PK ASAM MEFENAMAT – HPLC

I. PROSEDUR KERJA
Alat : HPLC, injector, timbangan analitik, labu ukur, mikropipet, vial, filter
(0,45 µm), corong, pipet volume, botol timbang, batang pengaduk
Bahan : Asam mefenamat, Aqua pro HPLC, metanol
Prinsip kerja :
1. Pembuatan baku induk Asam mefenamat
2. Pembuatan baku kerja Asam mefenamat
3. Penetapan kadar sampel Asam mefenamat

Alat-Alat HPLC

a. Microprosesor control
Bagian ini merupakan mikro komputer, suatu bagian yang sangat penting untuk
mengontrol atau membuat program mengatur kecepatan aliran pelarut (flow rate)
sebagaimana yang diinginkan, mengatur tekanan (pressure), mengatur komposisi
(perbandingan) pelarut, mengatur suhu injektor dan jumlah sampel yang akan
diinjeksikan bila menggunakan "automatic injection", mengatur suhu oven termasuk
suhu kolom, mengatur panjang gelombang pada detektor dan memprogram waktu
analisa yang diperlukan apabila menggunakan HPLC sistem gradien.

b. Reservoir fase gerak dan sistem treatment pelarut

Peralatan KCKT modern dilengkapi dengan satu atau beberapa reservoir pelarut
yang terbuat dari kaca atau stainless steel yang mampu memuat 200 sampai 1000 mL
pelarut. Reservoir dilengkapi dengan suatu alat degasser yang dapat menghilangkan
gas terlarut pada fase gerak (biasanya oksigen dan nitrogen) yang mengganggu analisis
karena dapat membentuk gelembung pada kolom dan system detector. Degasser terdiri
dari suatu pompa vakum, sistem destilasi, alat pemanas dan suatu system pengaduk
pelarut.
 Gambar : Prinsip kerja degasser dan alat degasser

Reservoir juga dilengkapi dengan penyaring milipore yang mampu menyaring

partikel-partikel halus pada pelarut. Hal ini penting karena partikel halus dapat
menimbulkan kerusakan (menyumbat) system injector, pompa dan juga kolom.
Biasanya sebelum dimasukkan ke dalam reservoir pelarut fase gerak disaring dengan
penyaring milipore dalam kondisi vakum.

Gambar : Seperangkat alat penyaring

c. Pompa
Berbagai pompa tersedia untuk kromatografi cair, semuanya dirancang untuk
mendorong berbagai pelarut melalui kolom yang dikemas rapat. Karena tekanan kolom
terhadap aliran tinggi maka pompa harus bekerja pada tekanan tinggi, sering kali lebih
besar dari 1000 psi.
Beberapa persyaratan sistem pompa KCKT :
1. Memberikan tekanan yang tinggi
2. Bebas dari pulse
3. Memberikan kecepatan aliran 0,1 – 10 ml/menit
4. Aliran terkontrol dengan reprodusibilitas kurang dari 0,5%
5. Tahan karat, oleh karena itu seal pompa terbuat dari bahan baja atau teflon
6. Dapat memberikan aliran sistem isokratik maupun gradient

