Improved liquid-chromatography tandem mass spectrometry method for the

determination of the bioactive dipeptides, carnosine and anserine: Application to

analysis in chicken broth

Prosedur Percobaan

2.1. Bahan kimia dan reagen

Standar CAR (carnosine) dan ANS (anserine) yang dibeli dari Sigma (St Louis, MO,
USA). Larutan stok standar dibuat dengan cara melarutkan masing-masing senyawa
dalam asetonitril / Milli-Q air (75/25, v / v) pada konsentrasi 1000 mg / l dan disimpan
dalam labu gelap pada suhu 4 ° C. Campuran stok standar disiapkan mingguan pada
konsentrasi 50 mg / l. Tabel 1 menunjukkan struktur kimia CAR dan ANS.

Metanol (HPLC grade), asetonitril (HPLC grade), asam asetat semua disediakan oleh
Scharlau Chemie (Sentmenat, Barcelona, Spanyol). Air adalah kualitas Milli-Q (Millipore
Corp, Bedford, MA, USA). Amonium asetat adalah dari Sigma (St Louis, MO, USA), dan
perak nitrat dibeli dari Acros Organics (Geel, Belgia).

2.2. Sampel

Kaldu ayam komersial dipasok oleh Gallina Blanca bintang dengan komposisi sebagai
berikut: air, ayam (0,8%), sayuran dalam proporsi variabel (0,04%) (seperti bawang,
seledri, daun bawang, wortel dan kentang), lemak babi, garam (0,8% ), ekstrak ragi,
penyedap, dan rempah-rempah. Informasi gizi per 100 ml kaldu ayam: energi (20 KJ; 5
Kcal), protein (0,3 g), lemak (0,4 g) dan natrium (0,3 g).

2.3. Strategi pra-perlakuan sampel kaldu

Kaldu ayam pra-perlakuan sebelum analisis kromatografi untuk membersihkan matriks

sampel dengan menghilangkan senyawa yang mengganggu dan garam. 10 ml kaldu
ayam disentrifugasi pada 8163 rpm selama 20 menit pada 4 ° C. Supernatan yang
diperoleh disaring melalui glass wool (Scharlau, Sentmenat, Barcelona), dan kemudian
disaring melalui 0.22 µm nilon (Whatman International Ltd Maidstone, Inggris). Setelah
itu, sampel yang telah disaring kemuadian diencerkan (10 kali lipat atau 100 kali lipat)
dengan 0,2% asam asetat dan dimuat ke kartrid SPE atau μSPE plate, untuk
membandingkan hasil. Pengenceran 100 kali lipat digunakan untuk mempelajari
parameter kualitas metode, dan 10 kali lipat dan 100 kali lipat pengenceran yang
digunakan untuk menerapkan metode, dan hasil yang diperoleh dengan dua pengenceran
diuji dan dibandingkan.

Kartrid SPE yang digunakan adalah OASIS HLB 60 mg (Waters Corp, Milford, MA).
Kartrid ini dikondisikan dengan menambahkan secara berurutan 5 ml metanol dan 5 ml
0,2% asam asetat (pH 3,5). Kemudian, 1 ml hasil pengenceran sampel kaldu ayam
dimuat ke dalam cartridge, dan sampel yang dielusi dikumpulkan. Di sisi lain, μSPE plate
yang digunakan adalah OASIS hidrofilik-lipofilik seimbang (HLB) dikemas dengan 2 mg
sorben (Waters Corp, Milford, MA). Plate ini dikondisikan dengan menambahkan secara
berurutan 250 ml metanol dan 250 ml 0,2% asam asetat (pH 3,5). Kemudian, 350 ml
kaldu ayam yang diencerkan dengan350 ml 0,2% asam asetat yang dimuat ke plate, dan
sampel yang dielusi dikumpulkan. Sampel yang dikumpulkan kemudian diencerkan 2 kali
lipat dengan asetonitril / Milli-Q air (75/25, v / v) larutan, disaring melalui 0,22 µm nilon
dan disuntikkan ke dalam sistem kromatografi.

