif dan kemoterapi. [ 214]

Pentingnya telomere digarisbawahi oleh studi tentang penataan ulang kromosom dan telomere.
Mekanisme penataan ulang kromosom terkait erat dengan perkembangan kanker, dan dianggap
menghasilkan banyak keuntungan dan kerugian segmen kromosom yang diperlukan untuk
karsinogenesis epitel. Manusia lanjut usia mempertahankan tingkat tinggi kanker epitel seperti
karsinoma payudara dan usus besar, sedangkan tikus yang membawa mutasi gen penekan tumor
biasanya mengembangkan karsinoma jaringan lunak dan limfoma. Di antara banyak faktor yang
mungkin berkontribusi pada keragaman spesies ini adalah perbedaan panjang dan regulasi telomer.
Telomer terdiri dari kompleks nukleoprotein yang menutupi ujung kromosom eukariotik dan
dipertahankan oleh reverse transcriptase, telomerase. Di sel manusia, in vivo. Sebaliknya, pengurangan
kritis dalam panjang telomer tidak diamati pada mouse karena ekspresi telomerase promiscuous dan
telomer panjang. Atrisi telomer pada tikus mutan yang kekurangan telomerase p53 mendorong
perkembangan kanker epitel melalui proses kerusakan jembatan fusi yang mengarah pada
pembentukan translokasi non-timbal balik kompleks - fitur sitogenetik klasik karsinoma manusia.
Disfungsi telomer yang disebabkan oleh pembaruan epitel yang terus menerus selama hidup dapat
menghasilkan perubahan ploidi masif yang terkait dengan perkembangan kanker epitel. [ 215]

Masa hidup juga dipengaruhi oleh faktor eksternal, seperti ROS yang terutama muncul sebagai produk
sampingan dari aktivitas metabolisme normal dan diduga mempengaruhi etiologi penyakit terkait usia. Untuk
menguji teori bahwa ROS menyebabkan penuaan, sistem antioksidan alami C. elegans dengan mimetik superoksida
dismutase / katalase sintetik kecil. Pengobatan cacing tipe liar meningkatkan rata-rata masa hidup mereka rata-rata
44%, dan pengobatan cacing yang menua secara prematur menghasilkan normalisasi masa hidup mereka
(peningkatan 67%). Tampaknya stres oksidatif adalah penentu utama masa hidup dan dapat diatasi dengan
intervensi farmakologis. [ 216]

Profil ekspresi memungkinkan identifikasi simultan dari gen yang diekspresikan secara berbeda, dan dengan
membandingkan berbagai sel, jaringan, status penyakit, dan status metabolik memungkinkan penunjukan tepat dari ekspresi
gen yang terkait dengan kondisi dan / atau penyebab. Dalam terapi tumor, identifikasi jenis tumor dan susunan genetik dari
sel-sel ganas memungkinkan pilihan terapi yang dini dan seringkali menentukan.

Limfoma sel B besar difus (DLBCL), subtipe limfoma non-Hodgkin yang paling umum, secara klinis
heterogen: 40% pasien merespons dengan baik terhadap terapi saat ini dan memiliki kelangsungan hidup
yang lama, sedangkan sisanya menyerah pada penyakit. Variabilitas dalam sejarah alam ini mungkin
mencerminkan heterogenitas molekuler yang tidak dikenali pada tumor. Dengan menggunakan
DNAmicroarrays, karakterisasi sistematis ekspresi gen pada keganasan sel B. Tampak bahwa terdapat
keragaman ekspresi gen di antara tumor pasien DLBCL, yang tampaknya mencerminkan variasi laju proliferasi
tumor, respon inang, dan status diferensiasi tumor. Dua bentuk molekul yang berbeda
114 4 Bioteknologi dan Kedokteran

DLBCL diidentifikasi yang memiliki pola ekspresi gen yang menunjukkan berbagai tahap diferensiasi sel B. Satu jenis
gen mengekspresikan karakteristik sel B pusat germinal ('pusat germinal B-like DLBCL'); jenis kedua gen yang
diekspresikan biasanya diinduksi selama in vitro aktivasi sel B darah tepi ('B-like DLBCL teraktivasi'). Pasien dengan
DLBCL mirip-B pusat germinal memiliki kelangsungan hidup keseluruhan yang jauh lebih baik daripada mereka
dengan DLBCL mirip-B yang diaktifkan. Klasifikasi molekuler tumor berdasarkan ekspresi gen dapat mengidentifikasi
subtipe kanker yang sebelumnya tidak terdeteksi dan signifikan secara klinis.

cer. [ 217]
Demikian pula, teknik profil ekspresi gen diterapkan pada jenis tumor lain yang sulit dikategorikan,
melanoma maligna. Kanker manusia yang paling umum adalah neoplasma ganas pada kulit. Insiden
melanoma kulit meningkat sangat tajam, dengan kemajuan minimal dalam pengobatan penyakit lanjut
non-bedah. Meskipun upaya yang signifikan untuk mengidentifikasi prediktor independen dari hasil
melanoma, tidak ada penanda histopatologi, molekuler atau imunohistokimia yang diterima yang
mendefinisikan subset dari neoplasma ini. Dengan demikian, meskipun melanoma dianggap
menghadirkan bentuk 'taksonomi' yang berbeda, ini dianggap sebagai bagian dari spektrum daripada
entitas yang terpisah. Penemuan subset melanoma yang diidentifikasi dengan analisis matematis
ekspresi gen dalam serangkaian sampel telah dilaporkan. in vivo, fitur dari beberapa melanoma
metastasis yang sangat agresif. Analisis transkrip global dapat mengidentifikasi subtipe yang tidak dikenal
dari melanoma coetaneous dan memprediksi karakteristik fenotipik yang dapat diverifikasi secara
eksperimental yang mungkin penting untuk perkembangan penyakit dan pilihan pengobatan. [ 218]

Untuk mendapatkan pemahaman tentang dasar molekuler dari tumor angiogenesis, pola ekspresi gen
dibandingkan dari sel endotel yang berasal dari pembuluh darah jaringan kolorektal normal dan ganas. Dari lebih 170
transkrip yang sebagian besar diekspresikan di endotelium, 79 diekspresikan secara berbeda, termasuk 46 yang
secara khusus meningkat pada endotel terkait tumor. Beberapa dari gen ini menyandikan protein matriks
ekstraseluler, tetapi sebagian besar tidak diketahui fungsinya. Sebagian besar penanda endotel tumor ini
diekspresikan dalam berbagai jenis tumor, serta pada pembuluh normal yang berhubungan dengan penyembuhan
luka dan pembentukan korpus luteum. Studi ini menunjukkan bahwa tumor dan endotelium normal berbeda pada
tingkat molekuler - sebuah temuan yang mungkin memiliki implikasi signifikan untuk pengembangan terapi
antiangiogenik. [ 219]

Analisis SAGE mengungkapkan penanda endotel yang baru dan dikarakterisasi sebelumnya. Tag karakter atau tag
baru yang paling melimpah diperoleh dengan menjumlahkan tag dari EC normal (N-EC) dan EC tumor (T-EC).
Perpustakaan SAGE terdaftar dalam urutan menurun. Sebagai perbandingan, jumlah yang sesuai dari tag SAGE yang
ditemukan dalam kultur sel endotel HUVEC dan HMVEC, dan beberapa baris sel nonendotel (14), ditampilkan. Nomor
tag untuk setiap kelompok dinormalisasi menjadi 100.000 transkrip. Deskripsi produk gen yang sesuai dengan setiap tag
diberikan, diikuti dengan nama alternatif di dalam tanda kurung. Beberapa gen yang tidak berkarakter telah memprediksi
urutan pengkodean dengan panjang penuh. Urutan CATG mendahului semua tag, dan basis ke-15 (11 ditampilkan)
ditentukan seperti yang dijelaskan (38) [Referensi pada 219].
 4.6 Sifat Kompleks 115

