2013 SOPBuku Identifikasi Molekuler Influenza Final

See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.
net/publication/333561281
Panduan Instruksi Kerja Identiﬁkasi Molekuler Virus Inﬂuenza
Book · April 2013
CITATIONS READS
0 6,608
5 authors, including:
Naning Agustiningsih Arie Ardiansyah Nugraha

Ministy of Health, Republic of Indonesia National Institute of Health Research and Development
24 PUBLICATIONS 31 CITATIONS 3 PUBLICATIONS 2 CITATIONS
SEE PROFILE SEE PROFILE
Vivi Setiawaty
National Institute of Health Research and Development, Ministry of Health, Indon…
121 PUBLICATIONS 576 CITATIONS
SEE PROFILE
Some of the authors of this publication are also working on these related projects:
Epidemiology and Virology of Influenza B in Indonesia View project
Arboviruses surveillance View project
All content following this page was uploaded by Vivi Setiawaty on 02 June 2019.
The user has requested enhancement of the downloaded file.

SOP
STANDARD OPERATING PROCEDURES
PANDUAN INSTRUKSI KERJA
IDENTIFIKASI MOLEKULER VIRUS INFLUENZA
LABORATORIUM VIROLOGI
NATIONAL INFLUENZA CENTER
PUSAT BIOMEDIS DAN TEKNOLOGI DASAR KESEHATAN
BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN
KEMENTERIAN KESEHATAN INDONESIA
i
ii
iii
iv
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR ............................................................................................................. iii

TIM PENYUSUN.....................................................................................................................iv
DAFTAR ISI.............................................................................................................................. v
BAB 1. PENDAHULUAN ..................................................................................................... 1
BAB 2. TATA CARA KEAMANAN DI LABORATORIUM ............................................. 3
BAB 3. LAY OUT (CONTOH) DAN ALUR KERJA LABORATORIUM PCR ................ 5
BAB 4. PENATALAKSANAAN DAN PENANGANAN SPESIMEN FLU BURUNG DI
LABORATORIUM ................................................................................................... 8
BAB 5. PENGGUNAAN BIOLOGICAL SAFETY CABINET (BSC) ................................ 9
BAB 6. PENATALAKSANAAN EKSTRAKSI RNA ........................................................ 11
BAB 7. PENATALAKSANAAN EKSTRAKSI RNA ........................................................ 14
BAB 8. PROSEDUR KUALITATIF KONVENSIONAL/GEL ONE STEP RT-PCR ........ 17
BAB 9. PROSEDUR KUANTITATIF ONE STEP REAL TIME RT-PCR ........................ 21
BAB 10. PROSEDUR KUANTITATIF ONE STEP REAL TIME RT-PCR UNTUK VIRUS
H7N9 ....................................................................................................................... 23
BAB 11. PENGOPERASIAN MESIN THERMAL CYCLER CHROMO4, BIORAD ....... 26
BAB 12. PENGOPERASIAN MESIN THERMAL CYCLER BIORAD C-1000 ............... 32
BAB 13. PENGOPERASIAN MESIN THERMAL CYCLER BIORAD IQ5 ...................... 36
BAB 14. PEMBUATAN GEL UNTUK ANALISA HASIL KUALITATIF RT-PCR (GEL
ELEKTROFORESIS) ............................................................................................. 40
BAB 15. PENGGUNAAN APPARATUS ELEKTROFORESIS .......................................... 41
BAB 16. PENGGUNAAN ALAT DOKUMENTASI HASIL PCR ...................................... 44
BAB 17. PENUTUP ............................................................................................................... 49
BAB 18. KEPUSTAKAAN ................................................................................................... 50
LAMPIRAN ............................................................................................................................. 51
v
BAB 1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Influenza adalah penyakit menular yang menyerang saluran pernapasan manusia.