Kehadiran garam (natrium klorida) sebelum dan sesudah strategi pra-perlakuan sampel
dievaluasi dengan menambahkan perak nitrat. Jika endapan putih (perak klorida) diamati,
itu berarti sampel mengandung garam.

2.4. UPLC-MS / MS

Analisis UPLC CAR dan ANS dalam sampel kaldu pra-perlakuan dilakukan dengan
menggunakan sistem Waters ACQUITY UPLC ™ (Waters, Milford, MA, USA), dilengkapi
dengan sistem Waters biner pompa (Waters, USA). Kolom yang digunakan adalah
ACQUITY UPLC ™ BEH HILIC (100 mm x 2,1 mm id, 1,7 m), juga dari Waters. Fase
gerak adalah 0,65 mM amonium asetat dengan Milli-Q air / asetonitril (25/75, v / v)
sebagai eluen A, dan 4,55 mM amonium asetat dengan Milli-Q air / asetonitril (70/30, v /
v) sebagai eluen B. elusi dimulai pada 5% dari eluen B dan meningkat secara linear
menjadi 11% dari eluen B di 6 menit, meningkat menjadi 100% dari eluen B di 0,1 menit
dan terus isokratik untuk 1,4 menit. Itu kemudian kembali ke kondisi awal di 0,1 menit,
dan waktu reequilibration adalah 1,4 menit. Flow rate adalah 0,4 ml / menit, dan suhu
kolom selama analisis adalah 30 ° C. Volume injeksi adalah 10 µl, dan semua sampel
disaring melalui 0,22 µM nilon (Whatman) sebelum analisis kromatografi.

Sistem UPLC itu digabungkan ke PDA detektor ACQUITY UPLC ™ dan spektrometer
massa TQD ™ (Waters, USA). PDA detektor panjang gelombang yang ditetapkan
sebesar 214 nm. Ionisasi dicapai dengan electrospray (ESI) antarmuka yang beroperasi
di modus positif [M-H] + dan data dikumpulkan dalam reaksi yang dipilih pemantauan
(SRM). Parameter sumber ionisasi adalah tegangan kapiler, 3 kV; suhu sumber, 120 ° C;
cone gas aliran-tingkat, 5 l / h dan desolvation gas flow-rate, 800 l / jam; Suhu desolvation
400 ° C Nitrogen (kemurnian 99,99%, N2LCMS nitrogen generator, Claind, Lenno, Italia)
dan argon (kemurnian ≥99.99%, Aphagaz, Madrid, Spanyol) digunakan sebagai kerucut
(cone) dan tabrakan (collision) gas masing-masing.

Transisi SRM dan tegangan kerucut individu dan energi tabrakan untuk setiap dipeptida
dievaluasi dengan menanamkan 10 mg / l masing-masing senyawa untuk mendapatkan
kondisi terbaik instrumental. Dua transisi SRM dipelajari untuk menemukan ion produk
yang paling melimpah, transisi yang paling sensitif yang dipilih untuk kuantifikasi dan yang
kedua untuk tujuan konfirmasi. Tabel 1 menunjukkan transisi MS / MS untuk kuantifikasi
(dalam huruf tebal) dan konfirmasi, serta tegangan kerucut dan nilai-nilai energi tabrakan
dioptimalkan untuk masing-masing senyawa standar. Waktu tinggal/tunggu ditetapkan
untuk setiap transisi adalah 30 ms, dan perangkat lunak yang digunakan adalah
MassLynx 4.1.

2.5. Parameter kualitas

Parameter kualitas instrumental metode analitis, seperti linearitas, kurva kalibrasi,

pengulangan, ketahanan, batas deteksi (LODs) dan batas kuantifikasi (LOQs) ditentukan
untuk kaldu ayam yang diencerkan (100 kali lipat) dibubuhi konsentrasi senyawa
dipeptida dan diekstraksi menurut prosedur yang dijelaskan dalam Bagian 2.3. Parameter
kualitas tersebut menurut administrasi makanan dan obat (FDA) pedoman [30].