Tumor payudara manusia beragam dalam sejarah alaminya dan dalam daya tanggapnya terhadap
pengobatan. Variasi dalam program transkripsi menyebabkan banyak keragaman biologis sel manusia dan
tumor. Di setiap sel, transduksi sinyal dan sistem pengaturan mentransduksi informasi dari identitas sel ke status
lingkungannya, dengan demikian mengontrol tingkat ekspresi setiap gen dalam genom. Variasi ditandai dalam
pola ekspresi gen dalam satu set 65 spesimen bedah tumor payudara manusia dari 42 individu yang berbeda,
menggunakan mikroarray DNA komplementer yang mewakili 8102 gen manusia. Pola-pola ini memberikan
gambaran molekuler yang khas dari setiap tumor. Dua puluh tumor diambil sampelnya dua kali, sebelum dan
sesudah program kemoterapi doksorubisin selama 16 minggu, dan dua tumor dipasangkan dengan metastasis
kelenjar getah bening dari pasien yang sama. Pola ekspresi gen dalam dua sampel tumor dari individu yang
sama hampir selalu lebih mirip satu sama lain dibandingkan dengan sampel lainnya. Kumpulan gen yang
diekspresikan bersama diidentifikasi yang variasi tingkat mRNA dapat dikaitkan dengan fitur spesifik variasi
fisiologis. Tumor dapat diklasifikasikan ke dalam subtipe yang dibedakan berdasarkan perbedaan pola ekspresi
gennya. [ 220]

Penjelasan kontribusi genetik untuk penuaan di Drosophila melanogaster dan

Caenorhabditis elegans dan hubungan mereka mengarah pada mekanisme genetik dan biokimia yang
dilestarikan secara evolusi. [ 655]

Itu Drosophila melanogaster gen reseptor seperti insulin (InR) ditemukan homolog dengan reseptor insulin
mamalia dan juga Caenorhabditis elegans daf-2, transduser sinyal yang mengatur pembentukan worm dauer dan
umur panjang orang dewasa. Genotipe mutan yang heteroallelic dan hipomorfik InR, yang mengakibatkan betina
kerdil dengan perpanjangan usia dewasa hingga 85% dan jantan kerdil dengan penurunan angka kematian spesifik
usia lanjut. Pengobatan yang berumur panjang InR katai dengan analogi hormon remaja mengembalikan harapan
hidup ke arah kontrol tipe liar sehingga menunjukkan bahwa defisiensi hormon remaja akibat InR mutasi jalur sinyal
cukup untuk memperpanjang umur lalat. Hasilnya juga menunjukkan bahwa ligan mirip insulin secara nonautonom
memediasi penuaan pada lalat melalui retardasi pertumbuhan atau aktivasi jaringan endokrin tertentu. [ 654]

Itu Drosophila melanogaster gen chico pengkodean substrat reseptor insulin yang berfungsi dalam jalur
pensinyalan insulin / insulin-like growth factor (IGF) ditemukan memperpanjang masa hidup median lalat buah
pada mutasi hingga 48% pada homozigot dan 36% pada heterozigot. Perpanjangan masa hidup bukanlah hasil
dari gangguan oogenesis di
chico perempuan atau berkorelasi dengan peningkatan ketahanan stres juga tidak dengan fenotipe katai chico homozigot
diperlukan untuk perpanjangan masa hidup. [ 653]

Studi keterkaitan genetik diperlukan untuk mengidentifikasi beberapa gen yang terlibat dalam sifat kompleks
dan studi genetik populasi yang melibatkan polimorfisme nukleotida tunggal dan variasi genetik lainnya seperti alel
yang berbeda adalah dasar untuk farmako-genomik dan identifikasi asosiasi penyakit genetik. [ 691] [692]

Tabel 4.7 menunjukkan daftar penanda pan-endotel yang diidentifikasi oleh analisis SAGE.
116 4 Bioteknologi dan Kedokteran

Tabel 4.7. Gen ditentukan dengan analisis SAGE menjadi penanda pan-endotel yang potensial [Referensi dalam 219].

Urutan tag N-ECs T-EC Sel HUVEC HMVEC Deskripsi

garis

Gen yang diketahui

CATATCATTAA 247 501 130 87 2 Angiomodulin (ANG, IGFBP-7,

IGFBP-rP1, Mac25, TAF) *
TGCACTTCAAG 328 141 0 0 0 Hevin *
TTTGCACCTTT 165 84 191 115 4 Pertumbuhan jaringan ikat
faktor (CTGF, IGFBP-rP2) *
TTGCTGACTTT 73 131 2 14 1 Kolagen, tipe VI, alfa l * diinduksi
ACCATTGGATT 102 67 0 0 2 Interferon
protein transmembran 1
(9-27, Leu 13) *
ACACTTCTTTC 104 44 60 62 2 Pengikatan nukleotida guanin
protein 11
TTCTGCTCTTG 71 67 118 72 0 Faktor Von Willebrand *
TCCCTGGCAGA 66 68 3 13 3 Protein kaya sistein 2
(CRP-2, ESP-1, SmLIM)
TAATCCTCAAG 26 106 34 16 1 Kolagen, tipe XVIII, alfa l * Pertumbuhan
ATGTCTTTTCT 58 65 17 17 3 mirip insulin
protein pengikat faktor 4 *
GGGATTAAAGC 40 67 30 14 2 CD146 (S-Endo 1, P1H12, Muc18,
MCAM. Mel-CAM) *
TTAGTGTCGTA 38 69 9 13 0 SPARC (osteonektin, BM-40) *
TTCTCCCAAAT 20 86 16 64 2 Kolagen, tipe IV, alfa 2 *
GTGCTAAGCGG 24 74 0 10 2 Kolagen, tipe VI, alfa 2 * protein
GTT'TATGGATA 35 56 11 11 1 Matrix Gla (MGP)

Gen baru
CCCTTGTCCGA 131 104 1 1 0 PEM1 Est
CCCTTTCACAC 52 33 0 0 0 PEM2 EST
CAACAATAATA 42 25 13 6 0 PEM3 EST
GGCCCTACAGT 26 13 2 3 0 PEM4 ESTs / KIAA0821
protein
GCTAACCCCTG 7 31 0 1 0 PEMS EST
GGCACTCCTGT 22 13 19 12 0 PEM6 EST
TCACAGCCCCC 20 15 8 5 0 PEM7 EST
CAACAATAATA 42 25 13 6 0 PEM3 EST
GGCCCTACAGT 26 13 2 3 0 PEM4 ESTs / KIAA0821
protein
GCTAACCCCTG 7 31 0 1 0 PEMS EST
GGCACTCCTGT 22 13 19 12 0 PEM6 EST
TCACAGCCCCC 20 15 8 5 0 PEM7 EST
TTTCATCCACT 20 13 0 2 0 PEM8 EST. KIAA0362
protein
ATACTATAATT 25 6 2 0 0 PFM9 EST
AATAGGGGAAA 13 19 4 1 0 PEM10 Protein KIAA1075

* Gen yang dikarakterisasi yang sebelumnya telah terbukti diekspresikan terutama di endotel (10, 15-26).
 Bioteknologi Farmasi Industri. Heinrich Klefenz
Hak Cipta © 2002 Wiley-VCHVerlag GmbH
ISBN: 3-527-29995-5 (Sampul Tebal); 3-527-60012-4 (Elektro 1 n 1 ic 7)

5 Penemuan Obat

Proses penemuan obat merupakan sumber fundamental prinsip aktif, yaitu senyawa yang berinteraksi sebagai agonis
atau antagonis, baik secara fungsional maupun struktural, dengan penyusun organisme hidup.

