Nama : Lilis nur awaliah

Nim : G 701 16 039

Kelas : D

Penetapan Kadar KLT- densitometri

KLT- densitometri termasuk metode yang cepat dan sederhana yang telah dikembangkan
untuk analisis kuantitatif simultan kurkumin, demetoksikurkumin dan bisdemetoksikurkumin
dalam serbuk curcuma. Akurasi dan presisinya dapat diterima (Pothitirat dan Gritsanapan,
2005) serta preparasi sampelnya yang sederhana (Liang et al., 2004).

Pengukuran absorbansi (serapan) kurkumin harus pada panjang gelombang

maksimalnya, karena pada panjang gelombang tersebut diperoleh intensitas yang maksimal.

Metode Klt-Densitometri Menurut Jurnal (1)

Kondisi KLT Densitometri

Kadar EGCG dalam sampel ditetapkan dengan menggunakan fase diam silika gel F
254, dielusi dengan fase gerak campuran n-butanol, asam asetat dan air pada perbandingan
4:1:5 (fase atas) dan dilanjutkan pembacaan kadarnya pada panjang gelombang 303 nm.
Volume sampel yang ditotolkan sebanyak 5 µl.

Ekstraksi EGCG dari krim

Metode KLT Densitometri digunakan untuk penetapan kadar EGCG dalam krim. Metode
pemisahan EGCG dari dalam krim adalah sebagai berikut : sebanyak 2 g krim ditambah 3 ml
metanol kemudian di sentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm selama 30 menit sehingga
terjadi 3 lapisan yaitu fase minyak, fase methanol-air dan endapan. Supernatan yang berupa
fase minyak dibuang sedangkan fase metanol-airnya diekstraksi kembali menggunakan
kloroform 3 ml sebanyak 3 kali. Setelah disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 30
menit maka fase airnya Validasi Metode Analisa Penetapan Kadar .... (Nining Sugihartini,
dkk) 83 kemudian ditambah metanol sampai volumenya 5 ml. Selanjutnya larutan tersebut
ditetapkan kadar EGCG dengan kondisi seperti di atas.
Validasi Metode KLT-Densitometri Menurut Jurnal (2)

Selektifitas

Ditotolkan larutan baku kerja kolkisin dalam kloroform, larutan sampel dan larutan
sampel yang telah diadisi dengan larutan baku kerja kolkisin pada lempeng KLT silika gel
GF254. Eluasi lempeng KLT dengan fase gerak kloroform:dietilamin (9:1), kloroform:
aseton:dietilamin (5:4:1) serta kloroform:metanol (9:1), kemudian dianalisis dengan KLT-
densitometer.

Diamati noda analit dalam sampel yang mempunyai faktor retensi (Rf) sama dengan
kolkisin baku, diperiksa kromatogram dan spektra analit menggunakan densitometer. Dipilih
fase gerak yang dapat memisahkan dengan baik noda kolkisin dari noda lain didekatnya, dan
dipilih panjang gelombang maksimum kolkisin pada spektra yang diamati.

Linieritas

Larutan baku kolkisin 10ppm – 1000ppm ditotolkan sebanyak 5 l pada lempeng KLT
silika gel GF254, kemudian dieluasi dengan fase gerak kloroform:dietilamin (9:1). Diukur
area pada panjang gelombang terpilih kemudian dibuat kurva baku hubungan antara
konsentrasi kolkisin dengan area.

Berdasarkan area terukur (y) pada berbagai kadar baku kerja kolkisin (x), maka dapat
dihitung harga koefisien korelasi (r). Bila ada hubungan linier antara y dengan x maka
dihitung persamaan garis regresi (y = bx+a)

Akurasi

Dibuat larutan baku kolkisin 200 ppm, 250 ppm dan 300 ppm dari larutan baku induk
kolkisin 500 ppm dalam pelarut air suling. Diadisikan 2,0 ml larutan baku kolkisin (dalam
pelarut air suling) ke dalam 2,0 ml suspensi sampel sebelum diproses sesuai dengan cara
preparasi sampel.
 Larutan ekstrak sampel yang diperoleh ditotolkan ke pada lempeng KLT sebanyak 5
mikroliter. Dieluasi menggunakan fase gerak kloroform:dietilamin (9:1). Diamati area
kolkisin pada panjang gelombang terpilih menggunakan densitometer. Dihitung % perolehan
kembali berdasarkan kurva baku.

Presisi Instrumen

Sebanyak 5 l larutan baku kolkisin 400 ppm (dalam kloroform) ditotolkan sebanyak
10 kali, masing-masing dengan jarak 1 cm pada pada lempeng KLT silika gel GF254 .
Selanjutnya dieluasi dengan fase gerak kloroform:dietilamin (9:1). Diamati area kolkisin
pada panjang gelombang terpilih menggunakan densitometer. Kemudian dihitung area rata –
rata, deviasi baku (SD), dan koefisien variasi (KV).

Metode KLT-densitometri Menurut jurnal (3)

Alat yang digunakan adalah Seperangkat alat KLT-Densitometri (CS 9301 PC dual
wavelight flying spot scanning densitometer), neraca analitik, seperangkat alat gelas,
sonifikator, mikropipet 0,5-10µL, dan mikroppet 100-1000µL.

Bahan yang digunakan Jika tidak dinyatakan lain reagen yang digunakan pro analysis
dari Merck. Produk berbasis kurkumin yaitu sampel D1 (120 mg ekstrak Curcuma domestica)
dan sampel D2 (75 mg ekstrak Curcumae Rhizoma), Kurkuminoid (purity 80%) Sigma
Aldrich, plat KLT silika GF254, Metanol teknis (Brataco), Metanol, Chloroform, Benzen,
kertas saring, dan alumunium foil.