d. Kolom
 Kolom umumnya dibuat dari stainless steel, dengan bentuk lurus dan biasanya
dioperasikan pada temperatur kamar. Kolom dapat dipanaskan agar dihasilkan
pemisahan yang lebih efisien, akan tetapi suhu di atas 60o jarang digunakan, karena
dapat menyebabkan terjadi penguraian fase diam ataupun penguapan fase gerak pada
suhu yang lebih tinggi tersebut. Pengepakan kolom tergantung pada model KCKT yang
digunakan (Liquid Solid Chromatography, LSC; Liquid Liquid Chromatography, LLC;
Ion Exchange Chromatography, IEC, Exclution Chromatography, EC).
e. Oven
Column oven akan mengkondisikan suhu supaya temperatur solvent maupun
sample berada pada range yang sesuai. Di lain module, detector UV-Vis melakukan
recording ketika base line maupun ketika sample sudah injeksikan dan melewati kolom.
Berbagai pengaturan maupun setting pada instrument HPLC biasanya dikendalikan oleh
pengguna melewati software atau antar muka gui. Output dari hasil pemeriksaan yang
ditangkap oleh detector akan ditampilkan dalam bentuk grafik di komputer.
f. Detektor
Detektor pada KCKT dikelompokkan dalam 2 golongan yaitu:
 Berdasarkan pengukuran diferensial suatu sifat yang dimiliki baik oleh molekul
sampel maupun fase gerak (bulk property detector).
Detektor ini dapat dibedakan menjadi:
a. Detektor Indeks Bias
Detektor indeks bias merupakan detektor yang juga luas penggunaannya
setelah detektor ultraviolet. Dasarnya ialah pengukuran perbedaan indeks bias
fase gerak murni dengan indeks bias fase gerak yang berisi komponen sampel,
sehingga dapat dianggap sebagai detektor yang universal pada HPLC. Detektor
ini kurang sensitif dibanding dengan detektor ultraviolet dan sangat peka
 terhadap perubahan suhu.
b. Detektor konduktivitas
c. Detektor tetapan dielektrika
 Berdasar pengukuran suatu sifat yang spesifik dari molekul sampel (disebut solute
property detector) seperti penyerapan sinar UV, fluoresensi dll.
g. Injektor
Injektor adalah tempat memasukkan sampel dan kemudian sampel dapat
didistribusikan masuk ke dalam kolom. Terdapat tiga tipe dasar injector yang bisa
digunakan dalam KCKT.
1. Injektor septum
Penyuntikan cuplikan dengan memasukkan cuplikan itu ke dalam syringe
dan menusukkan jarum syringe melalui septum elastomer merupakan cara
penyuntikan pada kolom yang paling sederhana. Injektor septum pada
kromatografi cair merupakan injektor paling murah, tetapi memerlukan
perhatian yang lebih. Septum berkontak dengan pelarut bertekanan tinggi,
karena itu kita harus memilih bahan septum yang tidak termakan oleh pelarut.
2. Penyuntikan aliran henti
Penyuntikan pada bagian atas kolom menghasilkan kromatografi yang
sangat efisien. Injektor aliran henti dirancang untk memungkinkan penempatan
cuplikan langsung pada bagian atas (pangkal) kolom. Volum penyuntikan harus
kecil untuk mencegah agar proses kromatografi tidak dimulai dengan pita yang
lebar.
3. Katup kitar atau pipa dosis (loop valve)
Prinsip kerja katup kitar, dimana pada saat awal sampel akan masuk
memenuhi volume loop terlebih dahulu dan akhirnya segera masuk menuju
kolom pemisahan dengan volume yang tidak berkurang sedikitpun. Pada saat
sampel diinjeksikan maka sampel tidak langsung masuk ke dalam kolom, tapi
akan memenuhi pipa dosis, terlebih dahulu. Pipa dosis ini mempunyai ukuran
volum yang bermacam- macam dari 5 ul – 2000ul. Volume sampel yang
diinjeksikan sebaiknya 5 kali dari volume pipa dosisnya.
h. Recorder dan Data processing
Recorder adalah alat yang paling sederhana untuk mencatat setiap sinyal yang
muncul pada detektor untuk dirubah dalam bentuk kurva atau lebih dikenal dengan
kromatogram. Tinggi rendahnya kurva didasarkan pada pulsa listrik yang diterima.
Kadang- kadang rekorder digabungkan dengan suatu sistem komputer untuk analisa
data atau data prosesor dalam bentuk yang kompak dan dikenal sebagai "Data
Prosesor".

Cara Kerja HPLC

 Diagram diatas menunjukkan komponen utama yang terdapat pada HPLC. Larutan
sampel diinjeksikan melalui injektor (3) dan terbawa oleh fase gerak (1) melewati fase
diam pada kolom (5), kemudian hasilnya dibaca oleh detektor (6) dan ditampilkan pada
pengolah data (7) sebagai kromatogram.

II. LANGKAH KERJA

1. Pembuatan Baku Induk Asam Mefenamat
 Ditimbang baku Asam mefenamat (p.a) sejumlah tertentu ..... g
 Ditimbang di timbangan analitik ....... g
 Dilarutkan dengan fase geraknya (aquadem pro HPLC) secukupnya,
kemudian dipindahkan ke dalam labu ukur 100,0 mL
 Kocok ad homogen
2. Pembuatan Baku Kerja Asam Mefenamat
 Dipipet larutan baku induk sejumlah tertentu (μL), dimasukkan ke dalam vial
 Ditambahkan sejumlah tertentu fase gerak ke dalam vial tersebut
 Disaring dengan menggunakan filter holder masuk ke dalam vial yang baru
 Masing-masing konsentrasi baku kerja disuntikkan pada HPLC, diamati
areanya
3. Penetapan Kadar Sampel Asam Mefenamat
 Sampel tablet yang mengandung asam mefenamat 50,4 mg, digerus ad
homogen, kemudian ditimbang sejumlah tertentu, dilarutkan dalam metanol
secukupnya dan dipindahkan secara kuantitatif ke dalam labu ukur 100,0 mL
 Ditambahkan metanol sampai tanda 100,0 mL
 Dipipet 1,0 mL sampel diatas, kemudian ditambah pelarut secukupnya,
dipindahkan secara kuantitatif ke dalam labu ukur 50,0 mL
 Ditambahkan metanol sampai tanda labu ukur 50,0 mL
 Ulangi 3X replikasi
 Masing-masing konsentrasi disuntikkan ke HPLC untuk diamati areanya
III. PERHITUNGAN

