fasa diam yang ditempatkan dalam suatu kolom tertutup dan juga fasa
geraknya berupa pelarut yang dialirkan dengan cepat ke dalam kolom
dengan bantuan pompa/tekanan.
Fasa Gerak
Siapkan campuran pelarut H2O : MeOH : AcOH (69:28:3) grade HPLC atau PA yang
sudah dimilipore dan didegass.
Siapkan larutan asam benzoat dalam metanol dengan konsentrasi kira – kira 6
mg/mL
Larutkan secara akurat sejumlah tertentu standar kafein grade USP/PA dengan
pelarut campuran ( MeOH : Asam asetat glacial 95:5 ) dengan konsentrasi kira – kira
0.25 mg / mL
Preparasi Standar
Timbang sample kafein yang sudah dihaluskan sekitar 250 mg, dan dimasukkan ke
dalam labu ukur 100 mL. tambahkan 75 mL pelarut campuran, kocok dengan shaker
sekitar 30 menit. Encerkan sampai tanda batas dengan pelarut campuran, dan
dihomogenkan. Pindahkan 2 mL larutan ini dan 3 mL larutan standar internal ke
dalam labu ukur 50 mL,encerkan sampai tanda batas, dan dihomogenkan.
Sistem Kromatografi
HPLC dilengkapi dengan detector UV dengan λ 275 nm dan kolom C-18. Kecepatan
alir eluen sekitar 2 mL /menit.
Prosedur Analisis
Suntikkan sekitar 10 μL larutan preparasi standar dan larutan sample yang sudah
dipreparasi secara terpisah, ke dalam HPLC. Waktu retensi kafein sekitar 0.5, asam
benzoate sekitar 1. Hitung kadar kafein (C8H10N4O2) dalam sample uji dengan rumus;
2500 C ( Rv / Rs )
PREPARASI SAMPEL
• Sampel harus dalam bentuk larutan.
• Untuk skala analisis sampel dalam µL, konsentrasi sampel yang
diinjeksikan tidak boleh terlalu pekat karena dapat menyumbat kolom.
Konsentrasi maksimal adalah sekitar 40 ppm.
PENYALAAN ALAT
• Sebelum alat dinyalakan, pastikan dalam slang penghubung antara tabung
eluen dengan pompa tidak terdapat gelembung udara. Jika terdapat
gelembung, buka penutup pompa kemudian buka katup slang di ujung
pompa dan sedot secepatnya gelembung tersebut dari slang dengan alat
penyedot gelembung yang tersedia kemudian tutup katup dan tutup pompa
kembali seperti semula.
• Hubungkan kabel alat ke sumber listrik (saklar).
• Nyalakan tombol paling bawah alat HPLC (tombol detektor).
• Nyalakan tombol tengah HPLC (kolom)
• Nyalakan tombol paling atas dari HPLC (pompa)
• Nyalakan tombol power CPU kemudian tombol power pada monitor.
CARA INJEKSI
• Ambil alat injek (syringe).
• Bilas syringe dengan zat yang sama dengan fasa gerak utama (misalnya
metanol)
• Kemudian bilas syringe dengan sampel
• Isi syringe dengan sampel, INGAT dalam syringe yang sudah diisi
tersebut tidak boleh ada ruang kosong oleh udara yang terperangkap atau
gelembung udara
• Volume injeksi maksimum adalah 20 uL karena pada injektor standar
terpasang loop 20 uL
• Masukkan jarum syringe ke injektor, buka injektor (load, putar ke atas),
injek cepat, tutup injektor (inject, putar ke bawah), baru tarik jarum
syringe dari injektor. Di layar segera akan ada tanda biru...Run in progress
data aquasition.........
• Setelah waktu running yang diinginkan habis, tekan tombol F8 untuk
menghentikan runing. Maka komputer akan segera menghitung tinggi
puncak-puncak yang keluar berikut luas puncaknya. Pada proses ini di
layar akan muncul tampilan biru dengan tulisan...”Run in Progress Data
Analysis”.
• Setelah di layar muncul kembali tampilan “Ready” (hijau), maka
pekerjaan selanjutnya dapat dilakukan. Untuk menginjeksikan kembali
sampel lain sebaiknya kolom dicuci terlebih dahulu. Masukkan running
cuci kolom ke dalam file cuci.