2.1 Jalannya Penelitian

 Keseragaman Bobot: Ditimbang masing-masing sampel 20 kapsul produk obat herbal

berbasis kurkumin merek D1 dan D2, dicatat dan dievaluasi hasil keseragaman
bobotnya menggunakan uji statistik dengan syarat RSD < 5% dan syarat
keseragaman bobot pada FI IV.
 Optimasi Fase Gerak KLT: Optimasi fase gerak dilakukan dengan menotolkan
sampel (produk) dan standar kurkuminoid pada plat KLT sebanyak 2 µL, kemudian
dielusi dengan fase gerak A (kloroform: benzen: metanol 80:15:5) diperoleh Rf
 kurkumin 0,6 (Pothitirat dan Gritsanapan, 2005) dan fase gerak B adalah modifikasi
dari fase gerak A yaitu (kloroform: benzene: metanol 75:15:10).
 Pembuatan Larutan Stok Kurkumin 0,5% dan 5%: Ditimbang dengan seksama
kurang lebih 50 mg dan 500 mg standar kurkuminoid, kemudian dilarutkan dengan
metanol hingga volume tepat 10 mL dan disonikasi dalam ultrasonic bath selama ±10
menit.
 Pembuatan Kurva Baku: Kurva baku kurkumin dibuat dengan kadar 0,020%;
0,040%; 0,060%; 0,08%; 0,10%; 0,12%; dan 0,140% dari larutan stok kurkumin
0,5%. Masing-masing ditotolkan 2 μL. Luas area yang diperoleh dicatat. Dan
dihitung regresi liniernya untuk memperoleh kurva baku, luas area sebagai sumbu Y
dan konsentrasi sebagai sumbu X.
 Preparasi Sampel: Ditimbang dengan seksama masing-masing produk D1 dan D2,
dimasukkan ke dalam labu takar 5 mL. Ditambahkan metanol p.a hingga volume
tepat 5 mL dan disonikasi pada ultrasonik bath selama ±10 menit kemudian disaring.
 Perhitungan Kadar: Luas area yang diperoleh dimasukkan pada kurva baku sebagai
nilai Y. Nilai X dikalikan faktor pengenceran (fp) bila ada, dan diperoleh kadar
kurkumin dalam % bobot per volume. Nilai tersebut dikonversikan menjadi kadar
kurkumin dengan membagi bobot penimbangan awal dan dikalikan bobot rata-rata
dari keseragaman bobot yang diperoleh sebelumnya.

2.2 Parameter Akurasi dan Presisi

Akurasi: Penetapan akurasi dilakukan dengan menambakan standar kurkuminoid 5%,

yaitu dengan penambahan 3 level konsentrasi pada sampel, yaitu dengan penambahan zat
aktif 80%, 100%, 120%. Kemudian ditotolkan pada plat KLT, dielusi dengan fase gerak yang
sesuai dan dibaca dengan densitometer pada panjang gelombang maksimal. Hasil yang
diperoleh dihitung persen perolehan kembali (%recovery) menggunakan persamaan (2)
beserta nilai RSD, kemudian dibandingkan dengan standar keberterimaan parameter akurasi.
 Keterulangan (intraday precision): Penetapan keterulangan dilakukan dengan
menimbang sejumlah sampel (sesuai dengan prosedur) dilakukan sebanyak tujuh kali,
kemudian ditotolkan pada plat KLT, dielusi dengan fase gerak yang sesuai dan dibaca dengan
densitometer pada panjang gelombang (λ) maksimal. Hasil yang diperoleh dihitung kadarnya
dengan memasukkan nilai luas area ke dalam persamaan regresi linier dan dihitung nilai RSD
nya. Parameter ini dilakukan pada hari yang sama dan kriteria keberterimaannya adalah jika
nilai RSD < 2%.

Presisi antara (interday precision): Penetapan presisi antara dilakukan dengan

menimbang sejumlah sampel (sesuai dengan prosedur) dilakukan sebanyak tujuh kali,
kemudian ditotolkan pada plat KLT, dielusi dengan fase gerak yang sesuai dan dibaca dengan
densitometer pada panjang gelombang (λ) maksimal. Hasil yang diperoleh dihitung kadarnya
dengan memasukkan nilai luas area ke dalam persamaan regresi linier dan dihitung nilai RSD
nya. Parameter ini direplikasi sebanyak 3 kali dan dilakukan pada 3 hari yang yang berbeda.
Kriteria keberterimaannya adalah jika nilai RSD < 2%.

Daftar Pustaka

Hanwar, D. (2018). Validasi Metode KLT-Densitometri untuk Penetapan Kadar Kurkumin

pada Produk Obat Herbal Berbasis Curcuma sp.). The 7th University Research
Colloqium 2018 STIKES PKU Muhammadiyah Surakarta

Hayun, Mulia Ade Karina. (2016). Pengembangan dan Validasi Metode KLT-Densitometri
untuk Analisis secara simultan Parasetamol, Asam Mefenamat dan Ibuprofen dalam
Jamu “Pegel Linu”. Fakultas Farmasi Universitas Indonesia

Hilmi. A. Dkk. (2013). Validasi metode Kromatografi Lapis Tipis-Densitometri untuk

penetapan kadar kolkisin dalam infus daun kembang sungsang (Gloriosa superba
Linn.). Departemen Kimia Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Airlangga

Liang, Y.Z. Xie, P. Chan, K.(2004). Quality control of herbal medicines.Journal of

Chromatography B. 812(1-2):53–70.