Pemurnian

Fakultas Farmasi-BKU, Desember 2020

Pemurnian
Metode

➢ Kristalisasi
Metode untuk ➢ Pengendapan
mendapatkan ➢ KLT preparatif
senyawa/isolat ➢ KKt preparatif
murni ➢ Kolom kromatografi
➢ KCKT Preparatif
➢ Sublimasi
➢ Metode lain …
Perbedaan Diskusi (1)

PEMURNIAN/ ISOLASI

UJI KEMURNIAN
?
Kristalisasi
 Diskusi (2)

CONTOH SENYAWA YANG

DI PROSES MELALUI
KRISTALISASI
?
Teknik Kristalisasi

Beberapa senyawa mudah terbentuk kristal

1. Rekristalisasi

Sejumlah kristal
dilarutkan dlm
Pelarut dibiarkan
pelarut tertentu menguap

kristal
terbentuk
Recrystallization

The most commonly used procedure for purification of a

solid material by Recrystallization from solution involves
the following step

1. The impure material is dissolved in a suitable solvent to

form a near-saturated solution
2. The hot solution is filtered to remove any insoluble
particles
3. It is allowed to cool so that the dissolved substances
criystallises out
4. The crystals are separated from mother liquor
5. They are washed free from mother liquor with little fres
cold solvent, then dried
2. Pencucian (a)

Sejumlah kristal
dilarutkan dlm Pengotor tidak larut
pelarut tertentu

Disaring
Kristal dalam larutan

Kristal Pelarut dibiarkan

terbentuk menguap
2. Pencucian (b)

Sejumlah kristal
dilarutkan dlm kristal tidak larut
pelarut tertentu

Disaring
Kristal dalam bentuk padat

Dibilas pelarut
Kristal segar
3. Pengendapan kristal
Ubah kepolaran kristal dengan
Sejumlah kristal menambahkan sejumlah pelarut
dilarutkan dlm lain (ii) dengan kepolaran yg
pelarut tertentu sangat berbeda dengan kepolaran
(i) pelarut pertama (i)

Kristal akan mengendap

Kristal
Pelarut untuk
Kristalisasi

Shriner, 2004
Pelarut untuk
Kristalisasi

Shriner, The systematic Identification of organic compound (2004, P 51)

Choice of solvent
The best solvent for recrystallization have these properties:

1. The material much more soluble at higher

temperatures than it is at room temperature or
below
2. .Well-formed crystals are produced
3. .Impurities are either very soluble or only sparingly
soluble
4. The solvent must no reaction between the solvent and
the substance being purified
5. There must be not be inconveniently volatil or too highly
flammable.
Fraksi hasil KK (298-300)

UV ʎ 254 nm DPPH 0,2%

Fase diam = silika gel F254

Fase gerak = kloroform-metanol-asam format (8:1:200 µL)

Fraksi gabungan = fraksi hasil KK no 298-300

Hasil KK 377-388

Proses Pemekatan
(Labu Rotary vaporator)
 UV ʎ 254 nm H2SO4 10% H2SO4 10% (UV ʎ 365 nm)

Fase diam = silika gel F254

Fase gerak =
Kloroform-metanol-asam format (8:1,5:200 µL)

Gabungan no 377-388 = fraksi hasil KK

H2SO4 10% DPPH 0,2%

Pengendapan serbuk amorf

Beberapa senyawa mudah mengendap membentuk

serbuk amorf

1. Penguapan pelarut

Sejumlah serbuk
dilarutkan dlm
Pelarut dibiarkan
pelarut tertentu menguap

Endapan
amorf
2. Pencucian (a)

Sejumlah serbuk
dilarutkan dlm Pengotor tidak larut
pelarut tertentu

Disaring
serbuk dalam larutan

Serbuk amorf Pelarut dibiarkan

terbentuk menguap
2. Pencucian (b)
Sejumlah serbuk
dilarutkan dlm serbuk tidak larut
pelarut tertentu