Diketahui = baku kerja

RT = Retention Time
C [ppm] Rt area
1 4,213 998800
2 4,196 2011500
5 4,207 4897000
8 4,221 8001300
10 4,189 9991400

Sampel tablet mengandung asam mefenamat ditimbang (I) 50,4 mg dilarutkan metanol
tepat 100,0 mL, dipipet 1,0 mL ditambah pelarut 50,0 mL saring dan suntikkan ke HPLC
didapatkan data sebagai berikut:

Puncak 1 Puncak 2
Replikasi Bobot Rt Area
Rt Area
I 100,4 2,715 1770450 4,199 4037450
II 105,6 2,698 1897600 4,205 4900380
III 201,5 2,708 2807600 4,218 8600500

Berapa kadar asam mefenamat dalam sampel tablet?

JAWAB :
Dari C baku kerja vs Area, didapatkan y = 999170x - 15684
a = -15684
b = 999170
r2 = 0,9999
r = 0,9999499987

Dilakukan penetapan kadar sampel

Replikasi I
100,4 mg + metanol ad 100,0 ml = 100,4 mg / 100 mL = 1004 bpj (mg/L)
1,0 mL
x 1004 bpj=20,08 bpj  menggunakan area = 4037450
50,0 mL

Dimasukkan ke persamaan garis sumbu y

 y=999170 x−15684
4037450=999170 x−15684
X = 4,056500896 bpj
4,056500896
x= x 100 %=20,20 %
20,08

Replikasi II
105,6 mg + metanol ad 100,0 ml = 105,6 mg / 100,0 mL = 1056 bpj
1,0 mL
x 1056 bpj=21,12 bpj  menggunakan area = 4900380
50,0 mL

Dimasukkan ke persamaan garis sumbu y

y=999170 x−15684
4900380=999170 x−15684
x=4,920147723bpj
4,920147723
x= x 100% = 23,30%
21,12

Replikasi III
201,5 mg metanol ad 100,0 ml = 201,5 mg / 100,0 mL = 2015 bpj
1,0 mL
x 2015 bpj=40,3 bpj  menggunakan area = 8600500
50,0 mL

Dimasukkan ke persamaan garis sumbu y

y=999170 x−15684
8600500=999170 x−15684
x=8,623341373 bpj
8,623341373
x= x 100% = 21,40%
40,3

IV. PENETAPAN KADAR

Larutan baku timbang seksama sejumlah asam mefenamat BPFI, larutkan dalam fase
gerak jika perlu encerkan secara kuantitatif dan bertahap dengan fase gerak hingga kadar
lebih kurang 0,2 mg/ml
Larutan uji timbang seksama lebih kurang 100 mg zat, masukkan dalam labu 500 ml,
larutkan dan encerkan dengan fase gerak sampai tanda.
System kromatografi kromatografi cair kinerja tinggi dilengkapi dengan detector 254 nm
dan kolom 25 cm x 4,6 mm berisi bahan pengisi LI. Laju air lebih kurang 1,0 ml/menit.
Lakukan kromatografi terhadap larutan baku, rekam kromatogram dan ukur respon puncak
seperti tertera pada prosedur efisiensi kolom tidak kurang dari 8200 lempeng teoritis;
factor ikutan tidak lebih dari 1,6 dan simpangan baku relative pada penyuntikan ulang
tidak lebih dari 1,0%.
Prosedur suntikkan secara terpisah sejumlah volume sama (lebih kurang 10µl) larutan
baku dan larutan uji kedalam kromatograf, rekam kromatograf dan ukur respon puncak
utama. Hitung jumlah dalam mg asam mefenamat dalam zat dengan rumus

C adalah kadar asam mefenamat BPFI dalam mg/ml larutan baku; ru dan rs berturut-turut
adalah respon puncak larutan uji dan larutan baku.