Penyakit ini sering mewabah dan mengakibatkan pandemi. Pada anak-anak dan orang
dewasa, influenza adalah penyakit yang bisa sembuh tanpa pengobatan dalam kurun waktu
satu minggu. Tetapi, bagi orang yang tidak sehat atau daya tahannya menurun, influenza bisa
berakibat fatal. Tanda-tanda yang disebutkan di atas bisa menjadi sangat parah, dan mungkin
terjadi komplikasi seperti pneumonia, sinusitis, dan radang dalam telinga.
Beberapa kejadian infeksi oleh virus influenza yakni oleh H5N1 menjadi perhatian
dunia dengan angka kematiannya yang di atas 50%, walaupun kasus tersebut belum
mengalami pandemi. Pada tahun 2008, WHO mengumumkan terjadinya pandemi dengan
kemunculan virus Influenza H1N1 baru sebagai hasil mutasi dari virus manusia, babi, dan
burung.
Pengamatan epidemi flu burung di Asia Tenggara menunjukkan bahwa tidak selalu
mungkin untuk membedakan klinis influenza manusia yang disebabkan oleh virus influenza
musiman dari kasus-kasus akibat untuk infeksi flu burung, terutama pada fase awal infeksi.
Oleh karena itu, konfirmasi laboratorium diperlukan untuk menentukan etiologi influenza
klinis. Selain itu, laboratorium diagnosis juga akan berkontribusi terhadap deteksi dini dan
karakterisasi virus yang telah mengalami perubahan genetik bagi kemunculan strain pandemi.
Oleh karena itu, jika diagnosis laboratorium tidak dilakukan, ada risiko gagal untuk
mendeteksi dan memperingatkan masyarakat secara global mengenai kemunculan strain
potensi pandemi flu burung dan untuk memulai intervensi kesehatan masyarakat yang tepat
waktu. Identifikasi secara molekuler sampai saat ini merupakan teknik ideal yang telah
banyak digunakan dan distandardisasi sebagai tehnik pemeriksaan baku terutama untuk
mengidentifikasi virus Influenza.
Diagnostik Molekuler
Polymerase chain reaction (PCR) adalah teknik amplifikasi in vitro fragmen gen
tertentu secara enzimatis dengan menggunakan sepasang primer yang spesifik. Teknik ini
merupakan suatu teknik molekuler yang sensitif yang dapat digunakan untuk mendeteksi
adanya gen virus influenza. Pada Reverse Transcription (RT) PCR template yang digunakan
1
berupa produk reaksi reverse transkripsi. RT-PCR dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu
dengan konvensional RT-PCR (gel-based) dan real time RT-PCR
a. Prinsip
Karena genom dari virus influenza adalah RNA, maka RNA tersebut harus diubah lebih
dulu menjadi complementary DNA (cDNA) dengan proses RT, setelah itu baru
dilanjutkan dengan tahapan perbanyakan DNA melalui proses PCR. Keseluruhan
tahapan tersebut disebut RT-PCR. Proses RT-PCR memerlukan sepasang
oligonukleotida atau primer, dNTPs, template RNA, dan enzim (Taq DNA Polymerase).
b. Cara Kerja
1. Isolasi RNA virus flu burung
RNA yang terdapat pada spesimen sekret saluran nafas diisolasi dengan
menggunakan kit yang tersedia secara komersil
2. Pembentukan cDNA melalui proses RT
Karena virus flu burung merupakan virus RNA, maka sebelum dilanjutkan ke
proses PCR (penggandaan DNA) maka RNA tersebut harus diubah terlebih dahulu
menjadi cDNA melalui proses reverse transkription
3. Amplifikasi DNA (PCR)
cDNA yang terbentuk diperbanyak dengan proses PCR melalui tahapan denaturasi
(pemutusan ikatan ganda DNA), annealing (penempelan primer pada tempat yang
sesuai), dan ekstension (pemanjangan primer membentuk ikatan ganda DNA dengan
bantuan enzim polimerase)
4. Deteksi Hasil PCR
Hasil PCR kemudian dianalisis dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa
(konvensional gel RT-PCR) dan menggunakan komputer secara otomatis (realtime
RT-PCR)
2
BAB 2
TATA CARA KEAMANAN DI LABORATORIUM
Tujuan : Menjaga keamanan & keselamatan dan menghindari kecelakaan & kejadian
yang tidak diinginkan.
Referensi : WHO Global Influenza Surveillance Network. Manual for the laboratory
diagnosis and virological surveillance of influenza (WHO, 2011)
Keamanan dan keselamatan kerja di laboratorium merupakan tanggung jawab semua orang
yang bekerja di laboratorium. Tata cara keamanan kerja tersebut di laboratorium harus
dilaksanakan dengan konsisten setiap waktu yang meliputi :
1. Kewaspadaan dan keamanan di dalam melakukan penanganan semua spesimen klinis
yang berpotensi infeksius termasuk darah, swab, dan cairan tubuh lainnya.
2. Alat pelindung diri harus digunakan di dalam melakukan penanganan dan pekerjaan lab
(meliputi jas lab, sarung tangan, masker, dan peralatan lainnya)
3. Pipet mekanik harus digunakan di semua bagian lab, hindari penggunaan pipet yang
dihisap dengan mulut.
4. Bahan infeksius jangan dibuang ditempat sampah biasa buang di dalam plastik
biohazard
5. Hindari kontak langsung antara bahan infeksius dengan kulit dan mata.
6. Bahan infeksius tidak boleh dimakan / masuk kedalam mulut.
7. Pembagian spesimen (alikuot) harus dilakukan dengan hati-hati di dalam BSC.
8. Centrifuge harus digunakan sesuai aturan
9. Container yg berisi bahan infeksius harus dibuka dengan hati-hati dalam BSC class II.
10. Gunakan selalu sarung tangan karet untuk menghindari kontak langsung dengan darah
atau bahan infeksius lain.
11. Bahan infeksius disimpan dengan aman.
12. Cuci tangan setiap kali selesai melakukan suatu proses dan sebelum meninggalkan
ruangan laboratorium.
13. Di dalam laboratorium harus menggunakan jas laboratorium dan jangan lupa untuk
membuka jas lab sebelum meninggalkan ruang.
14. Penanganan spesimen dan proses ekstraksi harus memakai jas laboratorium, kacamata,
masker N95, dan penutup kepala yang sekali pakai.
3
15. Untuk menghindari kontaminasi, semua peralatan laboratorium (jas lab, pipet, alat-alat)
tidak boleh berpindah dan dibawa dari satu ruangan ke ruangan lain.
16. Memakai alas kaki yang tertutup.
17. Dilarang menyimpan makanan dan minuman di dalam laboratorium.
18. Dilarang makan, minum, menyisir rambut, memakai kosmetik dan merokok didalam
laboratorium.
19. Disinfektan yang digunakan adalah hipoclorit 1 % atau alkohol 70 %.
20. Secara rutin melakukan cek suhu dan menjaga kebersihan Refrigerator / freezer.
21. Semua staf harus sudah diimunisasi.
22. Jika ada staf yang sakit lapor kepada kepala laboratorium
4
BAB 3
LAY OUT (CONTOH) DAN ALUR KERJA LABORATORIUM PCR
Tujuan : Menjaga dan menghindari terjadinya kontaminasi dari bahan infeksius

maupun produk PCR.
5
Alur pemeriksaan dengan menggunakan metoda Real Time RT-PCR
Spesimen suspek
Flu Burung
Ekstraksi RNA Persiapan

Reagen RT-PCR
Pencampuran
RNA dan Reagen RT-PCR
Proses Real Time RT-PCR

(Flu A, H1pdm09, H5, dan RNP
Positif Borderline Negatif

Flu A, H1pdm09, atau Flu A, H1pdm09, Flu A, H1pdm09, atau
H5, jika : atau H5, jika : H5, jika :
Nilai cycle threshold Nilai cycle threshold Nilai cycle threshold
< 38 38 - 40 ≥ 40
Ulangi proses RT-PCR

dengan metode konvensional/gel atau
Real Time RT-PCR
6
Alur pemeriksaan dengan menggunakan metoda konvensional/gel RT-PCR
Spesimen suspek
Flu Burung
Ekstraksi RNA Persiapan

Reagen RT-PCR
Pencampuran
RNA dan Reagen RT-PCR
Proses konvensional/gelRT-PCR
(Flu A, H1pdm09, H5)
Positif Negatif
Flu A, H1pdm09, atau H5, jika : Flu A, H1pdm09, atau H5, jika :
ADA pita/band yang terlihat pada TIDAK ADA pita/band yang
proses elektroforesis terlihat pada proses elektroforesis
7
BAB 4
PENATALAKSANAAN DAN PENANGANAN SPESIMEN FLU BURUNG
DI LABORATORIUM
Tujuan : Pengolahan sampel swab untuk RT-PCR Avian Influenza

1. Spesimen dari suspek Flu Burung yang tiba di Laboratorium PCR dicatat nama pasien,
jenis dan asal spesimen, tanggal tiba di laboratorium PCR, serta nama pembawa swab
spesimen di dalam buku yang telah disediakan oleh petugas laboratorium.
2. Sampel diterima oleh petugas laboratorium dan di bawa masuk ke ruang ekstraksi.
3. Tabung spesimen swab yang tiba di laboratorium dibuka dari kontainernya di dalam BSC
II oleh petugas.
4. Dekontaminasi plastik sampel dan vialnya dengan alkohol 70 % untuk menghindari
kontaminasi.
5. Tabung spesimen diberi label nama, tanggal ambil, dan jenis spesimen.
6. Spesimen siap untuk diesktraksi menurut prosedur dari kit ekstraksi yang tersedia secara
komersial.
8
BAB 5
PENGGUNAAN BIOLOGICAL SAFETY CABINET (BSC)
Tujuan : Menggunakan BSC sesuai dengan instruksi kerja yang baku