Obat muncul dari sumber alami, dengan variasi struktur molekul yang hampir tak terbatas, atau dirancang
dengan efek target atau molekul dalam pikiran [menggunakan hubungan struktur-aktivitas kuaterner (QSAR)].
Kombinasi dan pemanfaatan kreatif dari beberapa bidang studi ilmiah, yaitu genomik, proteomik, bioinformatika,
analisis struktural dan eksperimen fungsional ditambah ilmu kimia tingkat lanjut, akan memberikan hasil yang
signifikan dalam dekade mendatang. [ 221]

Penemuan obat modern sering kali melibatkan penyaringan molekul kecil untuk kemampuannya mengikat target protein
yang telah dipilih sebelumnya. Sintesis berorientasi target dari molekul kecil ini, secara individu atau sebagai kumpulan
(perpustakaan terfokus), dapat direncanakan secara efektif dengan analisis retrosintetik. Penemuan obat juga dapat
melibatkan skrining molekul kecil untuk kemampuannya memodulasi jalur biologis dalam sel atau organisme, tanpa
memperhatikan target protein tertentu. Proses ini kemungkinan akan mendapatkan keuntungan di masa depan dari analisis
jalur sintetik yang terus berkembang, yang digunakan dalam sintesis berorientasi keragaman yang mengarah pada molekul
kecil yang kompleks dan beragam secara struktural. Salah satu tujuan dari sintesis yang berorientasi pada keanekaragaman
adalah untuk mensintesis secara efisien kumpulan molekul kecil yang mampu mengganggu jalur biologis terkait penyakit,
mengarah pada identifikasi target protein terapeutik yang mampu dimodulasi oleh molekul kecil. Beberapa prinsip
perencanaan sintesis untuk sintesis yang berorientasi keanekaragaman dan perannya dalam proses penemuan obat telah
ditinjau. [ 222]

Penemuan obat baru-baru ini telah berpindah dari sintesis kimia yang diarahkan pada biologi
menuju area di mana skrining tanpa pengetahuan skala besar mendominasi. Karena biaya untuk
melakukan penyaringan throughput tinggi keragaman skala besar (HTS) terus turun, didorong oleh
miniaturisasi yang ekstrim, pergeseran paradigma menuju kegiatan penyaringan yang kurang terpusat
yang didistribusikan lebih dekat ke kelompok pengguna akhir atau individu adalah konsekuensi yang
mungkin terjadi. Oleh karena itu, kekuatan metodologi menjadi lebih responsif terhadap kebutuhan
individu yang lebih beragam. Model ini adalah ekstrapolasi logis dari praktik saat ini, dengan
mempertimbangkan sejarah teknologi lain seperti komputasi, sekuensing DNA, dan teknik analisis
fisikokimia lainnya. Era skrining pribadi atau desktop tidak lama lagi,

Sejalan dengan pendekatan ini, kekuatan metodologi prediksi komputasi kini telah mencapai tahap di
mana strategi ketiga, 'definisi ruang kimia', dapat diterapkan pada portofolio penemuan untuk membantu
menemukan intervensi farmasi. Informasi-
118 5 Penemuan Obat

skrining berdasarkan, baik itu melalui penerapan metode yang terfokus, berbasis sistem atau penggunaan skrining
berulang, akan menjadi lebih efisien, memilih lebih sedikit positif palsu dan, yang lebih penting, lebih sedikit negatif palsu.
Ini akan dicapai tidak hanya melalui pengembangan algoritme yang lebih baik, tetapi melalui algoritme yang mapan yang
dapat diakses dengan peningkatan daya komputasi. Kontribusi besar lainnya untuk pengembangan metode komputasi
adalah data yang dihasilkan selama bertahun-tahun, terutama untuk keluarga target seperti kinase. Dalam beberapa
tahun ke depan, model prediktif untuk target ini mungkin meniadakan kebutuhan akan skrining acak terhadap mereka,
karena kita akan mempelajari fitur penting yang diperlukan untuk pengenalan.

Keragaman dan pendekatan yang terfokus kemungkinan akan terus memberikan manfaat yang saling
melengkapi. Portofolio teknik bersama-sama akan memberikan pendekatan yang lebih efektif dan
komprehensif untuk identifikasi efektif obat baru untuk banyak target baru yang diungkapkan melalui
genomik dan proteomik.
Komplementaritas keragaman dan pendekatan terfokus dapat dilihat dalam praktek klinis. Semua PI HIV
berasal dari sekolah desain penemuan obat yang rasional dan berbasis struktur, sedangkan penghambat
transkriptase balik HIV non-nukleosida hampir semuanya berasal dari skrining keragaman. Karena terapi
kombinasi adalah cara terbaik untuk mengobati infeksi HIV, ini adalah bukti manfaat teknologi pelengkap untuk
melawan penyakit. [ 223]

Pengetahuan tentang jalur pensinyalan seluler dan pengetahuan tentang genetika manusia dari suatu penyakit
tertentu memberikan validasi yang kuat dan target rasional untuk identifikasi penyakit dan pengembangan obat dan
terapi.
Kanker akan menjadi penyebab kematian terkait penyakit yang paling umum karena ini adalah penyakit dari
berbagai mutasi yang terakumulasi yang terwujud dalam populasi manusia dengan rentang hidup yang semakin
lama. Kemoterapi dan terapi gen memanfaatkan peningkatan pengetahuan molekuler pada kanker, dan
didukung oleh genotipe tumor dan profil gen pasien. [ 224]

Tabel 5.1 memberikan contoh terapi kanker berbasis mekanisme yang sedang dikembangkan.
Ciri khusus CML adalah translokasi kromosom timbal balik yang melibatkan lengan panjang
kromosom 9 dan 22. Mutasi somatik ini menggabungkan segmen bcr gen, dari kromosom 9, ke daerah
hulu ekson kedua dari c- abl ( Gen Abelson tirosin kinase) dari kromosom 22. c- abl mengkodekan tirosin
kinase non-reseptor yang memiliki aktivitas terkontrol ketat dalam sel normal. Sebaliknya, protein fusi
Bcr-Abl memiliki aktivitas katalitik konstitutif, meskipun fakta bahwa urutan asam amino dari segmenAbl
dari Bcr-Abl identik dengan c-Abl. Alasan aktivitas katalitik yang meningkat dari protein fusi Bcr-Abl masih
kurang dipahami, tetapi jelas bahwa aktivitas domain kinase ini diperlukan untuk kemampuan protein
Bcr-Abl untuk mengubah sel dan menyebabkan keganasan.