Disaring
Serbuk dalam bentuk padat

Dibilas pelarut
Serbuk amorf
segar
Kromatogram Hasil KCV (Isolasi Steviosid)
Kristal (Isolasi Steviosid)
Pencucian Kristal (Isolasi Steviosid)
Pemantauan Kristal (Isolasi Steviosid)

Fase diam : Silika gel 60 F254 pra salut

Pengembang : etilasetat- metanol-asam asetat (6:3:1)

Penampak bercak : Liebermann-Burchard (LB)

Keterangan:

C1 Pencucian pertama
C2 Pencucian ke dua
St13 Glikosida Steviol hasil dari fraksi 13
St Pembanding steviosid (USP)
AL (Alergon®) mengandung Rebaudioside
3. Pengendapan serbuk

Sejumlah serbuk Dibiarkan dlm beberapa

dlm pelarut waktu/ sentrifuse -- sampai
endapan terpisah
tertentu

Serbuk amorf
 Diskusi (3)

?
BEDA SERBUK
DAN KRISTAL
 Pemurnian
dengan kromatografi lapis tipis
Kromatografi lapis tipis

Kualitatif
Tujuan Penggunaan Kuantitatif
Preparatif/Isolasi
 Diskusi (4)

Berikan contoh penggunaan KLT

a. Kualitatif
b. Kuantitatif
c. Isolasi
Jenis Silika gel
➢ Silika gel G

➢ Silika Gel S

➢ Silika gel GF254 → F254

➢ Silika gel H / silika gel N Bedanya ?
➢ Silika gel 60

➢ Silika Gel F254

➢ Silika gel PF254+366

Silika gel 60 H

▪ Dapat digunakan untuk

Kromatografi Cair Vakum (KCV)

• Untuk pembuatan Plat KLT/TLC

Perlu ditambahkan pengikat
Silika gel 60 F254

• Untuk pembuatan Plat

KLT/TLC Sudah Mengandung
Pengikat
Silika gel 60 PF254

• Untuk pembuatan Plat

KLT/TLC Sudah Mengandung
Pengikat
Perbandingan penjerap-air

Gritter, Bobbit, Pengantar Kromatografi (Terjemahan) (1991, hal 121)

Pembuatan plat KLT preparatif
 Kaca
Bubur silika (20 x 20 cm)

Stahl-Desaga®

Ketebalan :
0,1- 0,25 mm → Analitik
1,0- 2,0 mm → Preparatif
Plat di keringkan dan diaktivasi (oven, 110 °C selama 30 menit)
KLT Preparatif (1)

1. Siapkan bejana KLT (chamber)

2. Lapisi bejana dengan kertas saring
3. Siapkan fase gerak/pengembang (tunggal/campuran)
4. Masukan pengembang ke dalam bejana dan tutup rapat.
Biarkan bejana jenuh dengan uap pengembang
5. Sejumlah fraksi/subfraksi kental dilarutkan dalam beberapa
mL pelarut sampai diperoleh ekstrak yang tidak terlalu kental
dan tidak terlalu encer.
6. Totolkan fraksi/subfraksi secara tidak terputus pada
pelat KLT preparatif dengan menggunakan pipa kapiler,
sehingga berbentuk pita (lebar pita maksimum 5 mm)
 Diskusi (5)

Tujuan Penjenuhan
chamber ?
Penjenuhan chamber (bejana KLT)
Penjenuhan chamber (bejana KLT)

Shriner, The systematic Identification of organic compound (2004, P 88)

Penotolan sampel Diskusi

Shriner, The systematic Identification of organic compound (2004, P 88)

KLT Preparatif (2)
7. Biarkan totolan mengering (pelarut menguap)
8. Masukan pelat yg sudah ditotolkan ke dalam bejana.
(Perhatian tinggi permukaan pengembang dalam bejana harus
lebih rendah dari pada totolan bercak)
9. Biarkan pengembang naik sampai sekitar 1-2 cm sebelum
pinggir pelat
10. Angkat pelat, biarkan pelat mengering (pelarut menguap)
11. Lihat warna-warna pita secara visual atau di bawah lampu
ultraviolet.
Jika pita tidak berwarna atau berflouresensi di bawah lampu
uv, → semprot bagian pinggir dan kanan dengan penampak
bercak universal asam sulfat 10%(MeOH), atau lainnya.