Referensi : Protokol Perusahaan
Prosedur
1. Sebelum bekerja, hidupkan terlebih dahulu lampu ultraviolet (UV) sekitar 10 menit.
2. Hidupkan blower dan lampu fluorescent selama 10 menit.
3. Setelah lampu UV mati, check alat pengukur tekanan untuk memastikan bahwa tekanan
dalam posisi yang tepat.
4. Buka view sreen.
5. Check juga apakah blower bekerja dengan baik dengan cara mendekatkan kertas tissue
tipis pada grill (jika bekerja dengan baik, maka ujung kertas tissue akan tertarik ke arah
bawah).
6. Bersihkan terlebih dahulu meja kerja di dalam BSC dan semua peralatan yang akan kita
gunakan (pipet) dengan menggunakan alkohol 70%.
7. Bersihkan juga seluruh permukaan material atau peralatan yang akan ditempatkan di
dalam cabinet dengan alkohol 70%.
8. Barang-barang yang kita letakan di dalam BCS jangan sampai menutupi atau berada di
atas grill, karena akan mengganggu aliran udara.
9. Sebagai tempat sampah di dalam BSC, siapkan yellow bags di dalam bekker glass yang
terlebih dahulu disemprot dengan alkohol.
10. Letakkan bekker glass di area kotor.
11. Letakkan kertas tissue di area bersih.
12. Tempatkanlah spray berisi alkohol 70% ditempat yang mudah kita jangkau.
Ketika Bekerja di dalam BSC

1. Jangan meletakkan lengan di permukaan grille.
2. Bekerjalah dari area bersih ke area kotor.
3. Bekerja dengan tenang, penuh konsentrasi, dan kehati-hatian yang tinggi.
4. Usahakan agar lengan tidak terlalu banyak bergerak ke mana-mana.
9
Ketika Pekerjaan sudah selesai
1. Bersihkan semua peralatan yang kita pakai dengan menggunakan alkohol 70%.
2. Kembalikan dan rapikan barang-barang seperti keadaan semula.
3. Bersihkan terlebih dahulu permukaan barang-barang yang akan keluar dari BSC dengan
menggunakan alkohol 70%.
4. Bersihkan juga meja kerja di dalam BSC dengan menggunakan alkohol 70%.
5. Tutup view screen.
6. Matikan Blower dan lampu fluorescent.
7. Hidupkan lampu UV selama 10 menit.
Dekontaminasi dan Perawatan

Semua pengguna bertanggung jawab atas kebersihan dan dekontaminasi dari BSC. Jika
terjadi kerusakan (lampu UV, blower, lampu fluorescent) informasikan kepada kepala
Laboratorium Dan jangan digunakan sampai semua kerusakan telah selesai diperbaiki.
Pembersihan utama dilakukan setiap 1 bulan sekali.
10
BAB 6
PENATALAKSANAAN EKSTRAKSI RNA
Tujuan : Memperoleh RNA murni yang akan digunakan untuk pemeriksaan PCR
Nama Kit : QIAamp® Viral RNA Mini Kit ( Qiaqen, Cat : 52906)
A. BAHAN DAN PERALATAN

Bahan dan Reagen Kondisi Lokasi
No Keterangan
Habis Pakai Penyimpanan Penyimpanan
Disimpan di Suhu
Ruangan mix -200C setelah
1 Carrier RNA (Poly A) Suhu Ruang
Reagen dilarutkan dengan 310
µl Buffer AVE.
Ruangan mix
2 Buffer AVE Suhu Ruang
Reagen
Ruangan mix
3 Buffer AVL Suhu Ruang
Reagen
Ruangan mix
4 Alkohol absolute Suhu Ruang
Reagen
Ruangan mix Tambahkan dengan
Reagen 125 ml Ethanol
5 Buffer AW1 Suhu Ruang
Absolut sebelum
dipakai
6 Buffer AW2 Suhu ruang Reagen 160 ml Ethanol Absolut
sebelum dipakai
QIAamp Mini Spin Ruangan mix
7 Suhu Ruang
column Reagen
Ruangan mix
8 Collection tube Suhu Ruang
Reagen
Ruangan
9 1,5 ml eppendorf tube Suhu Ruang
Ektraksi
Aerosol Barier Tips
Ruangan
10 (1000 µl, 200 µl, 100 Suhu Ruang
Ektraksi
µl, 20 µl, 10 µl)
No Peralatan
1 Vortex
2 Sentrifuse
3 Mikro pipet (1000 µl, 200 µl, 100 µl, 20 µl, 10 µl)
4 BSC-II
11
B. BAHAN PEMERIKSAAN :
Spesimen saluran pernafasan dalam Viral Transport Medium (VTM) Hank BSS
C. PROSEDUR KERJA
Cara Kerja
1. Mix: 560 µl Lysis Buffer* + 140 µl swab.

2. Vortex dan inkubasi suhu ruangan (RT) 10 menit
3. Spin beberapa detik
4. Tambahkan 560 µl alkohol absolute.

5. Vortex dan spin
Spin column
Collection tube 6. Tranfers @ 630 µl ke-2 spin colum
Proses ini
dilakukan 2x
7. Sentrifuse 8000 rpm selama 1 menit.
8. Ganti collection tube tambahkan 500 µl Buffer AW1
10. Ganti collection tube tambahkan 500 µl Buffer AW2
12. Ganti collection tube
14. Ganti collection tube dengan 1,5 ml eppendorf tube

1,5 ml eppendorf tube + 60 µl Buffer AVE
15. Diamkan dalam (RT) selama 1 menit
17. Buang spin colum dan beri label pada tube
12
CATATAN :
Pembuatan lysis buffer : Hitung jumlah lysis buffer dengan mencampurkan Buffer AVL
dan Carrier RNA dengan rumus sbb :
Buffer AVL Carrier RNA

1 rxn 560 µl 5.6 µl
2 rxn 1120 µl 11.2 µl
dst.
13
BAB 7
PENATALAKSANAAN EKSTRAKSI RNA
Tujuan : Memperoleh RNA murni yang akan digunakan untuk pemeriksaan PCR
Nama Kit : Pure LinkTM Viral RNA/DNA Mini Kit (Invitrogen, Cat : 12280-050)

No Keterangan
Disimpan di Suhu
Ruangan mix -200C setelah
1 Carrier RNA (Poly A) Suhu Ruang
Reagen dilarutkan dengan 310
µl RNAse free water.
Ruangan mix
2 RNAse free water Suhu Ruang
Reagen
Ruangan mix
3 Viral Lysis Buffer Suhu Ruang
Reagen
Ruangan mix
4 Proteinase K Suhu -200C
Reagen
5 Wash Buffer Suhu Ruang Reagen 60 ml Ethanol Absolut
sebelum dipakai
Ruangan mix
6 Wash tube Suhu ruang
Reagen
Viral Spin Column Ruangan mix
7 Suhu Ruang
with collection tube Reagen
Ruangan mix
8 Recovery tube Suhu Ruang
Reagen
Aerosol Barier Tips
Ruangan
9 (1000 µl, 200 µl, 100 Suhu Ruang
Ektraksi
µl, 20 µl, 10 µl)
No Peralatan
1 Vortex
2 Sentrifuse
3 Mikro pipet (1000 µl, 200 µl, 100 µl, 20 µl, 10 µl)
4 BSC-II
Spesimen saluran pernafasan dalam Viral Transport Medium (VTM) Hank BSS
14
C. PROSEDUR KERJA
Cara Kerja
1. Mix: 240.8 µl Lysis Buffer + 140 µl spesimen swab