Penghambat molekul kecil Abl (STI-571) efektif dalam pengobatan CML leukemia myelogenous
kronis, yang disebabkan oleh aktivasi Abl yang tidak disengaja. Struktur kristal domain katalitik Abl,
dikomplekskan menjadi varian STI-571, dilaporkan. Kritis untuk pengikatan STI-571 adalah adopsi oleh
kinase dari konformasi tidak aktif, di mana 'loop aktivasi' yang terletak di pusat tidak terfosforilasi.
Konformasi loop ini berbeda dari konformasi pada protein kinase aktif, serta dalam bentuk tidak aktif
dari Src kinase yang terkait erat. Hasil ini menunjukkan bahwa senyawa itu
 5 Penemuan Obat 119

Tabel 5.1. Contoh terapi kanker berbasis mekanisme dalam pengembangan [Referensi dalam 224].

Obat Target Obat Target

Antagonis reseptor Penghambat enzim lainnya

Raloxifene Reseptor estrogen R115777 FTase
LY353381 Reseptor estrogen SCH 66336 FTase
GW5638 Reseptor estrogen L-778.123 FTase
CP336156 Reseptor estrogen BMS-214662 FTase
EM-800 Reseptor estrogen CP-609.754 FTase
EMD-121974 Integrin Marimastat MMP
AG-3340 MMP
Penghambat protein kinase BMS-275291 MMP
CGP 57148 / STI 571 Bcr-abl CGS-27023A MMP
ZD-1839 Reseptor EGF BAY 12-9566 MMP
CP-358.774 Reseptor EGF
SU-5416 KDR Antibodi terapeutik
SU-6668 KDR; FGFR; dan C225 Reseptor EGF
PDGFR Anti-VEGF SAYURAN

CGP 60474 Bergantung pada cyclin IMC-1C11 KDR

kinase Vitaxin Integrin
Flavopiridol Bergantung pada cyclin

kinase Oligonukleotida antisense

CGP 41251 Protein kinase C. ISIS-2503 Ras
UCN-01 Protein kinase C. ISIS-5132 Raf
ISIS-3521 Protein kinase C.
Virus G3139 Bcl2
SCH 58500 (AD- p 53) p53
Onyx-015 p53

mengeksploitasi mekanisme inaktivasi khas protein kinase individu dapat mencapai afinitas tinggi dan
spesifisitas tinggi. [ 225]

Penelitian ini merupakan hasil dari identifikasi rangkaian inhibitor, berdasarkan farmakofor kelas
2-fenilaminopirimidin yang memiliki afinitas dan spesifisitas yang sangat tinggi untukAbl. Yang paling kuat adalah
STI-571. Gambar 5.1 menunjukkan formula struktural STI-571 (sebelumnya senyawa Novartis CGP 57148), yang
telah berhasil diuji dalam uji klinis sebagai agen terapeutik untuk CML. Senyawa tersebut telah menyebabkan
respons hematologi lengkap pada 96% pasien yang dirawat selama lebih dari 4 minggu pada tingkat dosis 300 mg
dan dapat ditoleransi dengan baik. Kemungkinan mengambil keuntungan dari konformasi inaktif yang berbeda dari
poin protein kinase menuju pengembangan lebih lanjut dari inhibitor protein kinase spesifik.

Protein kinase telah terbukti sebagian besar tahan terhadap rancangan inhibitor yang sangat spesifik, bahkan dengan
bantuan kimia kombinatorial. Kurangnya reagen ini memiliki upaya yang rumit untuk menetapkan peran pensinyalan
khusus pada kinase individu. Strategi genetik kimiawi dijelaskan untuk mensensitisasi protein kinase menjadi molekul
permeablemolekul sel yang tidak menghambat kinase tipe liar. Dari dua perancah inhibitor, inhibitor poten dan selektif
untuk peka
120 5 Penemuan Obat

H. N N

N N N N

N HAI

(Panel 1)

H. N

N N N N

N HAI

(Panel 2)

Gambar 5.1. Rumus struktur dari inhibitorAbl STI-571 (panel 1) dan varian (panel 2) [Acuan dalam 225].

kinase dari lima subfamili yang berbeda diidentifikasi. Tirosin dan serin / treonin kinase sama-sama dapat menerima
pendekatan ini. Strain ragi budding yang membawa bentuk CDK cdc28 (CDK1) yang sensitif terhadap inhibitor
sebagai pengganti protein tipe liar dianalisis. Spesifik
penghambatan cdc28 in vivo menyebabkan penangkapan siklus sel pra-mitosis yang berbeda dari G 1
penangkapan biasanya diamati pada cdc28mutants sensitif suhu. Mutasi yang memberi
sensitivitas inhibitor mudah dikenali dari penyelarasan urutan utama. Pendekatan ini dapat digunakan untuk secara
sistematis menghasilkan alel kondisional protein kinase, memungkinkan karakterisasi fungsional yang cepat dari
anggota keluarga gen yang penting ini. [ 226]

Protein tirosin kinase dan fosfatase terlibat dalam berbagai aktivitas intraseluler, termasuk proliferasi,
migrasi, dan diferensiasi sel. Banyak protein semacam itu bisa
 5 Penemuan Obat 121

selektif mengikat target serumpun mereka dan memulai kaskade peristiwa pensinyalan melalui domain modular
kunci yang mengontrol interaksi protein-protein. Salah satu domain tersebut, domain homologi 2 (SH2) Src, telah
ditentukan untuk memainkan peran penting dalam banyak jalur pensinyalan dengan mengenali urutan fosfotirosin
(pTyr) dari protein serumpun. Domain SH2 dari protein non-reseptor tirosin kinase Src telah terbukti berinteraksi
dengan adhesi kinase fokal, p130 cas, p85, phosphatidylinositol 3-kinase dan p68 sam. Molekul kecil yang dirancang
untuk menghambat interaksi protein-protein yang dimediasi SH2 menjanjikan sebagai agen farmasi untuk memblokir
jalur intraseluler tertentu yang secara kritis terlibat dalam patogenesis penyakit tertentu.

Gangguan yang ditargetkan dari pp60 src ( Gen Src) telah melibatkan tirosin kinase dalam resorpsi tulang yang
dimediasi oleh osteoklas dan sebagai target terapeutik untuk pengobatan osteoporosis dan penyakit terkait tulang
lainnya. Penemuan penghambat non-peptida (AP22408) dari Src telah dijelaskan in vivo aktivitas antiresorptif.
Berdasarkan struktur co-kristal domain SH2 non-katalitik dari Src yang dikomplekskan dengan sitrat (dalam poket
pengikat pTyr), 3 ′, 4 ′ - diphosphonophenylalanine (Dpp) dirancang sebagai mimik pTyr. Selain desainnya untuk
mengikat Src SH2, bagian Dpp menunjukkan sifat penargetan tulang yang memberikan selektivitas osteoklas,
karenanya meminimalkan kemungkinan efek yang tidak diinginkan pada sel lain yang memiliki aktivitas yang
bergantung pada Src. Struktur kimia AP22408 juga menggambarkan templat bisiklik untuk menggantikan urutan
pasca-pTyr dari fonopeptida Src SH2 serumpun seperti Ac-pTyr – Glu – Glu – Ile (1). Struktur sinar-X AP22408 yang
dikomplekskan dengan Lck (S164C) SH2 mengkonfirmasi interaksi molekuler dari template Dpp dan bisiklik AP22408
seperti yang diprediksi dari pemodelan molekuler. Sehubungan dengan fosfopeptida serumpun, AP22408

menunjukkan secara signifikan meningkatkan afinitas pengikatan Src SH2 (IC 50 = 0.30 µ M forAP22408 dan
IC 50 = 5.5 µ M untuk 1). AP22408 menghambat resorpsi dentin yang dimediasi oleh osteoklas kelinci dalam uji seluler,
menunjukkan sifat penargetan tulang berdasarkan adsorpsi hidroksiapatit
menguji dan mendemonstrasikan in vivo aktivitas antiresorptif dalam model tikus yang diinduksi hormon paratiroid. [ 227]

Faktor pertumbuhan fibroblast (FGFs) adalah keluarga besar faktor pertumbuhan pleiotropik yang meningkatkan
kelangsungan hidup, proliferasi dan diferensiasi berbagai garis dan jaringan sel. Pengobatan dengan FGF menginduksi
pembentukan pembuluh darah baru, dan meningkatkan aliran darah dan fungsi organ pada hewan model penyakit
pembuluh darah perifer dan iskemia miokard. Selain itu, pengobatan FGF dapat mengurangi ukuran infark setelah oklusi
arteri koroner dan serebral eksperimental.