(Pada waktu menyemprot bagian pinggir kiri dan kanan pelat,

tutup bagian tengah pelat)
Kromatogram lapis tipis Preparatif

Sinar tampak UV λ 254 nm UV λ 365 nm

Foto KLT (Koleksi B Ani)

KLT Preparatif (3)

12. .Kerok pita senyawa yang akan diisolasi, kumpulkan

pada suatu wadah
13. Masukan pelarut tertentu ke dalam wadah yg berisi kerokan
pita, aduk, sehingga senyawa yang akan diisolasi larut
sedangkan serbuk silika gel tidak larut
14. .Saring dengan kertas saring, sehingga sebagian besar
serbuk silika gel akan tertahan di kertas saring
15. Ulangi penyaringan berkali-kali dengan kapas, sehingga tidak
terdapat partikel serbuk silika gel dalam larutan senyawa.
16. .Uapkan pelarut dan lakukan uji kemurnian isolat yang
diperoleh
Pengerokan Pita KLT diskusi

Spatula

PLAT
Kromatografi Kertas

Kualitatif
Tujuan Penggunaan
Preparatif/Isolasi
Kromatografi kertas Preparatif

1. Siapkan bejana (chamber)

2. Lapisi bejana dengan kertas saring
3. Siapkan fase gerak/pengembang (tunggal/campuran)
4. Masukan pengembang ke dalam bejana dan tutup rapat.
Biarkan bejana jenuh dengan uap pengembang
5. Sejumlah fraksi/subfraksi kental dilarutkan dalam beberapa
mL pelarut samapai diperoleh ekstrak yang tidak terlalu
kental dan tidak terlalu encer.
6. Totolkan fraksi/subfraksi secara tidak terputus pada
pelat KLT preparatif dengan menggunakan pipa kapiler,
sehingga berbentuk pita (lebar pita maksimum 5 mm)
Kromatografi kertas Preparatif

7. Biarkan totolan mengering (pelarut menguap)

8. Masukan pelat yg sudah ditotolkan ke dalam bejana.
(perhatian tinggi permukaan pengembang dalam bejana harus
lebih rendah dari pada totolan bercak)
9. Biarkan pengembang naik sampai sekitar 1-2 cm sebelum
pinggir pelat
10. Angkat pelat, biarkan pelat mengering (pelarut menguap)
11. Lihat warna-warna pita secara visual atau di bawah lampu
ultraviolet. Jika pita tidak berwarna atau berflouresensi di
bawah lampu uv, semprot bagian pinggr dan kanan
dengan penampak bercak (pada waktu menyemprot
bagian ppinggor kiri dan kanan pelat tutup bagian tengan
pelat
Kromatografi kertas Preparatif

12. .Gunting pita senyawa yang akan diisolasi, kumpulkan

pada suatu wadah
13. .Masukan pelarut tertentu ke dalam wadah yg berisi
potongan pita, aduk, sehingga senyawa yang akan diisolasi
larut sedangkan serbuk silika gel tidak larut
14. .Saring dengan kertas saring, sehingga sebagian besar
serbuk silika gel akan tertahan di kertas saring
15. .Ulangi penyaringan berkali-kali dengan kapas, sehingga
tidak terdapat partikel serbuk silika gel dalam larutan
senyawa.
16. .Uapkan pelarut dan lakukan uji kemurnian isolat yang
diperoleh
Sublimasi

 Sublimation differs from ordinari distillation because the

vapour condenses to a solid instead of a liquid

 Usually the pressure in in the heated system is

diminished by pumping, and the vapour is condensed
(after travelling a relatively short distance) on to a cold
finger or some other cooled surface
 Diskusi (6)

Berikan 5 contoh senyawa metabolit sekunder yang dapat

menyublim…
Alat Sublimasi
Alat sederhana
https://www.youtube.com/watch?v=qJLvB6NFnoA

Terimakasih