2. Vortex dan inkubasi 560 selama15 menit
3. Spin beberapa detik
4. Tambahkan 250 µl alkohol absolute.

5. Vortex dan spin
6. Inkubasi suhu ruang (RT) 5 Menit
Spin column
Collection tube 7. Tranfer ke dalam spin colum
8. Sentrifuse 6800 x g dalam suhu 4-80C selama 1 menit
9. Ganti collection tube tambahkan 500 µl Wash Buffer
10. Sentrifuse 6800 x g dalam suhu 4-80C selama 1

menit.
11. Buang Supernatan, tambahkan lagi 500 µl Wash Buffer
12. Sentrifuse 6800 x g dalam suhu 4-80C selama 1

menit.
13. Ganti collection tube
14. Sentrifuse 6800 x g dalam suhu 4-80C selama 1 menit.
15. Ganti collection tube dengan 1,5 ml recovery tube + 50 µl RNAse

1,5 ml recovery tube free water
16. Diamkan dalam suhu ruang (RT) selama 1 menit
17. Sentrifuse 12000 x g dalam suhu 4-80C selama 1 menit.
18. Buang spin colum dan beri label pada tube
15
CATATAN :
Pembuatan Lysis Buffer : Hitung volume lysis buffer dengan menambahkan viral lysis
buffer, carrier RNA dan porteinase K yang akan dipakai dengan rumus sbb :
Viral Lysis Buffer Carrier RNA Proteinase K

1 rxn 210 µl 5.8 µl 25 µl
2 rxn 420 µl 11.76 µl 50 µl
dst
16
BAB 8
PROSEDUR KUALITATIF KONVENSIONAL/GEL ONE STEP RT-PCR
Tujuan : Mendeteksi Keberadaan Materi Genetik Virus A/H1N1pdm09, A/H5N1,

,A/H7 dan A/H9 menggunakan metode konvensional/gel RT-PCR
Nama Kit : Superscript III One Step RT-PCR Platinum Taq (Invitrogen, Cat: 12574-
026)

No Keterangan
Enzim SuperScript. III RT/ Ruangan mix
1 Suhu -200C
Platinum Taq Mix Reagen
2X Reaction Mix (a buffer Ruangan mix
2 containing 0.4 uM of each Suhu -200C Reagen
dNTP, 6 mM MgSO4)
Ruangan mix
3 5-mM Magnesium Sulfate Suhu -200C
Reagen
Ruangan mix
4 ROX Reference Dye Suhu -200C
Reagen
Ruangan mix
5 200 ml PCR tube Suhu Ruang
Reagen
Ruangan mix
Reagen
Ruangan
Ektraksi
Aerosol Barier Tips (1000 µl, Ruangan
8 Suhu Ruang
200 µl, 100 µl, 20 µl, 10 µl) Ektraksi
No Peralatan
1. Sentrifuge Spin Down
2. Mikro pipet (200 µl, 100 µl, 20 µl, 10 µl)
3 Cold block
4 Konvensional Thermal Cycler
RNA Virus (Template RNA)
17
C. PROSEDUR KERJA
1. Siapkan reagen RT-PCR Mix dengan menambahkan komponen-komponen dibawah ini ke
dalam tabung reaksi steril 1,5 ml :
Komponen Volume
(µl) 1rx
RNase Free Water 5.5
2X Reaction Mix 12.5
Primer F (10 µM) 0.5
Primer R (10 µM) 0.5
Enzim SuperScript. III RT/ 1
Platinum Taq Mix
2. Untuk menyiapkan RT-PCR Master Mix lebih dari satu reaksi, kalikan jumlah dalam
kolom “volume” di atas dengan jumlah reaksi yang dibutuhkan.
3. Selalu melebihkan sekurang-kurangnya 1 atau 2 dari reaksi yang dibutuhkan.
4. Campur semua komponen tersebut dengan vorteks dan disentrifuge beberapa detik,
kemudian aliquot ke dalam tabung 200 ml masing-masing 20 µl.
5. Tambahkan kedalam tabung yang telah diisi master mix tersebut dengan Template RNA
sebanyak 5 µl.
6. Tabung tersebut siap untuk dimasukkan ke dalam mesin Thermal Cycler dengan program
sebagai berikut :
1. Reverse Transkriptase :
550C 30 min
2. Hot Start
940C 2 min
3. 3-Step Cycling, 35 Cycle
940C 30 det
550C 30 det
0
72 C 1 min
4. Final Extension
720C 7 min
7. Hasil PCR masing-masing sebanyak 9 µl kemudian dicampur dengan Loading Dye 1 uL .

Masukkan ke dalam well gel agarosa 1,5% atau 2% di dalam aparatus elektroforesis.
Salah satu well diisi dengan Marker 100 bp sebanyak 10 µL.
8. Nyalakan power supply pada posisi 100 volt selama 45 menit, hasil elektroforesis dilihat
dengan menggunakan lampu UV.
18
D. HASIL ANALISA GEL ELEKTROFORESIS
Keterangan Gambar:
1. Fragmen Flu A sepanjang 234bp
Sampel no 1: Positif
NC: Negatif Control, negatif
PC: Positif Control, positif
2. Fragmen H5 sepanjang 565 bp

Sampel no 2: Negatif
NC: Negatif Control, negatif
PC: Positif Control, positif
3. Fragmen H1 pandemic sepanjang 173bp

NC: Negatif Control, negative
PC: Positif Control. Positif
Kesimpulan gambar:
Sampel no 1: Positif Influenza A/H5
Sampel no 2: Positif Influenza A/H1pandemi
19
Flu A H7 H9
Keterangan Gambar:
1. Fragmen Flu A sepanjang 234bp
NC: Negative Control, negatif
PC: Positive Control, positif
2. Fragmen H7 sepanjang 284bp

NC: Negative Control, negative
PC: Positive Control, postitf
3. Fragmen H9 sepanjang 382bp

NC: Negative Control, negatif
PC: Positive Control, positif
Kesimpulan gambar:
20
BAB 9
PROSEDUR KUANTITATIF ONE STEP REAL TIME RT-PCR
Tujuan : Mendeteksi Keberadaan Materi Genetik Virus A H5N1 Menggunakan Metode

Real Time RT-PCR
Referensi : CDC Atlanta, Versi 2007
Nama Kit : Invitrogen SuperScript™III Platinum® One-Step Quantitative Kit (cat#
11732-020 / 11745-100)