2.6. Analisis statistik

Konsentrasi CAR dan ANS dalam kaldu ayam dianalisis dengan uji ANOVA untuk menilai
efek dari kedua matriks sampel pengenceran (10 kali lipat dan 100 kali lipat), dan sampel
pra-perlakuan yang digunakan (μSPE atau SPE sebagai perangkat format). Sebuah
perbedaan yang signifikan dianggap pada tingkat P <0,05. Semua analisis statistik
dilakukan dengan menggunakan Statgraphics Plus 5.1.
Sumber : Macià et al., 2012
Macià, A., Motilva, M.-J., Romero, M.-P., Labrador, A., Domínguez, A., & Peiro, L. (2012).
Improved liquid-chromatography tandem mass spectrometry method for the
determination of the bioactive dipeptides, carnosine and anserine: application to
analysis in chicken broth. Talanta, 93, 293–300.
http://doi.org/10.1016/j.talanta.2012.02.036
Improved short peptide identification using HILIC-MS/MS: Retention time prediction
model based on the impact of amino acid position in the peptide sequence

2. Bahan dan metode

Definisi dari peptida pendek dapat berbeda dari satu penelitian kelompok ke kelompok
lain. Beberapa penulis mendefinisikan peptida pendek memiliki massa molar <1000 Da,
sedangkan yang lain dijelaskan peptida pendek mempunyai <15-20 residu asam amino
(Petritis et al, 2003; Schweizer et al, 2007; Harscoat-Schiavo et al., 2010, 2012). Pada
penelitian ini identifikasi peptida dengan LC-MS / MS lebih kompleks digunakan pada
peptida pendek yang mempunyai urutan <5 asam amino.

2.1. Bahan kimia, reagen dan sampel

Asetonitril (MeCN), asam trifluoroasetat (TFA) dan air yang semuanya mempunyai grade”
MS” dibeli dari Sigma-Aldrich (St Louis, MO). Dua puluh asam amino utama juga dibeli
dari Sigma- Aldrich. Asam amino dan urutan peptida dijelaskan menggunakan kode
singkatan satu huruf asam amino. Peptida standar (kemurnian P 95% b / b) dijelaskan
pada Tabel 1 dan 2 yang dibeli dari bachem (Bubendorf, Swiss), Thermo Fisher Scientific
(Waltham, MA) atau GenScript (Piscataway, NJ). Peptida ini dipilih berdasarkan
jangkauan hidrofilisitas, ukuran peptida dan urutan nya. Peptida dilarutkan pada
konsentrasi 1 g/l larutan MeCN : Air: TFA (80: 19: 1 v / v / v) sebelum diencerkan dalam
100% MeCN untuk memberikan konsentrasi kerja 0,025 g L1. Fraksi A dibuat dari
hidrolisat protein whey yang disiapkan dengan solid phase extraction (SPE) seperti yang
dijelaskan sebelumnya oleh Nongonierma et al. (2013). Secara singkat yaitu dengan
cara : persiapan protein whey (88,3% b / b protein; 1% b / b lemak; 2,4 w / w abu) yang
dihidrolisis menggunakan enzim pankreas sebelum fraksinasi SPE menggunakan matriks
hidrofobik (StrataX, Phenomenex, Cheshire, UK). Fraksi SPE yang terikat digunakan
untuk memvalidasi model prediksi waktu retensi. Sebelum analisis, setiap sampel harus
disaring melalui 0,20 µm yang dibuat dari penyaring selulosa (VWR International LLC,
Radnor, PA).