Studi klinis dengan FGF dan molekul angiogenik lainnya menyiratkan kebutuhan untuk mengembangkan molekul
terapeutik dengan sifat yang lebih baik. Misalnya, waktu paruh plasma FGFs pendek, menyiratkan bahwa pemberian
berulang protein rekombinan, atau terapi gen, mungkin diperlukan untuk efek terapeutik yang optimal. Adanya beberapa
subtipe reseptor FGF di berbagai jaringan menunjukkan bahwa molekul dengan spesifisitas reseptor yang lebih besar
mungkin memiliki lebih sedikit toksisitas sistemik. FGF sedang diselidiki dalam uji klinis manusia sebagai pengobatan untuk
angina, klaudikasio dan stroke. Sebuah molekul dirancang yang secara struktural tidak terkait dengan semua FGF, yang
secara potensial meniru aktivitas FGF dasar, dengan menggabungkan domain yang (i) mengikat reseptor FGF, (ii) mengikat
heparin dan (iii) memediasi dimerisasi. Peptida 26-residu yang diidentifikasi oleh tampilan fag secara spesifik terikat reseptor
FGF (FGFR) domain ekstraseluler 1c tetapi tidak memiliki homologi dengan FGF. Saat menyatu dengan c- jun ritsleting
leusin
122 5 Penemuan Obat

domain, yang mengikat heparin dan membentuk heterodimer, polipeptida secara khusus
mengurangi aktivitas mitogenik dan morfogenik FGF dasar dengan potensi yang sama (EC 50 =
240 pM). Polipeptida membutuhkan interaksi dengan heparin untuk aktivitas, menunjukkan
pentingnya heparin untuk aktivasi FGFR, bahkan dengan ligan yang dirancang secara struktural tidak terkait dengan FGF.
Dengan demikian dimungkinkan untuk merekayasa ligan buatan yang kuat untuk reseptor tirosin kinase, yang memiliki
implikasi penting untuk desain ligan non-peptida untuk reseptor FGF. Agonis FGFR buatan mungkin menjadi alternatif yang
berguna untuk FGF dalam pengobatan penyakit vaskular iskemik. [ 228]

Keluarga FGF pengikat heparin terdiri dari lebih dari 20 anggota yang memainkan peran penting dalam mengatur
diferensiasi, pertumbuhan, dan perkembangan seluler. Karena transduksi sinyal FGF memerlukan pembentukan kompleks
beranggota tiga yang terdiri dari FGF, heparan sulfat / heparin dan FGFR, proteoglikan (PG) yang mengandung heparin
sulfat / heparin yang terletak pada permukaan sel atau dalam matriks ekstraseluler merupakan pengatur penting aktivitas
biologis FGF. Beberapa isoform FGF, termasuk FGF-1, diketahui membutuhkan heparin / heparin sulfat untuk
menunjukkan aktivitas mitogeniknya secara penuh. in vitro, heparin memfasilitasi pembentukan dimer FGF-1 yang aktif
secara biologis dan pengikatan dengan afinitas tinggi FGF-1 ke FGFR dan juga menstabilkan struktur FGF-1 dan
melindunginya dari inaktivasi proteolitik.

Dengan tidak adanya heparan sulfat pada permukaan sel target atau heparin bebas di sekitar reseptornya, anggota keluarga FGF
tidak dapat melakukan aktivitas biologisnya dan mudah rusak oleh proteolisis. Hal ini membatasi kegunaan FGF dalam berbagai
aplikasi termasuk pengobatan luka bedah, luka bakar dan jaringan periodontal, tukak lambung, cacat tulang segmental, dan cedera
ligamen dan sumsum tulang belakang. Analog FGF direkayasa untuk mengatasi batasan ini dengan menggabungkan FGF-1 dengan
protein inti PG heparin sulfat. Protein fusi (PG-FGF-1), yang diekspresikan dalam sel ovarium hamster Cina dan dikumpulkan dari
media yang dikondisikan, memiliki rantai gula heparin sulfat dan kondroitin sulfat. Setelah fraksinasi, protein PG-FGF-1 utuh dengan
sedikit afinitas terhadap heparin amobil dan modifikasi heparin sulfat tingkat tinggi, tetapi tidak mencerna heparitinase atau heparinase
mereka, menggunakan aktivitas mitogenik yang tidak bergantung pada heparin eksogen terhadap transfektan Ba / F3 bebas sulfat
heparin yang mengekspresikan FGFR. Meskipun PG-FGF-1 resisten terhadap pencernaan tryptic, degradasi fisiologisnya dengan
kombinasi heparitinase dan tripsin ditambah aktivitas mitogeniknya terhadap sel endotel manusia. Perlakuan yang sama menghapus
aktivitas protein FGF-1 sederhana. Dengan membangun protein fusi PG-FGF-1 yang aktif secara biologis, sebuah pendekatan telah
ditunjukkan yang mungkin efektif untuk merekayasa anggota keluarga FGF lain dan protein pengikat heparin lainnya juga. [ Meskipun
PG-FGF-1 resisten terhadap pencernaan triptik, degradasi fisiologisnya dengan kombinasi heparitinase dan tripsin meningkatkan
aktivitas mitogeniknya terhadap sel endotel manusia. Perlakuan yang sama menghapus aktivitas protein FGF-1 sederhana. Dengan
membangun protein fusi PG-FGF-1 yang aktif secara biologis, sebuah pendekatan telah ditunjukkan yang mungkin efektif untuk
merekayasa anggota keluarga FGF lain dan protein pengikat heparin lainnya juga. [ Meskipun PG-FGF-1 resisten terhadap
pencernaan triptik, degradasi fisiologisnya dengan kombinasi heparitinase dan tripsin meningkatkan aktivitas mitogeniknya terhadap sel endotel manusia. Perlakua

Interaksi protein-protein sangat penting untuk banyak proses biologis. Interaksi tersebut dapat diidentifikasi
dengan tampilan fag dan sistem hibrida dua ragi, serta dengan metode biokimia. Identifikasi interaksi
protein-protein hanyalah langkah awal dalam menjelaskan proses dan fungsi. Modulasi interaksi diperlukan
untuk menghasilkan pemahaman yang benar tentang tujuan biologis.