No Keterangan
Enzim SuperScript. III RT/ Ruangan mix
1 Suhu -200C
Platinum Taq Mix Reagen
2X Reaction Mix (a buffer Ruangan mix
2 containing 0.4 mM of each Suhu -200C Reagen
dNTP, 3.2 mM MgSO4)
Ruangan mix
3 5-mM Magnesium Sulfate Suhu -200C
Reagen
Ruangan mix
4 200 µl PCR tube Suhu Ruang
Reagen
Ruangan mix
Reagen
Ruangan
Ektraksi
7 Suhu Ruang
No Peralatan
3 Cold block
4 Mesin Real Time PCR
B. BAHAN PEMERIKSAAN : RNA Virus
C. CARA KERJA
dalam tabung reaksi steril 1,5 ml
21
Volume
Komponen
(µl) 1 rx
Nuclease Free Water 5.5
2X PCR Master Mix 12.5
Probe (10 µM) 0.5
Enzim RT/DNA Polymerase 0.5
kolom “volume” di atas dengan jumlah reaksi yang dibutuhkan ditambah 2 reaksi sebagai
cadangan.
3. Campur semua komponen tersebut dan disentrifuge beberapa detik, kemudian aliquot ke
dalam plate 96 well atau tabung strip 8 well masing-masing 20 µl.
4. Tambahkan kedalam tabung yang telah diisi master mix tersebut NTC (negative template
control), specimen RNA, Mock dan Kontrol Positif (Standard RNA) sebanyak 5 µl.
Contoh pola reaksi :
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A InfA InfA InfA InfA InfA InfA InfA InfA InfA InfA InfA InfA
B H1pdm
09
H1pdm
09
H1pdm
09
H1pdm
09
H1pdm
09
H1pdm
09
H1pdm
09
H1pdm
09
H1pdm
09
H1pdm
09
H1pdm
09
H1pdm
09
C H5 H5 H5 H5 H5 H5 H5 H5 H5 H5 H5 H5
D RNP RNP RNP RNP RNP RNP RNP RNP RNP RNP RNP RNP
E
F
G
5. Tutup tabung dengan sealer atau strip cap sampai rapat, jangan sampai ada gelembung
dan celah terbuka untuk menghindari penguapan dan kontaminasi.
6. Tabung tersebut siap untuk dimasukkan ke dalam mesin Real Time Thermal Cycler
dengan program sebagai berikut :
500C 30 Min
2. Inaktivasi Inhibitor Taq:
950C 2 Min
3. Amplifikasi PCR, (45 CYCLE)
950C 15 Det
550C 30 Det  (Baca Real Time/Collection Data)
7. Tampilkan hasil dan periksa nilai Ct maupun kurva amplifikasi, pengaturan analis untuk
baseline dan threshold diatur secara otomatis oleh komputer ataupun manual.
22
BAB 10
PROSEDUR KUANTITATIF ONE STEP REAL TIME RT-PCR

UNTUK VIRUS H7N9
Tujuan : Mendeteksi Keberadaan Materi Genetik Virus A H7N9 Menggunakan Metode

Real Time RT-PCR
Referensi : WHO Collaborating Center for Reference and Research on Influenza Chinese
National Influenza Center National Institute for Viral Disease Control and
Prevention, China CDC, 2013
Nama Kit : AgPath one-step RT-PCR kit

No Keterangan
Ruangan mix
1 25x RT-PCR enzyme mix Suhu -200C
Reagen
Ruangan mix
2 2X Reaction Mix Suhu -200C
Reagen
Ruangan mix
3 200 µl PCR tube Suhu Ruang
Reagen
Ruangan mix
Reagen
Ruangan
Ektraksi
6 Suhu Ruang
No Peralatan
3 Cold block
4 Mesin Real Time PCR
B. BAHAN PEMERIKSAAN : RNA Virus
C. CARA KERJA
dalam tabung reaksi steril 1,5 ml
23
Volume
Komponen
(µl) 1 rx
Nuclease Free Water 5.0
2X PCR Master Mix 12.5
Probe (20 µM) 0.5
Enzim RT/DNA Polymerase 1
kolom “volume” di atas dengan jumlah reaksi yang dibutuhkan ditambah 2 reaksi sebagai
cadangan.
3. Campur semua komponen tersebut dan disentrifuge beberapa detik, kemudian aliquot ke
dalam plate 96 well atau tabung strip 8 well masing-masing 20 µl.
4. Tambahkan kedalam tabung yang telah diisi master mix tersebut NTC (negative template
control), specimen RNA, Mock dan Kontrol Positif (Standard RNA) sebanyak 5 µl.
Contoh pola reaksi :
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A H7 H7 H7 H7 H7 H7 H7 H7 H7 H7 H7 H7
B
C
D
E
F
G
5. Tutup tabung dengan sealer atau strip cap sampai rapat, jangan sampai ada gelembung
dan celah terbuka untuk menghindari penguapan dan kontaminasi.
6. Tabung tersebut siap untuk dimasukkan ke dalam mesin Real Time Thermal Cycler
dengan program sebagai berikut :
450C 10 Min
2. Inaktivasi Inhibitor Taq:
950C 10 Min
3. Amplifikasi PCR, (45 CYCLE)
950C 15 Det
600C 45 Det  (Baca Real Time/Collection Data)
7. Tampilkan hasil dan periksa nilai Ct maupun kurva amplifikasi, pengaturan analis untuk
baseline dan threshold diatur secara otomatis oleh komputer ataupun manual.
24
8. Sampel dinyatakan positif bila nilai Ct < 38dan negatif bila nilai Ct > 40. Tes dinyatakan
valid jika hasil pada positif kontrol menunjukkan hasil positif dan negatif kontrol
menunjukkan hasil negative.
25
BAB 11
PENGOPERASIAN MESIN THERMAL CYCLER CHROMO4, BIORAD
TUJUAN
a. Menetapkan instruksi kerja pengoperasian mesin Biorad Chromo4 Thermal Cycler
b. Memberikan petunjuk bagi petugas yang melakukan pengoperasian mesin Biorad
Chromo4 Thermal Cycler
CARA KERJA :
Sebelum bekerja :
1. Nyalakan CPU
2. Nyalakan monitor komputer
3. Nyalakan mesin thermal cycler dengan menekan tombol on/off di BAB belakang mesin.
4. Buka detektor mesin dengan cara seperti gambar dibawah ini :
5. Masukkan Spesimen, tutup kembali mesin thermal cycler

6. Klik icon Opticon Monitor pada layar komputer. Setelah beberapa saat akan muncul
jendela seperti ini :
26
7. Klik tanda panah bawah di master file Quick load
8. Pilih protokol yang akan digunakan

9. Klik icon New pada Plate setup
27
10. Muncul jendela seperti ini
11. Pilih jenis plate yang dipakai, pilihannya MJ White atau MJ Clear
12. Pilih dye set yang digunakan, dalam hal ini FAM
28
13. Petakan well dengan cara klik angka diatas well kemudan tarik ke kanan sampai well
yang kita inginkan. Atau bisa dengan memilih well satu per satu
14. Klik icon Sampelbila well diisi sampel, Standardbila diisi dengan standard dst
15. Klik Ok
29
16. Monitor akan kembali menampilkan layar berikut :
17. Klik tanda panah bawah pada Quick loadProtocol
18. Pilih Protokol yang akan dipakai.