2.2. Analisis LC-MS / MS

Sampel dianalisis dengan LC-MS / MS dalam 3 ulangan, menggunakan sistem Water

Acquity Ultra Performance Liquid Chromathography (UPLC) (Waters, Milford, MA)
digabungkan ke MicrOTOF-Q II (quadrupole, time-of-flight) Mass Spetrometer (Bruker
Daltonics GmbH, Bremen, Jerman). Sistem UPLC dilengkapi dengan Detektor UV
ditetapkan pada 214 dan 280 nm. Spektrometer massa dipasang pada sumber ionisasi
electrospray (ESI) yang digunakan dalam modus ion positif. Software Hystar ™ (Bruker
Daltonics GmbH) digunakan untuk mengontrol kedua sistem UPLC dan MS. Peptida
dianalisis dengan cara dielusi dengan menyuntikkan 2 µL setiap sampel ke kolom
ACQUITY BEH Amida (2,1 150 mm,1,7 lm, 130 Å) yang dilengkapi dengan ACQUITY
BEH Amida 1,7 µm pelopor pra-kolom, keduanya produksi Waters. Temperatur kolom
dipertahankan pada 400 C. fase gerak A menggunakan MeCN / H2O / TFA (97: 3: 0,1, v /
v / v) sedangkan fase gerak B adalah MeCN / H2O / TFA menggunakan (40: 60: 0,1, v /
v / v). Garis gradien linier dibuat dari 100% pelarut A ke 50% yang diterapkan selama 120
menit pada flow rate 0,1 mL/min, Kondisi UPLC tersebut digunakan untuk mendapatkan
pemisahan yang optimal dari sampel hidrolisat protein susu kompleks. Pengukuran MS
(mass spectrometer) dilakukan selama 21-600 atau 21-700 m /z acquisition range.
Tandem MS dilakukan dengan menggunakan lima ion prekursor secara otomatis yang
ada dalam MS scan. Data MS diproses di Compass Data Analysis 4.0 SP5 (Bruker
Daltonics).

2.3. Model Prediksi dengan Waktu Retensi

Matlab R2013b (The MathWorks Inc, Natick, MA) digunakan untuk menghasilkan
koefisien hidrofilik masing-masing asam amino dan selanjutnya digunakan untuk
menentukan model prediksi waktu retensi. Training set 153 peptida standar yang
digunakan dalam model ini dijelaskan pada Tabel 1. Koefisien hidrofilik asam amino
ditentukan menggunakan algoritma evolusi genetik dimodifikasi dari (Meek (1980). Secara
singkat yaitu : setiap waktu retensi asam amino digunakan sebagai Koefisien awal
mereka. Koefisien hidrofilik setiap peptida dari training set dihitung sebagai jumlah dari
masing-masing koefisien asam amino tergantung pada posisi urutan nya. Persamaan
regresi linier dibuat untuk memprediksi waktu retensi menggunakan kedua koefisien
hidrofilik peptida atau menggubnakan koefisien hidrofilik peptida dan panjang peptida.
Satu per satu, koefisien asam amino disesuaikan dengan iterasi 0,01 untuk mendapatkan
koefisien korelasi tertinggi (R2) Dari regresi linier.

Model validasi statistik dilakukan untuk menunjukkan keakuratan, kemampuan prediktif,

serta ketahanan nya. Dilakukan perhitungan koefisien korelasi (R2), F statistik,
signifikansi (p-value) dan Nilai statistik uji Durbin-Watson (DW). Model itu juga dievaluasi
dengan menggunakan plot diagnostik seperti jarak Cook serta analisis residual plot
(histogram, probabilitas normal plot, simetri plot, residual terhadap residu tertinggal dan
residual dibandingkan nilai pas). Metode prediksi dibandingkan untuk Efisiensi
menggunakan root mean squared error (RMSE) dari model serta akar berarti kesalahan
kuadrat dari dua cross-validasi, meninggalkan-satu-out dan sepuluh kali lipat lintas-
validasi (RMSECV1 dan RMSECV10, masing-masing). Apabila diperlukan, data dan
model dibandingkan dengan menggunakan Matlab dan analisis satu arah varians
(ANOVA) atau analisis kovarians (ANCOVA), keduanya dilanjutkan dengan Uji
signifikansi beda jujur dengan perbandingan Tukey. Sebuah p-value <0,05 statistik yang
penting.