Proses interaksi protein-protein termasuk transduksi sinyal, regulasi siklus sel, regulasi gen, dan perakitan
dan replikasi virus. Banyak protein dan enzim mewujudkan fungsinya sebagai oligomer. Cara yang efisien telah
dikembangkan untuk menyaring perpustakaan kombinatorial besar dan mengidentifikasi molekul yang
memblokir interaksi peptida sembilan-residu dari perpustakaan kombinatorial yang menghambat dimerisasi
intraseluler HIV-
 5 Penemuan Obat 123

1 protease. Kurang dari 1 dari 10 6 peptida melakukannya. In vitro Analisis biokimia dari salah satu peptida tersebut menunjukkan
bahwa ia bekerja dengan memisahkan protease HIV-1 menjadi monomer, yang merupakan katalis tidak aktif. Penghambatan
selanjutnya ditingkatkan dengan dimerisasi peptida. Pendekatan ini memungkinkan identifikasi yang mudah dari molekul baru yang
mengontrol proses seluler. [ 230]

Studi interaksi protein-protein dan interferensi spesifiknya merupakan dasar pengembangan molekul kecil
sebagai agen terapeutik di bidang jaringan protein dan regulasi mereka. Mutasi yang diperkenalkan ke hormon
pertumbuhan manusia (hGH) dan domain ekstraseluler reseptor hGH menciptakan rongga pada antarmuka
protein-protein yang mengakibatkan afinitas pengikatan dikurangi dengan faktor 10 6. Sebuah perpustakaan kecil
dari analog indol disaring untuk molekul kecil yang mengikat rongga yang diciptakan oleh mutasi dan memulihkan
afinitas pengikatan. Ligan 5-kloro-2-trikloromethylimidazole ditemukan meningkatkan afinitas hormon mutan untuk
reseptornya lebih dari 1000 kali lipat. Proliferasi sel dan tes fosforilasi JAK2 menunjukkan bahwa mutan hGH
mengaktifkan sinyal hormon pertumbuhan dengan adanya ligan tambahan. Pendekatan ini memungkinkan
interaksi protein-protein dan protein-nukleat lain untuk diaktifkan atau dinonaktifkan dengan penambahan atau
penipisan molekul kecil eksogen. [ 231]

Aktivator transkripsi eukariotik minimal terdiri dari domain pengikatan DNA dan domain aktivasi yang
dapat dipisahkan; kebanyakan protein penggerak juga memiliki modul dimerisasi. Modul protein ini diganti
dengan komponen sintetis untuk membuat faktor transkripsi buatan. Salah satunya, pada 4.2 kDa,
memediasi aktivasi transkripsi spesifik lokasi DNA tingkat tinggi in vitro. Molekul ini mengandung poliamida
pengikat DNA spesifik-urutan sebagai pengganti daerah pengikatan DNA yang khas dan penaut non-protein
sebagai pengganti peptida dimerisasi biasa. Modul pengikat protein-DNA diganti dengan poliamida jepit
rambut yang terdiri dari N- methylpyrrole (Py) dan N- methylimidazole (Im) asam amino yang mengikat di alur
kecil DNA. Jadi daerah pengaktifan, suatu peptida yang dirancang, berfungsi di luar konteks protein pola
dasar, selama ia terikat pada DNA. Karena poliamida sintetis dapat, pada prinsipnya, dirancang untuk
mengenali urutan tertentu, ini merupakan langkah kunci menuju desain molekul kecil yang dapat mengatur
gen tertentu. [ 232]

Mutasi pada gen penekan tumor p53 adalah perubahan genetik spesifik yang paling umum pada tumor manusia.
Di lebih dari 90% kanker serviks dan jalur sel yang diturunkan dari kanker, jalur penekan tumor p53 terganggu oleh
human papillomavirus (HPV). Protein HPV E6 mendorong degradasi p53, dan dengan demikian menghambat
stabilisasi dan aktivasi p53 yang biasanya terjadi sebagai respons terhadap ekspresi onkogen HPVE7. Pemulihan
fungsi p53 dalam sel-sel ini dengan memblokir jalur ini akan meningkatkan efek terapeutik selektif. Pengobatan
dengan penghambat ekspor nuklir molekul kecil, leptomisin B dan aktinomisin D mengarah pada akumulasi p53
yang aktif secara transkripsi dalam inti sel HeLa, CaSki dan SiHa. Analisis Northern blot menunjukkan bahwa baik
leptomisin B dan aktinomisin D mengurangi jumlah mRNA HPV E6-E7, sedangkan pengobatan gabungan dengan
obat-obatan menunjukkan hilangnya mRNA virus secara hampir total. Pengobatan gabungan mengaktifkan
transkripsi yang bergantung pada p53, dan meningkatkan kedua p21 Waf1 / Cip1 danHdm2 mRNA diamati. Perlakuan
gabungan mengakibatkan kematian apoptosis dalam sel, yang dibuktikan dengan fragmentasi nukleus dan
pembelahan PARP yang mengindikasikan aktivitas caspase 3. Efek ini sangat berkurang dengan mengekspresikan
protein p53 negatif yang dominan. Kecil
124 5 Penemuan Obat

molekul dapat mengaktifkan kembali p53 dalam sel karsinoma serviks dan reaktivasi ini dikaitkan dengan
respons biologis yang luas, termasuk induksi kematian apoptosis sel. [ 233]

Oligonukleotida pembentuk heliks rangkap tiga (TFO) mengikat alur utama DNA untai ganda pada urutan
oligoprimidin-oligopurin dan oleh karena itu merupakan molekul kandidat untuk regulasi gen buatan, in vitro dan in
vivo. Analog oligonukleotida yang mengandung N3 ′ –P5 ′
hubungan fosforamidat (np) dijelaskan yang menunjukkan penghambatan yang efisien dari perpanjangan
transkripsi in vitro. Bukti konklusif diberikan bahwa TFO yang dimodifikasi np yang ditargetkan ke urutan
saluran polipurin (PPT) HIV-1 dapat menghambat perpanjangan transkripsi dalam sel, baik dalam sistem
ekspresi sementara atau stabil. Konstruksi yang sama digunakan dalam pengujian ekspresi transien
(urutan target pada plasmid yang ditransfeksi) dan dalam pembentukan garis sel yang stabil (urutan
target diintegrasikan ke dalam kromosom seluler). Dalam kedua kasus, satu-satunya fitur yang dapat
dibedakan antara sistem seluler adalah adanya sisipan yang berisi urutan PPT / HIV-1 tipe liar, versi
yang diamputasi dengan dua ketidakcocokan, atau tidak adanya sisipan sama sekali. Tindakan
penghambatan yang diinduksi oleh np-TFOs dibatasi pada sistem seluler yang mengandung target PPT /
HIV-1 tipe liar komplementer dan akibatnya hanya dapat dikaitkan dengan mekanisme yang dimediasi
oleh tiga heliks. 234]

Proses penemuan obat dalam bentuk non-rasionalnya sering kali dimulai dengan skrining besar-besaran dari kumpulan
gabungan untuk mengidentifikasi petunjuk afinitas sederhana. Proses skrining tidak menargetkan situs tertentu untuk desain obat
tetapi hanya situs di mana tes throughput tinggi tersedia. Banyak metode penyaringan tradisional mengandalkan uji
penghambatan yang sering kali tunduk pada artefak yang disebabkan oleh spesies kimiawi reaktif atau denaturants.