19. Klik Run
20. Akan muncul jendela :

21. Ketik nama file, Pilih folder dimana file akan disimpan, Klik Save
30
22. Monitor akan menampilkan status screen sbb sebagai tanda proses telah dimulai
Setelah bekerja :
1. Proses PCR selesai bila di monitor telah terlihat jendela sbb :
2. Atur base line sampai diatas noise dengan menaikkan/menurunkannya.

3. Hasil deteksi untuk tiap-tiap sampel dapat dilihat dengan meng-klik well satu persatu.
Sorot kurva yang terbentuk, maka akan muncul nilai Ct-nya.
4. Catat nilai Ct dalam form pemeriksaan real time.
5. Bila analisa telah selesai, Klik tanda silang (close) dan matikan komputer.
6. Matikan mesin thermal cycler
31
BAB 12
PENGOPERASIAN MESIN THERMAL CYCLER BIORAD C-1000
TUJUAN
a. Menetapkan Instruksi Kerja pengoperasian mesin Biorad C1000 Thermal Cycler

b. Memberikan petunjuk bagi petugas yang menggunakan mesin Biorad C1000 Thermal
Cycler
CARA KERJA
Sebelum bekerja :
1. Putar knob berlawanan arah jarum jam di BAB atas mesin untuk melonggarkan,
kemudian angkat lid lever, dorong ke belakang seperti gambar di bawah ini :
Knob
2. Letakkan sampel dan tutup kembali, tekan lid lever ke bawah. Putar knob searah jarum
jam untuk mengencangkan.
Knob
3. Nyalakan thermal cycler dengan menekan tombol ke posisi on, tombol on/off ada di BAB
kiri belakang mesin thermal cycler.
4. Setelah mesin menyala akan tampak jendela awal seperti ini :
32
5. Untuk menjalankan suatu protokol Klik Files dan akan muncul jendela seperti ini:
Task pane sebelah kiri menunjukkan nama protokol yang telah tersimpan dalam mesin,
sedangkan task pane sebelah kanan menunjukkan detail dari protokol yang dipilih.
6. Pilih protokol yang diinginkan dengan menekan tombol navigasi yang ada di sebelah
kanan mesin BAB depan
7. Klik Tombol Run di command keys BAB kiri. Kemudian akan muncul jendela seperti
dibawah ini
33
Isi volume sampel dan lid temperatur yang diinginkan. Klik OK, dan akan muncul
jendela seperti ini :
34
Setelah bekerja :
1. Protokol telah selesai dijalankan bila remaining time telah berada di angka 00:00:00.
2. Untuk menghentikannya tekan tombol F1 (Cancel Run) sehingga muncul jendela seperti
ini:
3. Kemudian Tekan Main Menu.

4. Keluarkan sampel dari dalam mesin.
5. Matikan mesin dengan menekan tombol off di BAB belakang mesin
35
BAB 13
PENGOPERASIAN MESIN THERMAL CYCLER BIORAD IQ5
TUJUAN
a. Menetapkan Instruksi Kerja pengoperasian mesin Thermal Cycler Biorad IQ5

b. Memberikan petunjuk bagi petugas yang menggunakan mesin Thermal Cycler Biorad
IQ5
CARA KERJA :
1. Menyalakan Instrument
a. Nyalakan computer dan monitor
b. Tekan tombol power pada IQ 5 Real-Time PCR Detection System
2. Menjalankan Program IQ5 Real-Time PCR Detection System

a. Double clik icon IQ5 pada layar desktop
b. Maka akan nampak tampilan sebagai berikut:
3. Masukan plate pemeriksaan dalam modul reaksi iCycle, dengan cara membuka tutup
iCycle
36
4. Pilih Protokol pemeriksaan yang dipilih dengan cara, klik Protocol dan pilih protocol
yang diinginkan
5. Setup plate dengan cara, klik Plate lalu klik Create New
6. Pilih sumur / well yang akan di PCR. Pilih dye set yang dipakai. Klik save and exit plate
editing
37
7. Akan muncul jendela seperti dibawah ini. Klik Run.
8. Klik Begin Run
38
9. Akan tampak jendela seperti dibawah ini jika proses PCR sudah mulai berjalan.
10. Bila proses selesai akan muncul jendela Run completed ? klik OK, dan muncul jendela
di bawah ini. Klik Threshold cycle dan nilai CT untuk masing-masing sampel di tiap
well akan terlihat.
39
BAB 14
PEMBUATAN GEL UNTUK ANALISA HASIL KUALITATIF RT-PCR

(GEL ELEKTROFORESIS)
Tujuan : Membuat Gel Agarosa untuk menganalisis hasil kualitatif RT-PCR


No Keterangan
Ruangan
1 dH20 destilasi Suhu Ruang
Elektroforesis
Buffer TBE (Tris Boric Acid) Ruangan
2 Suhu Ruang
1X Elektroforesis
3 Suhu Ruang
200 µl, 100 µl, 20 µl, 10 µl) Elektroforesis
Ruangan
4 Bubuk Agarosa Suhu Ruang
Elektroforesis
Zat warna intercalat (Gel Red Ruangan
5 Suhu Ruang
atau Ethidium Bromida Elektroforesis
NO PERALATAN
1. Timbangan Analitik
2. Botol Ukur / Tabung 10ml, 1000 ml
3. Microwave
4. Mikro pipet (100 µl, 20 µl,)
5. Aparatus Elektroforesis horizontal
B. PROSEDUR KERJA
1. Timbang agarosa sebanyak 2 gr (2%)*
2. Tuang ke dalam tabung/ botol tahan panas
3. Tambahkan 100 ml Buffer TBE 1X
4. Didihkan sampai larut dalam microwave selama ± 4 menit
5. Dinginkan sampai suhu 600C dalam suhu kamar
6. Tambahkan 10 ul Zat Pewarna intercalat (Gel Red atau Ethidium Bromide)
7. Tuang kedalam tray yang sebelumnya telah dipasang comb* semakin panjang base
pair primer yang digunakan, maka semakin rendah persentase yang digunakan
(±1.5%)
40
BAB 15
PENGGUNAAN APPARATUS ELEKTROFORESIS
Tujuan : Menggunakan apparatus elektroforesis (Mupid Ex™) atau BioRad sesuai