2.4. Identifikasi peptida pendek dengan LC-MS

Satu set 14 peptida pendek standar yang dijelaskan pada Tabel 2 dan hidrolisat fraksi
whey protein yang digunakan untuk memvalidasi model prediksi waktu retensi. Sebuah
script Matlab digunakan untuk menghasilkan daftar semua urutan peptida yang mungkin
berhubungan dengan target berat molikul (Mw) dengan tingkat error 0,1 Da. Waktu retensi
diprediksi dari peptida potensial kemudian dihitung dan dibandingkan dengan waktu
retensi yang diamati. Pengecualian diberlakukan pada semua peptida dengan perbedaan
waktu > 12 menit antara waktu retensi yang diprediksi dan waktu retensi yang diamati.
Kehadiran peptida potensial dalam susu dicari menggunakan database protein susu sapi
untuk membuang peptida non relevan. Database dibuat dari utama protein susu sapi (β-
laktoglobulin, α-laktalbumin, bovine serum albumin, laktoferin, αs1-, αs2-, β-dan k-kasein)
menggunakan semua varian genetik yang tersedia diberikan dalam PubMed. Secara
paralel, sebuah denovo melakukan pencarian dengan menggunakan Peaks Studio 6.0
(Bioinformatika Solutions Inc, Waterloo, Kanada). Toleransi massa yang ditetapkan pada
0,1 Da untuk kedua MS dan MS / MS. Modifikasi variabel ditetapkan pada natrium adduct,
oksidasi Metionin dan fosforilasi dari Serine, Threonine dan Tyrosine. Semua peptida
potensial diperoleh melalui penggabungan Matlab dan pencarian Peaks dan MS / MS
Spektrum yang dikuatkan menggunakan Compass Data Analysis dan Biotools 3.2 (Bruker
Daltonics).
Sumber : Le Maux et al., 2015
Le Maux, S., Nongonierma, A. B., & FitzGerald, R. J. (2015). Improved short peptide
identification using HILIC-MS/MS: Retention time prediction model based on the
impact of amino acid position in the peptide sequence. Food Chemistry, 173, 847–
54. http://doi.org/10.1016/j.foodchem.2014.10.104
In vitro digestion of Bresaola proteins and release of potential bioactive peptides

2. Bahan dan Metode

Bresaola adalah daging curing tradisional asal italia

2.1. Sampel bresaola dan persiapan ekstrak protein

Garam dan bahan kimia lainnya yang dibeli dari Sigma-Aldrich(St Louis, MO), kecuali di
tempat yang ditentukan. Dua sampel Bresaola, satu dengan label (sampel X) dan satu
tanpa label (sampel Y), dikumpulkan di pasar lokal secara acak, salah satunya berada di
harga lebih tinggi dan yang lainnya di harga yang lebih murah.

2.2. Elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida (SDS-PAGE)

Untuk analisis elektroforesis, baik Bresaola ataupun yang telah dicerna adalah tanah
dengan mincer umum. Sepuluh mililiter air suling adalah ditambahkan ke 5 g Bresaola
daging cincang (dengan mortar) yang dikenakan dua siklus ultraturrax, masing-masing
berlangsung 4 ' (menit) pada kecepatan maksimum. Sampel kemudian disentrifugasi
selama 30 ' (menit) di 11.500 rpm pada suhu 4 ° C, supernatan disaring melalui filter 0,45
µM, direbus selama 10 menit, disentrifugasi selama 20 ' di 11.500 rpm, 4 ° C dan disaring
lagi menggunakan 0,22 µm filter.

Sodium dodesil elektroforesis gel poliakrilamida-sulfat (SDSPAGE) dilakukan pada sistem

terputus terdiri dari acrilamide konsentrasi 4% (w / v) untuk stacking gel dan 12% (b / v)
untuk susun dan running gel, menggunakan sistem Mini-protean III (BioRad Laboratories,
California). Running dilakukan pada 120 V tegangan konstan, dan masing-masing gel di
stain dalam larutan air yang mengandung 0,05% b / v Coomassie Biru R-250, 50% v / v
metanol, 0,7% v / v asetat asam, dan di distained dalam larutan air yang mengandung
10% (v / v) asam asetat dan 40% (v / v) metanol.