Sebuah strategi (disebut tethering) dikembangkan untuk menemukan ligan dengan berat molekul rendah (sekitar
250 Da) yang mengikat lemah ke situs target pada protein melalui perantara disulfida tether. Sistein asli atau yang
direkayasa dalam protein dibiarkan bereaksi secara reversibel dengan kumpulan kecil molekul yang mengandung
disulfida (sekitar 1200 senyawa) pada konsentrasi yang biasanya digunakan dalam skrining obat (10-200 µ M). Ligan
yang ditangkap oleh sistein, yang mudah diidentifikasi oleh MS, termasuk di antara kompleks yang paling stabil,
meskipun dengan tidak adanya tambatan kovalen, ligan dapat mengikat dengan sangat lemah. Metode ini diterapkan
untuk menghasilkan penghambat ampuh untuk sintase timidilat, enzim penting dalam metabolisme pirimidin dengan
aplikasi terapeutik pada kanker dan penyakit menular. Itu

afinitas ligan yang tidak terikat ( K i ~ 1 mM) ditingkatkan 3000 kali lipat dengan sintesis seperangkat kecil
analog dengan bantuan struktur kristalografi kompleks tertambat.
Penemuan ligan yang diarahkan ke lokasi tersebut memungkinkan seseorang untuk melakukan nukleasi desain obat dari fragmen
timbal yang ditargetkan secara spasial. [ 235]

Mempengaruhi jaringan pengaturan genetik dapat dicapai dengan efek molekul kecil, dengan protein
pengaturan dan metode terapeutik gen. Kompleksitas yang harus dipertimbangkan diilustrasikan oleh
fenomena interferensi RNA dan ko-supresi. Awalnya ditemukan pada tumbuhan, fenomena ko-supresi oleh
DNA transgenik telah diamati pada banyak organisme dari jamur ke hewan: pengenalan salinan transgenik
dari suatu gen mengakibatkan berkurangnya ekspresi transgen serta gen endogen. Efeknya tergantung
pada identitas sekuens antara transgen dan gen endogen. Beberapa kasus
 5 Penemuan Obat 125

ko-supresi menyerupai gangguan RNA (pembungkaman gen eksperimental dengan pengenalan RNA untai
ganda), karena RNA tampaknya menjadi pemrakarsa dan target penting dalam proses ini. Hal itu menunjukkan
bahwa penindasan dalam C. elegans mungkin juga dimediasi oleh molekul RNA. Baik interferensi RNA dan
ko-supresi telah terlibat dalam pembungkaman transposon. Mutan dari C. elegans yang rusak dalam peredaman
transposon dan interferensi RNA ( mut-2, mut-7, mut-8 dan mut-9) selain itu tahan terhadap penindasan bersama.
Jadi gangguan RNA dan ko-supresi dalam C. elegans dapat dimediasi setidaknya sebagian oleh mesin molekuler
yang sama, mungkin melalui degradasi molekul mRNA yang dipandu oleh RNA. [ 236]

Interferensi yang dimediasi RNA (RNAi) adalah metode yang baru ditemukan untuk menentukan fungsi gen dalam
sejumlah organisme, termasuk tumbuhan, nematoda, Drosophila, ikan zebra dan tikus. Injeksi RNA untai ganda (dsRNA)
yang sesuai dengan gen tunggal ke dalam organisme membungkam ekspresi gen tertentu. Degradasi cepat mRNA pada
sel yang terkena menghambat ekspresi gen. Meskipun RNAi menjanjikan sebagai alat untuk genomik fungsional, injeksi
dsRNA mengganggu ekspresi gen secara sementara dan tidak diwariskan secara stabil. Akibatnya, penggunaan RNAi
untuk mempelajari fungsi gen pada tahap akhir perkembangan dibatasi. Hal ini sangat bermasalah untuk pengembangan
model penyakit yang bergantung pada individu pascanatal. Untuk menghindari masalah ini di Drosophila, sebuah metode
dikembangkan untuk mengekspresikan dsRNA sebagai RNA loop jepit rambut yang diperpanjang. Metode ini baru-baru ini
berhasil menghasilkan RNAi di nematoda C. elegans. RNA jepit rambut diekspresikan dari transgen yang menunjukkan
simetri angka dua dalam pola temporal dan spasial yang terkontrol. Dilaporkan bahwa transgen yang diturunkan secara
stabil memberikan interferensi spesifik ekspresi gen dalam embrio, dan jaringan yang memunculkan struktur dewasa
seperti sayap, mata, dan otak. Dengan demikian, RNAi dapat diadaptasi untuk mempelajari fungsi gen yang bekerja
terlambat di Drosophila. Keberhasilan pendekatan ini di Drosophila dan C. elegans menunjukkan bahwa pendekatan
serupa mungkin berguna untuk mempelajari fungsi gen pada organisme tingkat tinggi yang memiliki teknologi transgenik. [ 237]

RNAi ekspresi gen memfasilitasi studi genetik terbalik C. elegans ( mereview referensi 1–4 dari Clemens [ 238]).
RNAi ekspresi gen dalam menghasilkan fenotipe knock-out untuk protein tertentu dalam beberapa Drosophila garis
sel telah didemonstrasikan. Teknik ini digunakan untuk mempelajari kaskade pensinyalan dengan membedah
jalur transduksi sinyal insulin yang dikarakterisasi dengan baik. Menghambat ekspresi DSOR1
[mitogen-activated protein kinase kinase (MAPKK)] mencegah aktivasi ERK-A (MAPK) hilir. Sebaliknya,
memblokir ekspresi ERK-A menghasilkan peningkatan aktivasi DSOR1. Drosophila Aktivasi AKT (DAKT)
tergantung pada substrat IR, CHICO (IRS1–4). Memblokir ekspresi Drosophila PTEN menghasilkan aktivasi
DAKT. Dalam semua kasus, gangguan kaskade biokimia oleh RNAi konsisten dengan langkah-langkah yang
diketahui di jalur tersebut. Teknik ini diperluas untuk mempelajari dua protein, DSH3PX1 dan Drosophila

ACK (DACK). DSH3PX1 adalah SH3, protein yang mengandung domain homologi phox dan DACK homolog dengan
cdc42 tirosin kinase teraktivasi mamalia, ACK. MenggunakanRNAi, DACK didemonstrasikan sebagai hulu dari
fosforilasi DSH3PX1, membuat DSH3PX1 menjadi target / substrat hilir yang teridentifikasi dari kinase tirosin mirip
-ACK. RNAi berguna dalam membedah kaskade pensinyalan biokimia yang kompleks dan metode yang sangat efisien
untuk menentukan fungsi gen teridentifikasi yang muncul dari Drosophila pengurutan genom. [ 238]
126 5 Penemuan Obat

Di A. thaliana, teknik genetik terbalik untuk mengisolasi mutan yang sesuai dengan urutan yang diketahui, seperti
penekanan antisense, co-supresi dengan ekspresi berlebih dari gen target, gangguan gen yang ditargetkan atau
pendekatan PCR untuk skrining untuk perpustakaan penyisipan T-DNA, telah dikembangkan. Identifikasi luas dari gen
yang diekspresikan secara berbeda, gen homolog, dan protein yang berinteraksi telah menciptakan kebutuhan akan
metode yang manjur dan efisien untuk mendapatkan mutan yang hilang fungsi atau reduksi fungsinya. RNAi dengan
ekspresi gen tertentu telah diamati pada sejumlah organisme termasuk C. elegans,

tanaman, Drosophila, Trypanosoma brucei, dan seorang planarian.