dengan instruksi kerja yang baku
Keamanan Kerja
1. Jangan sentuh produk dengan tangan yang basah.
2. Jangan letakkan jari atau benda asing ke dalam cell selama electrophoresis. Hindari
menyentuh konektor elektroda selama electrophoresis.
3. Cell lid sudah didesign sesuai dengan apparatus dan tankinya. Jangan gunakan penutup
yang lain.
4. Sebelum disconnection power supply dari alat Elektrophoresis, pastikan bahwa power
switch ON dalam keadaan OFF.
5. Gel yang digunakan mengandung Ethidium bromide yang bersifat karsinogenik. Gunakan
sarung tangan ketika menangani unit ini. Atau gunakan zat intercalate lain yang relative
aman seperti Gel Red dan SyberSafe.
Prosedur Kerja
Persiapan Gel
1. Ambil gel yang masih baru di dalam lemari es.
2. Letakan gel di atas tray dan kemudian tempatkan keduanya di atas gel bed
3. Jika ternyata di atas gel bed sudah tersedia gel, pastikan well mana saja yang belum
digunakan untuk proses analisis elektroforesis
Buffer
1. Pastikan bahwa seluruh gel di dalam tray terendam buffer (300-350 ml).
2. Cek kapan terakhir kali Buffer diganti.
3. Buffer diganti setiap seminggu sekali pada hari Jumat.
PERINGATAN:
 Buffer yang kotor serta merunning dengan menggunakan gel bekas akan mempengaruhi
pembacaan hasil.
41
Running alat elektroforesis
1. Setelah semua produk RT-PCR yang akan kita analisa telah masuk ke dalam well, tutup
Cell unit dengan Cell Lid dan kemudian letakkan tutup aluminium foil di atasnya. Tutup
aluminium foil digunakan untuk melindungi lid sensor dari gangguan sinar lampu yang
terlalu terang (spot light, lampu pijar, dan lain-lain).
2. Hidupkan tombol <ON> pada saklar mesin (terletak di belakang alat).
3. Tekan tombol <output voltase> pada 100 volt
4. Set waktu selama 40 menit.
5. Untuk menaikkan atau mengurangi waktu, gunakan tombol ▲ (menambah waktu) atau
▼ (menurunkan waktu).
6. Tekan tombol output button ( ) untuk menghidupkan Power supply.
7. Sebagai indikasi bahwa system dalam keadaan ON:
 Lampu LED biru akan menyala
 Pada larutan buffer akan muncul gelembung-belembung udara dari elektroda
Perawatan
! Jika tidak dilakukan maka akan dapat merusak produk dan bahkan dapat berpengaruh
terhadap hasil eksperimen:
1. Jangan simpan larutan buffer di dalam alat Elektrophoresis Cell unit dalam jangka
waktu yang cukup lama. Larutan buffer yang terkonsentrasi secara terus menerus
(contoh : evaporasi) akan berakibat tidak saja berpengaruh terhadap hasil pengamatan
tetapi juga dapat merusak elektroda.
2. Pastikan untuk memutus aliran listrik menuju alat Elektrophoresis Cell Unit dan
mencabut power cord dari dinding sebelum memulai membersihkan dan menuang
larutan buffer.
3. Ketika membersihkan alat, dilarang menggosok BAB elektrodanya. Karena dapat
mengakibatkan elektroda tidak berfungsi atau disconnection.
4. Segera keringkan mesin jika dibersihkan dengan menggunakan air. Hindari
penggunaan pengering atau autoclave. Karena hal tersebut dapat mengakibatkan
kegagalan system.
5. Komponen dari alat ini tidak sesuai dengan acetone atau larutan organik lainnya.
Jangan menggunakan larutan organik untuk membersihkan alat ini, karena dapat
merubah bentuk timah yang terdapat dalam komponen.
42
Permasalahan
Masalah Solusi
Lampu Indikator tidak menyala Cek kabel dan stop kontak yang menghubungkan antara
mesin dengan sumber listrik di dinding.
Cek apakan voltase yang digunakan telah sesuai dengan
yang digunakan di daerah tersebut.
Jika peralatan terasa panas, cabut stop kontak dari
dinding. Kemudian cek apakah ada sesuatu yang
menutupi lubang ventilasi dari Power supply.
Penyimpangan band Cek apakah ada gelembung udara yang terjebak di
dalam gel?
Cek apakah agarosa yang digunakan benar-benar larut
sempurna?
Band tidak dapat terlihat Apakah volume sample cukup? ( sampai dengan 12 μl
untuk setiap well dengan ukuran 6mm)
Apakah konsentrasi larutan zat pewarna yang digunakan
mencukupi? Apakah larutan digunakan berkali-kali?
Cek tanggal kadaluwarsa zat pewarna yang digunakan.
Apakah panjang gelombang zat pewarna yang
digunakan telah tepat?
Coba dilakukan electrophoresis lagi dalam waktu yang
singkat.
Jika VTC tidak keluar, ada kemungkinan kesalahan
terjadi pada waktu mencampur reagent.
43
BAB 16
PENGGUNAAN ALAT DOKUMENTASI HASIL PCR
Tujuan : Menggunakan apparatus dokumentasi gel (Gel Doc™, Biorad) sesuai

dengan instruksi kerja yang baku
Keamanan Kerja
1. Lindungi diri kita dengan menggunakan jas disposible dan masker ketika bekerja.
2. Selalu menggunakan sarung tangan ketika memegang gel, karena di dalam gel
mengandung Ethidium bromide yang merupakan zat kimia yang karsinogenik dan
beracun
3. Gunakan juga sarung tangan ketika memegang pintu Gel doc
4. Lepaskan sarung tangan ketika menekan tombol keboard computer dan tombol-tombol
pada Gel Doc
5. Segera cuci tangan setelah pekerjaan selesai.
Cara Kerja
Menyalakan Instrument
1. Nyalakan computer dan monitor
2. Tekan tombol power pada Gel Doc X-Ray
Menganalisa gel
1. Double klik dengan cepat icon Quantity One System Sofware yang terdapat di layar
monitor.
2. Maka akan nampak tampilan sebagai berikut:
44
3. Untuk menganalisa, klik File>New. Maka akan tampak tampilan sebagai berikut:
4. Buka pintu Gel Doc dengan menggunakan sarung tangan

5. Masukkan gel ke dalam Gel Doc
6. Untuk melihat posisi gel pada computer, tekan tombol Epiwhite dan geser-geser gel
sehingga didapat posisi yang tepat.
7. Kemudian tutup pintu Gel Doc dan tekan kembali tombol Epiwhite untuk
mematikannya.
8. Untuk melihat pita-pita yang dihasilkan, tekan tombol trans UV
9. Kemudian klik Auto Expose hingga pita-pita pada gel terlihat jelas,
10. Klik Freeze untuk menghentikan pencahayaan.
11. Tekan kembali tombol trans UV untuk mematikan sinar UV.

12. Kemudian klik Analyze
45
13. Pada layar computer akan nampak gambar sebagai berikut:
14. Untuk mendapatkan gambar yang lebih jelas, klik kanan pada gambar, sehingga akan
didapat pilihan-pilihan sebagai berikut:
Klik Transform. Maka di layar akan terlihat sebagai berikut
15. Setelah mendapatkan pencahayaan yang maksimal, klik Ok.