237. analisis nanoHPLC-ESI-Q-TOF MS / MS

Peptida Protein dan peptida MW rendah fraksi digesta (aliquot dari 1 mL) dipisahkan
dengan kromatografi eksklusi ukuran, menggunakan prepacked Econo-pac® 10 kolom
DG (Bio-Rad Laboratories, Hercules,CA, USA) dan eluting dengan 50 mM NH4HCO3, pH
7,8. Limbah dipantau oleh absorbansi UV pada 280 nm (Ultrospec 2100 pro, Amersham
Biosciences). Protein (MW N 6000 Da) dan peptida (MW b 6000 Da) fraksi secara
terpisah dikumpulkan. Peptida kolam renang selanjutnya dihilangkan garamnya
menggunakan Sep-Pak ® C18 cartridge pra-dikemas (Waters, Milford, MA, USA) dicuci
dengan air 0,1% TFA (v / v) dan dielusi 70% ACN (v / v) /0.1% TFA (v / v). Nanoflow
HPLC pemisahan dilakukan dengan Ultimate 3000 Sistem nanoHPLC (Dionex,
Sunnydale, CA, USA) yang dilengkapi dengan autosampler. Peptida digesta (~ 2 mg)
yang dimuat ke perangkap C18 cartridge (LC kemasan, Dionex, USA) menggunakan
autosampler Famos (Dionex) dan memerah 5 menit pada laju aliran dari 5 uL / menit
dengan cara pompa pemuatan. Separationwas dilakukan dengan menggunakan kapiler
komersial Kolom (PepMap, C18, 5 m, 300 Å, 75 mm × 15 cm, LC kemasan, Dionex)
menerapkan gradien linier dari 2% sampai 40% dari larutan B lebih 90 menit, setelah 10
menit dari elusi isokratik pada 2% larutan B, pada laju aliran konstan 300 nL / min. Pelarut
A adalah H2O mengandung 0,1% asam format; pelarut B adalah 0,08% asam format di
80% asetonitril (v / v). Dielusi peptideswere dianalisis on-line menggunakan ESI-Q TOF
Q-Star Pulsar Instrumen (Terapan BioSystems, Foster City, CA, USA) yang dilengkapi
dengan nanospray sumber (Protana, Denmark). MS / MS fragmentasi adalah dilakukan
dalam perolehan informasi-dependent (IDA) modus. Pendahulu ion dipilih untuk
fragmentasi menggunakan MS berikut untuk Kriteria beralih MS / MS: ion lebih besar dari
m / z 400,0, biaya negara untuk 24, intensitas melebihi 18 hitungan, mantan ion sasaran
yang dinami dikecualikan untuk 20 s dan ion tolerancewas 50.0mmu. CIDwas digunakan
untuk fragmen beberapa ion bermuatan dan N2 digunakan sebagai gas tabrakan. Mentah
nanoHPLC-MS / MS Data set yang digunakan untuk menghasilkan file teks dalam maskot
format file generik (.mgf). Daftar puncak diserahkan ke Mascot dengan (versi 2.3) mesin
pencari (http://www.matrixscience.com). Nontryptic peptida diidentifikasi juga dengan
bantuan Batch-Tag Alat web Protein Prospector (http://prospector.ucsf.edu), taksonomi
membatasi pencarian ke B. taurus. Identifikasi keluaran peptida telah divalidasi
pemeriksaan bymanual spektrum MS / MS. Entri peptida yang dianggap diidentifikasi
ketika berat molekul yang diukur berhubungan dengan nilai yang diharapkan dan urutan
setidaknya tiga b-berturut-turut atau ion-y terjadi dalam spektrum. Untuk setiap peptida
fraksi, analisis nanoHPLC-MS / MS dijalankan dalam rangkap tiga, dan hanya
pertandingan terjadi di semua tiga analisis yang termasuk dalam daftar entri.

Sumber : Ferranti et al., 2014

Ferranti, P., Nitride, C., Nicolai, M. A., Mamone, G., Picariello, G., Bordoni, A., Capozzi, F.
(2014). In vitro digestion of Bresaola proteins and release of potential bioactive
peptides. Food Research International, 63, 157–169.
http://doi.org/10.1016/j.foodres.2014.02.008