Potensi RNAi dengan aktivitas gen dalam A. thaliana diselidiki. Untuk membangun vektor
transformasi yang menghasilkan RNA yang mampu membentuk dupleks, sekuens spesifik gen dalam
orientasi sense dan antisense dihubungkan, dan ditempatkan di bawah kendali promotor virus yang
kuat. A. thaliana oleh Agrobacterium-
transformasi yang dimediasi, konstruksi pengekspres dsRNA yang sesuai dengan empat gen, AGAMOUS (AG),
CLAVATA3, APETALA1 dan PERIANTHIA, menyebabkan gangguan genetik yang spesifik dan dapat diwariskan. Tingkat
keparahan fenotipe bervariasi antara garis transgenik. In situ
hibridisasi mengungkapkan korelasi antara akumulasi mRNA AG yang menurun dan fenotipe yang semakin parah pada mutan
AG (RNAi), menunjukkan bahwa mRNA endogen adalah target RNAi. Kemampuan untuk menghasilkan RNAi yang dapat
diwariskan secara stabil dan fenotipe spesifik yang dihasilkan memungkinkan untuk secara selektif mengurangi fungsi gen
dalam A. thaliana. [ 239]

RNA, tidak seperti DNA, melipat menjadi segudang struktur tersier yang bertanggung jawab atas
beragam fungsinya dalam sel. Selain perannya sebagai mediator informasi genetik dari DNA menjadi
protein, RNA berfungsi sebagai materi genetik (pada beberapa virus), sebagai komponen struktural
dari banyak partikel ribonukleoprotein (RNP) dan dalam beberapa kasus sebagai subunit katalitik dari
RNP. RNA terlipat menjadi struktur kompleks yang dapat berinteraksi secara khusus dengan protein
efektor. Interaksi ini penting untuk berbagai fungsi biologis. Untuk menemukan molekul kecil yang
dapat mempengaruhi kompleks RNA-protein penting, analisis menyeluruh dari termodinamika dan
kinetika pengikatan RNA-protein diperlukan. Hal ini dapat memfasilitasi perumusan strategi
penyaringan throughput tinggi dan pengembangan hubungan struktur-aktivitas untuk prospek
gabungan. 240]

Menariknya, RNA memiliki beberapa fungsi dan sebagai tambahan ditunjukkan bahwa urutan protein atau RNA yang
terkait dengan konformasi lipatan yang sama seringkali dapat melakukan fungsi biokimia yang sangat berbeda,
menunjukkan bahwa fungsi biokimia baru dapat muncul dari lipatan yang sudah ada sebelumnya. Urutan RNA tunggal
dijelaskan yang dapat mengasumsikan salah satu dari dua lipatan ribozim dan mengkatalis dua reaksi masing-masing.
Kedua lipatan ribozim tidak memiliki sejarah evolusi dan sama sekali berbeda, tanpa pasangan basa (dan mungkin tanpa
ikatan hidrogen) yang sama. Varian kecil dari urutan ini sangat aktif untuk satu atau lain reaksi dan dapat diakses dari
ribozim prototipe melalui serangkaian mutasi netral. Jadi, dalam perjalanan evolusi, lipatan RNA baru dapat muncul dari
lipatan yang sudah ada sebelumnya, tanpa perlu membawa urutan perantara yang tidak aktif. Hal ini meningkatkan
kemungkinan bahwa RNA biologis yang tidak memiliki kesamaan struktural atau fungsional mungkin berbagi nenek
moyang yang sama. Lebih jauh, divergensi fungsional dan struktural mungkin, dalam beberapa kasus, mendahului
daripada mengikuti duplikasi gen. [ 241]
 5 Penemuan Obat 127

Regulasi pada tingkat transkripsi dan translasi membutuhkan pemahaman molekuler tentang proses, dan
desain efektor tertentu untuk mempengaruhi transkripsi dan terjemahan. Properti seperti tRNA telah berspekulasi
untuk faktor pelepasan dalam membaca kodon berhenti dan eksperimen dirancang untuk mengidentifikasi
anticodon peptida putatif yang setara dengan faktor pelepasan. Dua faktor pelepasan translasi dari prokariota, RF1
dan RF2, mengkatalisis penghentian sintesis polipeptida pada kodon stop UAG / UAA dan UGA / UAA. Bagaimana
faktor pelepasan polipeptida ini membaca kodon stop non-identik dan identik masih membingungkan. Dasar
pengakuan ini sekarang telah dijelaskan. Pertukaran setiap domain yang dilestarikan antara RF1 dan RF2 dalam
hibrida RF1-RF2 mengarah ke identifikasi domain yang dapat mengalihkan kekhususan pengenalan. Seleksi
genetik di antara klon yang mengkodekan varian acak dari domain ini menunjukkan bahwa tripeptida Pro – Ala –
Thr dan Ser – Pro – Phe menentukan spesifisitas faktor pelepasan in vivo di RF1 dan RF2, masing-masing. Sebuah in
vitro studi pelepasan varian tripeptida menunjukkan bahwa asam amino pertama dan ketiga secara independen
membedakan basa purin kedua dan ketiga, masing-masing. Analisis dengan kodon stop yang mengandung analog
basa menunjukkan bahwa gugus amino C2 purin mungkin menjadi target utama diskriminasi G dari A. Temuan ini
menunjukkan bahwa tripeptida diskriminator dari faktor pelepasan bakteri secara fungsional setara dengan
antikodon tRNA, terlepas dari perbedaan antara protein dan RNA. [ 242]

Integrin adalah superfamili glyoprotein transmembran heterodimerik yang berfungsi dalam adhesi
seluler, migrasi, dan transduksi sinyal. Reseptor ini terdiri dari α
dan β subunit, yang berasosiasi secara non-kovalen dalam kombinasi yang ditentukan. Integrin tersebut αβ,

juga disebut sebagai reseptor vitronektin, diekspresikan pada berbagai jenis sel dan dianggap memainkan peran
kunci dalam inisiasi dan / atau perkembangan beberapa penyakit manusia, termasuk osteoporosis, stenosis ulang
setelah angioplasti koroner transluminal perkutan (PTCA) , RA, kanker dan penyakit mata. Antagonisme integrin αβ Oleh
karena itu diharapkan dapat memberikan pendekatan untuk pengobatan dan / atau pencegahan penyakit tersebut.
Beragam molekul kecil yang kuat αβ antagonis telah diidentifikasi, beberapa di antaranya aktif dalam model
penyakit, dengan demikian menunjukkan potensi terapeutik αβ antagonisme. Studi terbaru telah mengarah pada
identifikasi molekul kecil αβ antagonis dan telah divalidasi oleh studi bukti konsep in vivo. [ 243]

Protein tirosin kinase telah muncul sebagai target penting untuk intervensi terapeutik pada kanker. Ligan faktor
pertumbuhan dan reseptor tirosin kinase (RTK) masing-masing telah terbukti diperlukan untuk pertumbuhan sel tumor.
Aspek terakhir termasuk angiogenesis tumor di mana pertumbuhan tumor mengarah pada efek kompensasi pada sel
inang di lingkungan mikro tumor yang mengarah pada pertumbuhan pembuluh mikro. Pendekatan kimia sintetis digunakan
untuk memblokir RTK yang terkait dengan angiogenesis tumor sebagai sarana untuk membatasi pertumbuhan dan
penyebaran tumor manusia. [ 244]

Banyak kejadian fisiologis yang relevan secara medis bergantung pada glikokonjugat untuk kelangsungan
hidupnya. Pengakuan enzim glikoprosesing sebagai target intervensi terapeutik telah memacu perkembangan
banyak kandidat obat, termasuk obat influenza yang menghambat neuraminidase virus influenza. Penemuan
selektin menarik penelitian untuk mempelajari interaksi karbohidrat-protein dalam respon inflamasi. Pengamatan
bahwa glycoform permukaan sel diubah pada kanker tertentu telah berfungsi baik sebagai alat diagnostik dan
sebagai dasar pengembangan vaksin berbasis glikokonjugat. Pengakuan