16. Untuk mencrop gambar, klik Image> Crop
17. Kemudian crop gambar sesuai dengan ukuran yang ingin kita ambil (seperti nampak
pada gambar di bawah ini).
46
18. Untuk menyimpan gambar, gerakkan cusor mouse hingga di layar tampak gambar
gunting. Setelah nampak, kemudian klik kiri. Maka di layar akan terlihat sebagai
berikut:
19. Kemudian kita klik Coppy and Crop.
20. Untuk memberi nama well-well yang berisi sample, maka klik tombol ABC
21. Klik lagi tombol ABC pada gambar dan kemudian klik well yang akan diberi nama
22. Tulis nama / inisial sample pada Text Overlay Properties kemudian klik Ok
23. Lakukan hal sama pada well yang lain.
47
24. Untuk mem-print gambar, klik gambar printer>print.
48
BAB 17
PENUTUP
Dengan adanya buku panduan instruksi kerja untuk pemeriksaan molekuler virus
influenza ini, diharapkan dapat memberikan dukungan dalam upaya deteksi cepat kasus-
kasus influenza sehingga dapat membantu upaya penganggulangan kasus mutasi influenza
dan antisipasi terjadinya pandemi influenza.
49
BAB 18
KEPUSTAKAAN
1. Noelle-Angelique M. Molinari, Ismael R. Ortega-Sanchez, Mark L. Messonnier, William

W. Thompson, Pascale M. Wortley, Eric Weintraub, Carolyn B. Bridges . The annual
impact of seasonal influenza in the US: Measuring disease burden and costs. Vaccine,
Volume 25, Issue 27, 28 June 2007, Pages 5086-5096
2. N. J. Cox and K. Subbarao. Global Epidemiology of Influenza: Past and Present*. Annu.
Rev. Med. 2000. 51:407–421.
3. F. Carrat, A. Flahault. Influenza vaccine: The challenge of antigenic drift. Vaccine,
Volume 25, Issues 39-40, 28 September 2007, Pages 6852-6862
4. Influenza Viruses. http://www.cdc.gov/flu/avian/gen-info/flu-viruses.htm
5. Claas, E. C. J., Osterhaus, A. D. M. E., Van Beek, R., De Jong, J. C., Rimmelzwaan, G.
F., Senne, D. A., Krauss, S., Shortridge, K. F. & Webster, R. G. (1998). Human influenza
A H5N1 virus related to a highly pathogenic avian influenza virus. Lancet 351, 472–477.
6. Hatta, M. & Kawaoka, Y. (2002). The continued pandemic threat posed by avian
influenza viruses in Hong Kong. Trends Microbiol 10, 340–344
7. CDC/WHO Avian Influenza Response Team . Outbreaks of avian influenza A (H5N1) in
Asia and interim recommendations for evaluation and reporting of suspected cases –
United States, 2004. Morb Mortal Wkly Rep 53, 97–99.
8. Center disease control. CDC reeal time RT-PCR (sRT-PCR) protocol for detection and
characterization of swine influenza (version 2009). Cited at 15 June 2013
9. WHO Global Influenza Surveillance Network. Manual for the laboratory
diagnosis and virological surveillance of influenza. 2011
50
LAMPIRAN
Contoh Form untuk pengerjaan konvensional/gel RT-PCR
Contoh Form untuk pengerjaan real time RT-PCR
51
52
53
View publication stats

2013 SOPBuku Identifikasi Molekuler Influenza Final

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

2013 SOPBuku Identifikasi Molekuler Influenza Final

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.

Panduan Instruksi Kerja Identiﬁkasi Molekuler Virus Inﬂuenza

Book · April 2013

Naning Agustiningsih Arie Ardiansyah Nugraha

SEE PROFILE SEE PROFILE

Epidemiology and Virology of Influenza B in Indonesia View project

Arboviruses surveillance View project

The user has requested enhancement of the downloaded file.

KATA PENGANTAR ............................................................................................................. iii

Influenza adalah penyakit menular yang menyerang saluran pernapasan manusia.

TATA CARA KEAMANAN DI LABORATORIUM

LAY OUT (CONTOH) DAN ALUR KERJA LABORATORIUM PCR

Tujuan : Menjaga dan menghindari terjadinya kontaminasi dari bahan infeksius

Ekstraksi RNA Persiapan

Proses Real Time RT-PCR

Positif Borderline Negatif

Ulangi proses RT-PCR

Ekstraksi RNA Persiapan

Tujuan : Pengolahan sampel swab untuk RT-PCR Avian Influenza

PENGGUNAAN BIOLOGICAL SAFETY CABINET (BSC)

Tujuan : Menggunakan BSC sesuai dengan instruksi kerja yang baku

Ketika Bekerja di dalam BSC

Dekontaminasi dan Perawatan

PENATALAKSANAAN EKSTRAKSI RNA

A. BAHAN DAN PERALATAN

1. Mix: 560 µl Lysis Buffer* + 140 µl swab.

4. Tambahkan 560 µl alkohol absolute.

8. Ganti collection tube tambahkan 500 µl Buffer AW1

9. Sentrifuse 8000 rpm selama 1 menit.

10. Ganti collection tube tambahkan 500 µl Buffer AW2

11. Sentrifuse 14000 rpm selama 3 menit.

12. Ganti collection tube

13. Sentrifuse 14000 rpm selama 1 menit.

14. Ganti collection tube dengan 1,5 ml eppendorf tube

16. Sentrifuse 8000 rpm selama 1 menit.

17. Buang spin colum dan beri label pada tube

Buffer AVL Carrier RNA

PENATALAKSANAAN EKSTRAKSI RNA

A. BAHAN DAN PERALATAN

1. Mix: 240.8 µl Lysis Buffer + 140 µl spesimen swab

4. Tambahkan 250 µl alkohol absolute.

Collection tube 7. Tranfer ke dalam spin colum

8. Sentrifuse 6800 x g dalam suhu 4-80C selama 1 menit

9. Ganti collection tube tambahkan 500 µl Wash Buffer

10. Sentrifuse 6800 x g dalam suhu 4-80C selama 1

11. Buang Supernatan, tambahkan lagi 500 µl Wash Buffer

12. Sentrifuse 6800 x g dalam suhu 4-80C selama 1

13. Ganti collection tube

14. Sentrifuse 6800 x g dalam suhu 4-80C selama 1 menit.

15. Ganti collection tube dengan 1,5 ml recovery tube + 50 µl RNAse

17. Sentrifuse 12000 x g dalam suhu 4-80C selama 1 menit.

18. Buang spin colum dan beri label pada tube

Viral Lysis Buffer Carrier RNA Proteinase K

PROSEDUR KUALITATIF KONVENSIONAL/GEL ONE STEP RT-PCR

Tujuan : Mendeteksi Keberadaan Materi Genetik Virus A/H1N1pdm09, A/H5N1,

A. BAHAN DAN PERALATAN

7. Hasil PCR masing-masing sebanyak 9 µl kemudian dicampur dengan Loading Dye 1 uL .

2. Fragmen H5 sepanjang 565 bp

3. Fragmen H1 pandemic sepanjang 173bp

2. Fragmen H7 sepanjang 284bp

3. Fragmen H9 sepanjang 382bp

PROSEDUR KUANTITATIF ONE STEP REAL TIME RT-PCR

Tujuan : Mendeteksi Keberadaan Materi Genetik Virus A H5N1 Menggunakan Metode